Линейные альфа-1,4-глюканы и способ их получения

Линейные альфа-1,4-глюканы и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к методам рекомбинантных ДНК для получения растений и микроорганизмов, способных к внутри- или внеклеточной экспрессии протеина, обладающего амилосахаразной активностью и катализирующего синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к новым последовательностям ДНК и плазмидам, содержащим указанные последовательности ДНК, которые после интеграции в геном растения или после трансформации в микроорганизмах, в частности в бактериях или в грибах, приводят к экспрессии фермента, катализирующего синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы, а также к трансгенным организмам (т.е. растениям, грибам и микроорганизмам), содержащим вышеуказанные последовательности ДНК.

Линейные α-1,4-глюканы представляют собой полисахариды, состоящие из мономеров глюкозы, причем последние связаны друг с другом исключительно через α-1,4-глюкозидные связи. Наиболее часто встречающимся природным α-1,4-глюканом является амилоза - компонент крахмала растений. В последнее время все большее и большее значение придается коммерческому применению линейных α-1,4-глюканов. Вследствие своих физико-химических свойств амилоза может быть использована для получения бесцветных, не имеющих запаха и вкуса, нетоксичных и биологически разложимых пленок. В настоящее время уже существуют различные возможности применения, например, в пищевой промышленности, текстильной промышленности, в производстве стекловолокна и в производстве бумаги.

Также достигнуты определенные успехи в производстве волокон из амилозы, свойства которых сходны с таковыми природных целлюлозных волокон и которые позволяют частично или даже полностью заменить последние в производстве бумаги.

Являясь наиболее важным представителем линейных α-1,4-глюканов, амилоза, в частности, находит применение в качестве связующего вещества при изготовлении таблеток, в качестве загустителя для пудингов и кремов, в качестве заменителя желатина, в качестве связующего вещества при производстве звукоизолирующих панелей стен и для улучшения текучести низкозастывающих масел.

Другим свойством α-1,4-глюканов, которое недавно привлекло повышенное внимание, является способность их молекул образовывать вещества, включенные в органические комплексные соединения, вследствие их спирального строения. Это свойство позволяет применять α-1,4-глюканы для разнообразных целей. Указанные свойства определяют возможность их применения для молекулярного инкапсулирования витаминов, фармацевтических соединений и ароматических веществ, а также их применения для хроматографического разделения смеси веществ на иммобилизованных линейных α-1,4-глюканах.

Амилоза также служит в качестве исходного материала при получении так называемых циклодекстринов (также называемых циклоамилозами, цикломальтозами), которые в свою очередь находят широкое применение в фармацевтической промышленности, в технологии изготовления пищевых продуктов, при производстве косметики и в технологии аналитического разделения. Указанные циклодекстрины представляют собой циклические мальтолигосахариды, составленные из 6-8 моносахаридных фрагментов и обладающие способностью легко растворяться в воде, но включающие гидрофобные полости, что может использоваться для получения включенных соединений.

В настоящее время линейные α-1,4-глюканы получают в виде амилозы из крахмала. Сам крахмал состоит из двух компонентов. Первым компонентом является амилоза в виде неразветвленной цепи, состоящей из остатков глюкозы, соединенных α-1,4-связями. Другим компонентом является амилопектин, представляющий собой полимер с высокой степенью ветвления, который состоит из остатков глюкозы и в котором кроме α-1,4-связей глюкозные цепи также могут быть разветвлены с помощью α-1,6-связей. Вследствие своего различного строения и обусловленных этим различных физико-химических свойств эти два компонента также находят применение для различных целей. Чтобы иметь возможность непосредственно использовать свойства отдельных компонентов, необходимо получить их в чистом виде. Оба компонента могут быть получены из крахмала, однако этот процесс требует нескольких стадий очистки, занимает много времени и является дорогостоящим.

Следовательно, существует необходимость в получении обоих компонентов крахмала в однородном виде. Для этой цели вырабатывающие крахмал растения изменяли путем селекции или с помощью генной инженерии с целью получить крахмал с измененной пропорцией амилозы/амилопектина. Хотя обычно процентное содержание амилопектина в кукурузном крахмале составляет, например, 70%, с помощью селекции удалось получить сорт кукурузы (восковую кукурузу), крахмал которой состоит практически на 100% из амилопектина (Akatsuka и Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).

Кроме того, путем селекции было получено несколько сортов кукурузы, обладающих повышенным содержанием амилозы (60-70%), например, сорта amylose extender и dull (Wolf и др., 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 1654-1659; Boyer и др., 1976, Die Stärke: 28: 405-410). Для получения сортов, которые синтезируют однородный крахмал в виде амилопектина, использовали другие виды растений, например, рис (Sano, 1984, Theor. Appl. Genet. 68: 467-473) и ячмень (Shannon и Garwood, 1984, в Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Oriando, 2-е изд., 25-86), или таковые, которые синтезируют крахмал с высоким содержанием амилозы (например, различные виды гороха). Помимо указанных выше методик классического скрещивания опубликованы методики, основанные на генетическом воздействии на вырабатывающие крахмал растения.

Например, у Visser и др., (1991, Mol. Gen. Genet. 255: 289-296) говорится, что сорта картофеля, синтезирующие практически чистый амилопектиновый крахмал, могут быть получены путем антисмыслового ингибирования гена, который кодирует крахмал-синтетазу, необходимую для связывания гранул крахмала.

В международной заявке WO 92/14827 описано получение растений картофеля, которые вследствие анитсмыслового ингибирования экспрессии фермента разветвления вырабатывают крахмал с повышенной пропорцией амилозы/аминопектина. Однако растения, описанные в WO 92/14827, не обладают способностью производить крахмал с более высоким содержанием амилозы.

Несмотря на многочисленные попытки и разнообразные подходы до сих пор никому не удалось добиться успеха в получении растений, производящих чистый амилозный крахмал.

Также до сих пор не описаны возможности получения амилозы с высокой степенью чистоты или чистых линейных α-1,4-глюканов с использованием других способов, например, генной инженерией микроорганизмов.

Кроме того, до сих пор не были обнаружены последовательности ДНК, кодирующие ферменты, которые обладали бы способностью катализировать синтез линейных α-1,4-глюканов в растениях, грибах, микроорганизмах или in vitro.

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение последовательностей ДНК и разработка способов, дающих возможность получать растения, грибы и микроорганизмы, способные синтезировать линейные α-1,4-глюканы.

Задачи настоящего изобретения решены посредством различных вариантов выполнения изобретения, представленных в пунктах формулы изобретения.

Следовательно, изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеины, обладающие ферментативной активностью амилосахаразы.

В частности изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеин, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, и к кодирующей ДНК-последовательности, представленной в SEQ ID No.1. Кроме того, настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, гибридизирующимся с вышеуказанными последовательностями по изобретению и кодирующим протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, а также к последовательностям ДНК, которые вследствие генетического кода являются вырожденными по сравнению с вышеуказанными последовательностями ДНК по изобретению.

В этом контексте термин "гибридизация" обозначает гибридизацию в обычных условиях гибридизации, предпочтительно в строгих условиях, таких, как описано, например, у Sambrook и др. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

В другом варианте осуществления изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и получаемым с помощью способа, включающего следующие стадии:

(а) получение библиотеки геномной или кДНК на основе геномной ДНК или мРНК клеток организма;

(б) трансформацию приемлемого хозяина с помощью библиотеки, созданной на стадии (а);

(в) обработку трансформированных клеток парами йода;

(г) выявление клеток, окрашенных в голубой цвет;

(д) выделение и культивирование клеток, выявленных на стадии (г); и

(е) выделение геномной ДНК-вставки или кДНК-вставки из трансформированных клеток.

Приемлемым хозяином, упомянутым в стадии (б), является, например, E.coli.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к последовательностям ДНК, кодирующим амилосахаразу из микроорганизмов, в частности из грамотрицательных микроорганизмов, предпочтительно из бактерий рода Neisseria и наиболее предпочтительно из Neisseria polysaccharea.

Также представляется возможным модифицировать последовательности ДНК по изобретению путем мутации или с помощью последовательности, измененной путем инсерции (вставки), делеции, замещения или рекомбинации с целью изменить определенное свойство протеина, подлежащего экспрессии. Одной из этих модификаций, среди прочего, является делеция сигнальной последовательности, обеспечивающей секрецию фермента, и вставки других сигнальных последовательностей или последовательностей ДНК, кодирующих транзитные пептиды и тем самым влияющих на локализацию экспрессируемого протеина.

Последовательности ДНК по изобретению, в частности последовательность ДНК по изобретению, представленная в SEQ ID No.1, или ее часть, могут применяться для определения, присутствуют ли гомологичные последовательности ДНК в определенных организмах или экспрессируются ими. Для достижения этого образцы ДНК или мРНК конкретного организма гибридизируют с последовательностью ДНК по изобретению в пригодных для этой цели условиях гибридизации в соответствии с обычными способами.

В соответствии со стандартными методиками из генома различных организмов также можно выделять гомологичные последовательности, которые также кодируют амилосахаразы или ферменты, обладающие аналогичными свойствами, используя последовательность ДНК по изобретению. В данном контексте гомология означает идентичность последовательности по крайней мере на 40-60%, предпочтительно более чем на 60%, особенно предпочтительно более чем на 80%, наиболее предпочтительна идентичность последовательности более чем на 95%. Кроме того, гомология означает, что соответствующие последовательности ДНК или кодируемые аминокислотные последовательности являются функционально и/или структурно эквивалентными. Последовательности, которые гомологичны последовательностям по изобретению и которые отличаются от последовательности ДНК или кодируемой аминокислотной последовательности по изобретению по одному или нескольким позициям, являются нормальными вариантами указанной последовательности, представляющими собой модификации, имеющие такую же функцию. Это могут быть варианты, встречающиеся в естественных условиях, такие как последовательности из других организмов, или мутации. Указанные мутации могут возникать естественным путем, или их можно получать с помощью специфичного мутагенеза. Кроме того, эти варианты могут быть последовательностями, полученными синтетическим путем. Все эти последовательности ДНК равным образом подпадают под объем изобретения.

Протеины, кодируемые различными вариантами последовательности ДНК по изобретению, обладают общими специфичными характеристиками, такими как ферментативная активность, иммунологическая реактивность, конформация и т.д., а также физическими свойствами, такими как электрофоретическая подвижность, хроматографическое свойства, коэффициент седиментации, растворимость, спектроскопические свойства, стабильность и т.д.

Чтобы выявить родственные последовательности ДНК, должны быть получены библиотеки генов организма, подлежащего исследованию, которые являются характерными для присущих организму генов, или генов, полученных в результате экспрессии в организме или в определенной ткани организма. К первому из вышеуказанных типов относятся геномные библиотеки, к последнему относятся библиотеки кДНК.

Идентификацию и выделение гомологичных последовательностей ДНК из таких библиотек осуществляют путем гибридизации в соответствии со стандартными методиками (см., например, у Sambrook и др., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Hatbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

В качестве гибридизирующего зонда могут быть использованы молекулы ДНК, которые имеют точно такую же или практически такую же последовательность ДНК, как и последовательность, представленная в SEQ ID No.1, или часть указанной последовательности. Фрагменты ДНК, используемые в качестве гибридизирующих зондов, также могут представлять собой синтетические фрагменты ДНК, которые были получены в соответствии с обычными методами синтеза ДНК и являются практически идентичными последовательности по изобретению. После идентификации и выделения генов, гибридизирующих с последовательностью ДНК по изобретению, необходимо определить последовательность и проанализировать свойства протеинов, кодируемых указанной последовательностью.

Амилосахараза (также обозначаемая как сахараза: α-1,4-глюкан-4-α-глюкозилтрансфераза, К.Ф. 2.4.1.4.) представляет собой фермент, для которого предложена следующая реакционная схема:

сахараза + (α-1,4-D-глюкозил)_n --->

D-фруктоза + (α-1,4-D-глюкозил)_n+1

Эта реакция представляет собой реакцию трансглюкозилирования. Продуктами этой реакции являются линейные α-1,4-глюканы и фруктоза. Кофакторы при этом не требуются. До сих пор амилосахаразная активность была обнаружена только у нескольких видов бактерий, в частности у видов рода Neisseria (MacKenzie и др., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362), а фермент был оценен только с точки зрения его ферментативной активности. По данным Okada и др. частично очищенный фермент из Neisseria perflava после добавления сахарозы приводит к синтезу гликогенподобных полисахаридов, которые являются слабо разветвленными (Okada и др., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135). Аналогично этому синтезируемые внутри- или внеклеточно глюканы Neisseria perflava и Neisseria polysaccharea обладают определенной степенью разветвленности (Riou и др., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911). До настоящего времени остается неясным, получаются ли эти разветвления вследствие действия амилосахаразы или благодаря другому ферменту, присутствующему в препаратах очищенной амилосахаразы в качестве примеси. Поскольку фермент, вызывающий разветвление, до сих пор не выявлен, предполагают, что амилосахараза катализирует как реакцию полимеризации, так и реакцию разветвления (Okada и др., 1974, J. Biol. Chem. 249: 126-135).

Фермент, который экспрессируют присущим ему образом в Neisseria, является особенно стабильным, очень сильно связывается с продуктами полимеризации и конкурентно ингибируется продуктом фруктозой (MacKenzie и др., 1978, Can. J. Microbiol. 24: 357-362). Вид Neisseria, а именно Neisseria polysaccharea, секретирует амилосахаразу (Riou и др., 1986, Can. J. Microbiol. 32: 909-911), в то время как у другого вида Neisseria она сохраняется в клетке.

Ферменты, обладающие амилосахаразной активностью, могут быть обнаружены только в микроорганизмах. Растения, имеющие амилосахаразы, не известны.

В соответствии с изобретением можно показать, что продуктом реакции, катализируемой амилосахаразой, являются линейные α-1,4-глюканы, которые не являются разветвленными, как это предполагалось до сих пор (см. выше).

Обнаружение ферментативной активности амилосахаразы может быть осуществлено путем обнаружения синтезированных глюканов, как описано ниже в примере 3. Обнаружение обычно осуществляют, используя окрашивание йодом. Бактериальные колонии, экспрессирующие амилосахаразу, можно идентифицировать с помощью, например, обработки парами йода. Колонии, синтезирующие линейные α-1,4-глюканы, окрашиваются в голубой цвет.

Ферментативная активность очищенного фермента может быть обнаружена, например, на содержащих сахарозу агарозных пластинках. Если протеин наносят на такую пластинку и инкубируют в течение 1 ч или более при 37°С, он диффундирует в агарозу и катализирует синтез линейных глюканов. Последние могут быть обнаружены при обработке парами йода. Кроме того, протеин может быть обнаружен в нативных полиакриламидных гелях. После электрофореза в нативном полиакриламидном геле гель уравновешивают в натрий-цитратном буфере (50 мМ, рН 6,5) и инкубируют в течение ночи в растворе сахарозы (5%-ной в натрий-цитратном буфере). Если гель после этого окрашивают раствором Люголя, то зоны, в которых локализованы протеины, обладающие амилосахаразной активностью, окрашиваются в голубой цвет вследствие синтеза линейных α-1,4-глюканов.

С помощью последовательностей ДНК по изобретению можно получить растения, способные производить чистый амилозный крахмал, т.е. линейные α-1,4-глюканы, и модифицировать вырабатывающие крахмал растения таким образом, чтобы они имели более высокое содержание крахмала и в то же время увеличенную пропорцию амилозы/амилопектина. Последовательности ДНК по изобретению могут применяться для получения микроорганизмов и грибов, в частности дрожжей, способных производить фермент, катализирующий синтез линейных α-1,4-глюканов из сахарозы.

Кроме того, с помощью последовательностей ДНК по изобретению или кодируемых ими протеинов при небольших затратах на производство можно получать чистый фруктозный сироп.

Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, таким как векторы, в частности плазмиды, содержащие последовательности ДНК по изобретению или их части, например, плазмида pNB2, которая была депонирована под каталожным номером DSM No. 9196. В частности изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, в которых последовательность ДНК по изобретению сцепляют с последовательностями, обеспечивающими экспрессию протеина, обладающего амилосахаразной активностью, в микроорганизмах, грибах или растениях, например, к плазмидам, содержащим следующие последовательности ДНК:

(а) соответствующий промотор, активный в микроорганизмах и обеспечивающий транскрипцию кодирующей последовательности в микроорганизмах в прямом направлении от него, и

(б) последовательность ДНК, кодирующая полипептид, обладающий амилосахаразной активностью и сцепленный с промотором таким образом, чтобы обеспечить образование транслируемой РНК в полипептиде, или к плазмидам, содержащим следующие последовательности ДНК:

(а) соответствующий промотор, активный в растениях, обеспечивающий транксрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении от него в соответствующее время или на соответствующей стадии развития трансгенного растения или в определенных тканях трансгенного растения, и

(б) последовательность ДНК, кодирующую полипептид, обладающий амилосахаразной активностью и сцепленный с промотором таким образом, чтобы обеспечить образование транслируемой РНК в полипептиде.

Кроме того, предметом изобретения являются микроорганизмы, грибы и растения, содержащие рекомбинантые молекулы ДНК по изобретению.

Еще одним предметом изобретения являются обладающие ферментативной активностью амилосахаразы протеины, которые кодируются одной из последовательностей ДНК по изобретению, в частности таковые, имеющие происхождение из микроорганизмов, предпочтительно из грамотрицательных микроорганизмов, в частности рода Neisseria и наиболее предпочтительно из Neisseria polysaccharea. Кроме того, предметом изобретения являются амилосахаразы, имеющие по данным гель-электрофореза молекулярную массу 63±20 кДа, предпочтительно 63±15 кДа и наиболее предпочтительно 63 ±10 кДа.

Далее предметом изобретения являются конкретные протеины, которые обладают ферментативной активностью амилосахаразы и аминокислотная последовательность которых представлена в SEQ ID No.1. Кроме того, изобретение относится к протеинам, имеющим аминокислотные последовательности, которые практически идентичны аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.1, или которые отличаются от указанной последовательности по одной или нескольким позициям. Эти отличия предпочтительно представляют собой обмены консервативными аминокислотами, так что протеин обладает ферментативной активностью амилосахаразы. Таким образом, изобретение также относится к амилосахаразам, аминокислотная последовательность которых имеет высокую гомологичность аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID No.1, в частности гомологичность по крайней мере на 70%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90%, особенно предпочтительна гомологичность по крайней мере на 99%.

Кроме того, один из вариантов выполнения изобретения относится к применению последовательности ДНК по изобретению и молекул ДНК, в частности плазмид, содержащих указанные последовательности ДНК, для трансформации клеток прокариот или эукариот, а также для экспрессии амилосахаразы в клетках прокариот или эукариот, а также к способу получения протеинов по изобретению путем выращивания в соответствующей питательной среде микроорганизма, содержащего рекомбинантную молекулу ДНК по изобретению.

В частности предметом настоящего изобретения является способ получения растений, которые способны синтезировать линейные α-1,4-глюканы, характеризующийся введением в клетки растения последовательности ДНК по изобретению, содержащей область, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, и сцепленную с последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию в клетках растений и регенерацию целых растений из трансформированных клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения растительных клеток и растений, способных синтезировать линейные α-1,4-глюканы, включающему следующие стадии:

(а) получение полигенного экспрессирующего кластера, имеющего следующие частичные последовательности:

(I) промотор, активный в растениях и обеспечивающий образование РНК в соответствующей ткани-мишени или в клетках-мишенях;

(II) по крайней мере одну последовательность ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы и слитую с промотором в смысловой ориентации;

(III) функционирующий в растениях сигнал для прекращения транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК;

(б) перенос полигенного экспрессирующего кластера в клетки растений; и

(в) регенерацию целых интактных растений из трансформированных растительных клеток.

Пригодными для этой цели промоторами являются такие промоторы, которые обеспечивают конститутивную экспрессию гена во всех тканях растений, такие как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), a также таковые, которые обеспечивают экспрессию только в определенных органах или только на определенных стадиях развития растения. Известны промоторы, обеспечивающие специфичную экспрессию в клубнях растений картофеля, такие как промотор В33 (Liu и др., 1990, Mol. Gen. Genet. 223: 401-406), или таковые, которые обеспечивают специфичную экспрессию в корнеплодах сахарной свеклы. Кроме того, в литературе описаны последовательности ДНК, обеспечивающие зависящую от света и тканеспецифичную экспрессию в клетках листьев последовательностей ДНК, расположенных ниже по ходу транскрипции (Orozco и Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138).

Последовательность ДНК, указанная в пункте (II) на стадии (а) процесса по существу может представлять собой любую последовательность ДНК, содержащую кодирующую область, которая кодирует протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы. Пригодные для этой цели последовательности ДНК, в частности, представляют собой последовательности ДНК, имеющие происхождение из микроорганизмов, предпочтительно из грамотрицательных микроорганизмов, прежде всего из бактерий рода Neisseria и в частности из Neisseria polysaccharea.

Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению включает применение последовательностей ДНК, кодирующих протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы, причем протеин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, или аминокислотную последовательность, практически идентичную таковой.

Предпочтительно применять последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологичности последовательности ДНК, представленной в SEQ ID No.1, и кодирующие амилосахаразу. Также могут применяться последовательности ДНК, которые могут быть получены из указанных последовательностей путем замещения, инсерции или делеции, в том случае, если не ухудшена их ферментативная активность.

Особенно предпочтительный вариант осуществления способа относится к применению последовательности ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID No.1, или ее части, при условии, что длина этих частей достаточна для того, чтобы кодировать протеин, обладающий ферментативной активностью амилосахаразы.

В соответствии с изобретением последовательность ДНК, кодирующую амилосахаразу, сцепляют в смысловой ориентации с промотором (3'-конец промотора с 5'-концом кодирующей последовательности). Указанная последовательность может быть модифицирована до или после сцепления с элементами, контролирующими транскрипцию (промотором и сигналом окончания транскрипции), чтобы изменять при необходимости свойства полипептида или его локализацию, как это более подробно описано ниже. Последовательность ДНК, представленная в SEQ ID No.1, например, кодирует внеклеточную амилосахаразу. Секреция обеспечивается сигнальной последовательностью, включающей 16 N-концевых остатков аминокислот, кодируемых нуклеотидами с 939 по 986 последовательности, представленной в SEQ ID No.1. Поскольку такие сигнальные последовательности прокариот обычно приводят к секреции протеина также и в растительных клетках, экспрессируемый протеин транспортируют в апопласт растения, когда используют последовательность, представленную в SEQ ID No.1.

Для осуществления экспрессии фермента в цитозоле растительных клеток сигнальная последовательность, оказывающая воздействие на секрецию, должна быть удалена. Если фермент, подлежащий экспрессии должен быть связан с определенными внутренними компартменами, такими как хлоропласты, амилопласты, митохондрии или вакуоли, сигнальная последовательность, оказывающая воздействие на секрецию, должна быть заменена на сигнальную последовательность или на последовательность, кодирующую транзитный пептид, который обеспечивает транспорт экспрессируемого протеина к соответствующему компартменту. Подобные последовательности известны. Для транспорта в пластиды, например, пригодны транзитные пептиды пептидов-предшественников малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы (рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза/оксигеназа RUBISCO) из картофеля (Wolter и др., 1988, Proc. Acad. Sci. USA 85: 846-850) или протеин-носитель ацила (АСР). Для транспорта в вакуооли, например, может быть использована сигнальная последовательность пататина (Sonnewald и др., 1991, Plant' J. 1: 95-106). Применяемые последовательности должны быть слиты в матрице с последовательностью ДНК, кодирующей фермент.

Перенос полигенного экспрессирующего кластера, сконструированного на стадии (а) способа, в растительные клетки предпочтительно осуществляют с использованием плазмид, например бинарных плазмид.

Предпочтительно использовать методики, гарантирующие стабильную интеграцию полигенного экспрессирующего кластера в геном трансформированной растительной клетки.

Способ по изобретению в основном может быть применен к любым видам растений. Интерес представляют как однодольные, так и двудольные растения. Методики трансформации были описаны ранее для различных видов однодольных и двудольных растений.

Последовательности ДНК по изобретению дают возможность модифицировать растения так, что они экспрессируют протеины, обладающие ферментативной активностью амилосахаразы, позволяя тем самым осуществлять в растениях синтез линейных α-1,4-глюканов. Поскольку α-1,4-глюканы с точки зрения их строения идентичны синтезируемой в растениях амилозе, то возможно получать растения, которые синтезируют чистую амилозу, и модифицировать растения, вырабатывающие крахмал, таким образом, чтобы они синтезировали крахмал с более высокой пропорцией амилозы.

В большинстве растений продукты, образовавшиеся в результате поглощения света в процессе фотосинтеза, транспортируются по растению к соответствующим органам-мишеням в виде сахаров, более конкретно в основном в виде сахарозы. Поскольку субстратом для реакции полимеризации амилосахаразы является сахароза, указанный выше способ главным образом дает возможность модифицировать в отношении экспрессии амилосахаразы все растения, как двудольные, так и однодольные. Предпочтительными являются культурные растения, такие как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, картофель или маниок, а также определенные виды фруктовых и овощных культур, в том числе яблоневые, сливы, морковь или томаты.

Экспрессия амилосахаразной активности в растениях может, среди прочего, применяться для изменения в результате синтеза линейных α-1,4-глюканов вязкости получаемых из растений экстрактов. В этой связи интерес представляют томаты. В результате экспрессии амилосахаразы в плодах томатов происходит синтез линейных α-1,4-глюканов, что приводит к увеличению вязкости экстрактов, получаемых из этих плодов.

Экспрессия амилосахаразы, кроме того, особенно целесообразна в тех органах растений, в которых запасается большое количество сахарозы. Такими органами являются, например, корнеплод сахарной свеклы или стебель сахарного тростника. Поскольку эти растения в норме не синтезируют какое-либо заметное количество крахмала, из этих растений могут быть выделены в чистом виде синтезируемые амилозой α-1,4-глюканы.

Местом биосинтеза сахарозы в растительных клетках является цитозоль. Однако местом ее запасания является вакуоль. В процессе транспорта к запасающей ткани сахарной свеклы или картофеля или в процессе транспорта в эндосперм семян сахароза должна пройти через апопласт. Следовательно, все три компартмента клетки, т.е. цитозоль, вакуоль и апопласт, могут рассматриваться как пригодные для экспрессии амилосахаразы при синтезе линейных глюканов.

В растениях, вырабатывающих крахмал, таких как картофель или кукуруза, у которых синтез крахмала и накопление крахмала обычно происходит в амилопластах, экспрессия амилосахаразы в апопласте, цитозоле или в вакуоли должна привести к дополнительному синтезу глюканов в этих компартментах, что означает значительное увеличение полезной продуктивности.

Поскольку картофель в процессе выделения крахмала дает возможность отделить крахмал, синтезированный в амилопластах, от линейных α-1,4-глюканов, синтезированных с помощью амилосахаразы в апопласте, в цитозоле или в вакуоли, одно и то же растение может использоваться для получения как крахмала, так и линейных α-1,4-глюканов.

Кроме того, известны трансгенные растения картофеля и растения кукурузы, в которых путем ингибирования АДФ-глюкозопирофосфорилазы с помощью антисмыловой конструкции полностью подавляют синтез крахмала в клубнях и зернах соответственно. Вместо этого, например, у картофеля в клубнях аккумулируются растворимые сахара, в частности сахароза и глюкоза (Müller-Röber и др., 1992, EMBO J. 11: 1229-1238; ЕР-А-0455316). С помощью экспрессии амилосахаразы в цитозоле, вакуоли или апопласте этих растений, т.е. в компартментах, в которых отсутствуют разветвленные ферменты, можно достигнуть синтеза крахмала с высоким содержанием амилозы, т.е. крахмала, состоящего в основном из линейных α-1,4-глюканов. Механизм реакции, которая катализируется амилосахаразой, характеризуется тем, что остаток глюкозы непосредственно переносится от сахаразы к линейному глюкану. В процессе биосинтеза линейных глюканов из сахарозы в растениях сахароза сначала разлагается на глюкозу и фруктозу, которые в свою очередь превращаются в активированную промежуточную форму АДФ-глюкозы. Остаток глюкозы из АДФ-глюкозы с помощью фермента синтеза крахмала переносится к уже существующему глюкану, высвобождаяя при этом АДФ. Превращение сахарозы в две молекулы АДФ-глюкозы происходит в несколько стадий с поглощением энергии.

Следовательно, энергетический баланс реакции, катализируемой амилосахаразой, значительно лучше энергетического баланса синтеза сахарозы из амилозы в растительных клетках, что приводит к увеличению выхода синтезированных глюканов в растениях, экспрессирующих амилосахаразную активность.

Известно много клонирующих векторов, содержащих в доступной форме сигнал репликации для E.coli и ген-маркер для отбора трасформированных бактериальных клеток, которые могут применяться для достижения интродукции чужеродных генов в высшие растения. Примерами таких векторов являются pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184 и т.д. Требуемая последовательность может быть интродуцирована в вектор в соответствующем сайте рестрикции. Полученную плазмиду применяют для трансформации клеток E.coli. Трансформированные клетки E.coli культивируют в соответствующей среде и затем собирают и подвергают лизису. Плазмиду регенерируют. Методами анализа, обычно применяемыми для характеризации получаемых плазмид ДНК, являются рестрикционный анализ, гель-электрофорез, реакции секвенирования и другие способы, известные в биохимии и молекулярной биологии. После каждой операции ДНК плазмиды может быть расщеплена и сцеплена с другими последовательностями ДНК. Каждая последовательность плазмидной ДНК может быть клонирована в такой же или в других плазмидах.

Для интродукции ДНК в растительную клетку-хозяина пригодны многочисленные методики. Эти методики включают трансформацию растительных клеток с помощью Т-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующих агентов, слияние протопластов, инъекцию, электропорацию ДНК, интродукцию ДНК биобаллистическим методом, а также другие возможные методики. В зависимости от способа интродукции требуемых генов в растительные клетки могут быть необходимы другие последовательности ДНК. Если, например, для трансформации растительных клеток применяют Ti- или Ri-плазмиду, то по крайней мере правая пограничная последовательность, хотя часто и правая, и левая пограничная последовательность Т-ДНК Ti- или Ri-плазмид должны быть сцеплены с генами, подлежащими интродукции в качестве фланкирующей области.

Если для трансформации применяют Agrobacteria, то интродукцируемую ДНК необходимо клонировать в специальных плазмидах, т.е. либо в промежуточном векторе, либо в бинарном векторе. Промежуточные векторы могут быть интегрированы в Ti- или Ri-плазмиду Agrobacteria путем гомологичной рекомбинации, поскольку их последовательности гомологичны последовательностям Т-ДНК. Промежуточные векторы не способны реплицироваться в Agrobacteria. Промежуточный вектор может быть перенесен в Agrobacterium tumefaciens с использованием плазмиды-хелпера (конъюгация). Бинарные векторы способны реплицироваться как в E.coli, так и в Agrobacteria. Они содержат ген-маркер селекции и линкер или полилинкер, которые ограничены справа и слева пограничными областями Т-ДНК. Они могут быть непосредственно трансформированы в Agrobacteria (Holsters и др., 1978, Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Agrobacterium, которая служит в качестве клетки-хозяина, может содержать плазмиду, несущую vir-область. vir-Область необходима для переноса Т-ДНК в клетку растения. В ней может присутствовать дополнительная Т-ДНК. Трансформированную таким образом Agrobacterium используют для трансформации растительных клеток.

Применение Т-ДНК для трансформации раститель