Способ получения водной жидкости, содержащей фитазу, водная жидкость, содержащая фитазу, способ получения гранулированного материала, содержащего фитазу, содержащий фитазу гранулированный материал, гранулированный материал, корм для животных, премикс или полуфабрикат корма для животных, способ его получения, способ стимуляции роста животного

Способ получения водной жидкости, содержащей фитазу, водная жидкость, содержащая фитазу, способ получения гранулированного материала, содержащего фитазу, содержащий фитазу гранулированный материал, гранулированный материал, корм для животных, премикс или полуфабрикат корма для животных, способ его получения, способ стимуляции роста животного

Реферат

Настоящее изобретение относится к пищевой промышленности, более конкретно к способу получения водной жидкости, содержащей фитазу, способу получения гранулированного материала, содержащего фитазу, корму для животных, премиксу или полуфабрикату корма для животных, способу его получения и способу стимуляции роста животных.

Применение различных ферментов, таких как фитазы, в корме для животного, например для крупного рогатого скота, становится более обычным. Эти ферменты включают для того, чтобы улучшить питание или всасывание животным солей из корма, и они могут также помочь перевариванию корма.

Они обычно продуцируются культивируемыми микроорганизмами в больших ферментерах при промышленном производстве ферментов. В конце ферментации результирующий бульон обычно подвергают нескольким стадиям фильтрования для отделения биомассы (микроорганизмов) от желаемого фермента (остающегося в растворе). Раствор фермента продается затем либо в виде жидкости (часто после добавления различных стабилизаторов), либо доводится до сухого состава.

Жидкие и сухие составы из ферментов применяют в промышленном масштабе в производстве кормов для животных. Жидкие составы можно добавлять к пище после брикетирования для того, чтобы избежать тепловой инактивации фермента, которая должна наступить в процессе брикетирования.

Сухие составы обычно связаны с брикетированием под паром, когда корм подвергают воздействию пара перед брикетированием. На последующей стадии брикетирования корм продавливают через фильеру или матрицу и полученные полоски режут на подходящие гранулы варьирующей длины. В течение этого процесса температура может повышаться до 60-95°С.

Фитазы являются ферментами, которые (по меньшей мере, частично) гидролизуют фитат (Смиоинозитгексакисфосфат) до миоинозита и неорганического фосфата. Эти ферменты найдены в пшеничных отрубях, семенах растений, кишечнике животных и могут продуцироваться микроорганизмами. Фитазы включают в корма для животных, потому что, поскольку они способны разрушать фитат, они могут увеличивать доступность фосфора и других питательных компонентов для животного. Фитазы могут также увеличивать всасывание кальция.

Фосфор является элементом, необходимым для роста организмов. В корм для крупного рогатого скота обычно добавляют неорганический фосфор для того, чтобы вызвать хороший рост животных с однокамерным желудком. Однако для этого часто нет необходимости в кормовых продуктах жвачных, потому что микроорганизмы, присутствующие в рубце, продуцируют ферменты, которые катализируют превращение фитата в инозит и неорганический фосфат. Разрушение фитата часто является желательным, потому что фитиновая кислота может препятствовать полноценному питанию, поскольку она хелатирует полезные неорганические элементы, такие как кальций, цинк, магний и железо, и может также нежелательным образом взаимодействовать с белками, снижая в результате этого их биологическую доступность для животного. Добавление фитазы может также снизить количество неорганического корма, который необходимо добавлять, и, таким образом, меньше фосфора будет экскретироваться с навозом, что благоприятно для окружающей среды.

Гены различных фитазных ферментов клонированы и экспрессированы. Заявка ЕР-А-0420358 (Gist-Brocades) описывает экспрессию микробных фитаз.

В более поздней заявке ЕР-А-0684313 (Hoffmann-LaRoche) описываются последовательности ДНК, кодирующие различные полипептиды, имеющие фитазную активность.

Заявка ЕР-А-0758018 (Gist-Brocades) указывает на способы улучшения стабильности ферментов, особенно при употреблении в качестве корма для животных, и ссылается на фитазы.

Заявка WO-A-94/03612 (AIko) описывает получение ферментов, разрушающих фитазу, из Trichoderma, в то время как заявка WO-A-97/16076 (Novo-Nordisk) описывает содержащие фермент препараты для применения в производстве кормов для животных, включающих различные гидрофобные вещества.

Корма для животных представляют собой одну из самых дорогих составляющих в содержании крупного рогатого скота и других животных. Кроме того, добавки, такие как ферменты, подобные фитазе, могут значительно увеличивать стоимость корма для животных.

Ближайшим аналогом изобретения является заявка ЕР 0420358 А1, в которой описывается способ получения водной жидкости, содержащей фитазу, включающий культивирование в водной среде, содержащей источник углерода и азота, микроорганизма рода Aspergillus, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген фитазы указанного микроорганизма, соединенный с промоторной и/или сигнальной последовательностью гена амилоглюкозидазы, в условиях, позволяющих экспрессироваться рекомбинантной фитазе, фильтрацию и ультрафильтрацию с последующей катионообменной хроматографией и повторную ультрафильтрацию с последующей аминообменной хроматографией с получением водной жидкости, содержащей фитазу с активностью примерно 40-50 ед/мг белка, которую можно дальше повышать до 100 ед/мг за счет дополнительной двустадийной очистки.

Задачей изобретения является предоставление фитазы с более высокой активностью при одновременном снижении затрат на ее получение. Кроме того, фитаза должна иметь высокую устойчивость к нагреванию, что имеет большое значение в производстве корма для животных.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения водной жидкости, содержащей фитазу, включающим культивирование в водной среде, содержащей источник углерода и азота, микроорганизма рода Aspergillus, трансформированного вектором экспрессии, содержащим ген фитазы указанного микроорганизма, соединенный с промоторной и/или сигнальной последовательностью гена амилоглюкозидазы, в условиях, позволяющих экспрессироваться рекомбинантной фитазе, фильтрацию, ультрафильтрацию, катионообменную хроматографию и анионообменную хроматографию, за счет того, что катионообменную хроматографию осуществляют после фильтрации, а ультрафильтрацию осуществляют после анионообменной хроматографии с получением водной жидкости, содержащей фитазу с активностью, по меньшей мере, 14000 ед/г.

Катионообменную хроматографию предпочтительно осуществляют в две стадии, при этом первую стадию проводят при рН 4,9, а вторую стадию - при рН 3,8, а анионообменную хроматографию предпочтительно проводят при рН 6,3.

В качестве микроорганизма вида Aspergillus предпочтительно применяют Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. Наиболее предпочитаемым микроорганизмом является Aspergillus niger.

Усваиваемый источник углерода может включать глюкозу и/или мальтодекстрин, и/или усваиваемый источник азота может включать ионы аммония. Глюкоза и ионы аммония могут быть только усваиваемыми источниками углерода и азота в водной среде. То есть предполагается, что не применяется никаких комплексных источников углерода или азота. Ионы аммония могут быть либо в виде аммиака, либо в виде аммонийной соли. Предпочитаемые соли аммония включают нитрат аммония, сульфат аммония и фосфат аммония.

Предпочтительно, чтобы источник углерода и/или азота добавляли в культуральную среду в течение процесса ферментации. Скорость добавления любого источника может быть по существу той же самой, с которой он потребляется микроорганизмами. Таким образом, источник углерода и/или азота может вводиться непрерывно или периодически. Источники углерода и азота могут подаваться раздельно или совместно.

Микроорганизм может обладать множественными копиями гена фитазы. Обнаружено, что это увеличивает уровни продукции фитазы, потому что больше генов фитазы экспрессируется.

Получаемая предлагаемым способом водная жидкость в основном свободна от такаамилазы.

В способе согласно изобретению предпочтительно, чтобы преимущественно все источники углерода и/или азота были усвоены микроорганизмами перед началом фильтрации. Это может быть достигнуто, если ферментация будет продолжаться в течение некоторого времени после поступления последней порции источников углерода и/или азота. Альтернативно, можно продолжить ферментацию после той стадии, когда были добавлены все источники углерода и/или азота. Преимущества этого способа, как будет очевидно, заключаются в том, что водная жидкость может быть преимущественно свободной от источников углерода и/или азота (например, глюкозы и/или ионов аммония). Также это может сделать более чистой водную жидкость, которая может содержать меньше побочных продуктов. Путем снижения количества побочных продуктов можно свести к минимуму число стадий обработки, требуемых для возможности либо использовать водную жидкость, либо для возможности получить желаемую высокую активность фитазы.

Полученную содержащую фитазу водную жидкость можно применять для разнообразных целей, в частности в производстве корма для животных. Поэтому дальнейшими объектами изобретения являются гранулированный материал, предназначенный в качестве добавки к корму для животных, включающий сухие гранулы, образованные из водной жидкости, содержащей фитазу, выделенную из гриба Aspergillus и твердого носителя, содержащего, по меньшей мере, 15% (вес/вес) съедобного углеводного полимера, и корм для животных, премикс или полуфабрикат корма для животных, содержащий ингредиенты из группы, включающей белки, углеводы, жиры, витамины, микроэлементы и их смеси, и указанный гранулированный материал.

Дополнительными объектами изобретения являются гранулированный материал, предназначенный в качестве добавки к корму для животных, включающий сухие гранулы, образованные из вышеописанной водной жидкости, содержащей фитазу с вышеуказанной активностью, выделенную из гриба Aspergillus, и твердого носителя, содержащего, по меньшей мере, 15% (вес/вес) съедобного углеводного полимера, корм для животных, премикс или полуфабрикат корма для животных, содержащий ингредиенты из группы, включающей белки, углеводы, жиры, витамины, микроэлементы и их смеси, и вышеуказанный гранулированный материал, способ получения вышеуказанного гранулированного материала, включающий контактирование твердого носителя, содержащего, по меньшей мере, 15% (вес/вес) съедобного углеводного полимера, с водной жидкостью, содержащей фитазу, получаемую предлагаемым способом, и механическую обработку полученной смеси для получения гранул с последующей сушкой последних, и способ получения вышеуказанного корма для животных, премикса или полуфабриката корма для животных, включающий смешивание гранулированного материала, содержащего фитазу, и, по меньшей мере, 15% (вес/вес) съедобного углеводного полимера, по меньшей мере, с одним ингредиентом корма для животных, премикса или полуфабриката корма для животных и при необходимости обработку полученной смеси паром, брикетирование и сушку.

Способ получения гранулированного материала и способ получения корма для животных, премикса или полуфабриката корма для животных широко известны, например, из заявки ЕР 0257996 А2.

"Фитаза" в рамках данного изобретения обозначает не только естественно присутствующие фитазные ферменты, но любой фермент, который обладает фитазной активностью, например способностью катализировать реакцию, включающую удаление или высвобождение неорганического фосфора (фосфата) из фосфатов миоинозита. Предпочтительно, чтобы фитаза принадлежала к классу ЕС 3.1.3.8. Предпочтительно, чтобы фитаза сама по себе являлась фитазой грибов из вида Aspergillus.

Используемый в способе получения гранулированного материала твердый носитель может быть в форме частиц или в форме порошка. Содержащую фитазу водную жидкость, такую как раствор или кашица, можно смешивать с твердым носителем и давать абсорбироваться на носителе. В течение или после смешивания содержащую фитазу жидкость и носитель перерабатывают в гранулированный материал, который можно затем последовательно высушивать. Применение углеводного носителя может позволить абсорбироваться большому количеству композиции (и, следовательно, фитазе). Смесь можно применять для формирования пластичных паст или неэластичного теста, которое легко может быть переработано в гранулы, например, экструзией. Подходящим является неволокнистый носитель, что облегчает проведение гранулирования: волокнистые материалы могут препятствовать грануляции при экструзии.

Съедобный углеводный полимер должен быть выбран так, чтобы он был съедобен для того животного, для которого предназначается корм, и предпочтительно, чтобы он также переваривался. Полимер предпочтительно включает глюкозу (например, глюкозосодержащий полимер) или (С₆Н₁₀О₅)_n звенья. Предпочтительно, чтобы углеводный полимер включал α-D-глюкопиранозные единицы, амилозу (линейный (1->4) полимер α-D-глюкана) и/или амилопектин (разветвленный D-глюкан с α-D-(1->4) и α-D-(1->6) связями). Предпочтительным углеводным полимером является крахмал. Другие подходящие содержащие глюкозу полимеры, которые могут быть применены вместо или в дополнение к крахмалу, включают α-глюканы, β-глюканы, пектин (такой как протопектин) и гликоген. Также охватываются производные этих углеводных полимеров, такие как их простые и/или сложные эфиры, хотя желатинизированного крахмала часто нужно избегать. Подходящим является углеводный полимер, не растворимый в воде.

В описываемых здесь примерах применяют кукурузный, картофельный и рисовый крахмал. Однако равно пригодным является крахмал, полученный из других источников (например, растительных, таких как овощи или сельскохозяйственные культуры), таких как тапиока, кассава, пшеница, маис, саго, рожь, овес, ячмень, яме, сорго или маранта. Сходно в изобретении можно применять как природный, так и модифицированный (например, декстрин) типы крахмала. Предпочтительно, чтобы углевод (например, крахмал) содержал мало или не содержал белка, например менее 5% (вес/вес), например менее 2% (вес/вес), предпочтительно менее 1% (вес/вес).

По меньшей мере, 15% (вес/вес) твердого носителя может составлять углеводный полимер (такой как крахмал). Предпочтительно, однако, чтобы, по меньшей мере, 30% (вес/вес) твердого носителя составлял углевод, оптимально, по меньшей мере, 40% (вес/вес). Выгодно, чтобы основным компонентом твердого носителя был углевод (например, крахмал), например более 50% (вес/вес), предпочтительно, по меньшей мере, 60% (вес/вес), подходит, по меньшей мере, 70% (вес/вес) и оптимально, по меньшей мере, 80% (вес/вес). Эти весовые проценты рассчитаны на основе суммарного веса неферментативных компонентов в конечном сухом гранулированном материале.

Количество содержащей фитазу жидкости, которое может быть абсорбировано на носителе, обычно ограничено количеством воды, которая может быть абсорбирована. Для природного гранулированного крахмала оно может варьировать между 25-30% (вес/вес) без применения повышенных температур (которые вызывают набухание крахмала). На практике процентное количество ферментативной жидкости, добавляемой к углеводу, часто бывает намного больше, чем указанное, потому что содержащая фермент жидкость обычно содержит значительное количество твердых веществ. Раствор фитазы может содержать приблизительно 25% (вес/вес) твердых веществ, в результате чего углевод (например, крахмал) и раствор фитазы могут быть смешаны в отношении углевод: раствор фитазы от 0,5:1 до 2:1, например от 1,2:1 до 1,6:1, что составляет соотношение приблизительно 60% (вес/вес): 40% (вес/вес) соответственно. Предпочтительно, чтобы количество жидкости, добавляемой к твердому носителю, было таким, чтобы преимущественно вся вода в (водной) жидкости абсорбировалась углеводом, присутствующим в твердом носителе.

При повышенных температурах крахмал и другие углеводные полимеры могут абсорбировать намного большие количества воды при набухании. По этой причине желательно, чтобы углеводный полимер был способен абсорбировать воду (или содержащие фермент водные жидкости). Например, кукурузный крахмал может абсорбировать воду, до трех раз превышающую его по весу при 60°С и до десяти раз при 70°С. Применение повышенных температур для того, чтобы абсорбировать большее количество содержащей фермент жидкости, охватывается, таким образом, настоящим изобретением и действительно предпочтительно, особенно, когда имеешь дело с термостабильными фитазными ферментами. Для этих ферментов, следовательно, смешивание твердого носителя и жидкости может быть проведено при повышенных температурах (например, при температуре, более высокой, чем окружающая среда), такой как выше 30°С, предпочтительно выше 40°С и оптимально выше 50°С. В противоположном варианте или в дополнение к этому при этой температуре можно предоставлять жидкость.

Однако, в целом, предпочтительны состояния без набухания при более низких (например, при температуре окружающей среды) температурах для того, чтобы свести к минимуму потерю активности, возникающую из-за нестабильности (термочувствительности) фитаз при более высоких температурах. Подходящая температура при смешивании фермента и жидкости составляет от 20 до 25°С.

Механическая переработка, применяемая в настоящем изобретении для превращения смеси содержащей фитазу жидкости и твердого носителя в гранулы (другими словами, для грануляции), может проводиться с помощью известной технологии, часто применяемой в процессах получения составов для пищи, кормов и ферментов. Она может включать вальцовку, экструзию, скатывание, брикетирование, высокоскоростное гранулирование, барабанное гранулирование, агломерацию в псевдоожиженном слое или их комбинацию. Эти процессы обычно характеризуются подачей механической энергии, такой как движение шнека, вращение смешивающего механизма, давление вальцового механизма аппарата для брикетирования, движение частиц в агломераторе с псевдоожиженным слоем с помощью пластины с вращающимся дном или движение частиц с помощью газового потока, или их комбинацией. Эти процессы позволяют твердому носителю (например, в форме порошка) смешиваться с содержащей фитазу жидкостью (водным раствором или кашицей) и таким образом впоследствии гранулироваться.

Согласно другому варианту изобретения гранулированный материал (например, агломерат) образуется путем распыления содержащей фитазу жидкости на носитель или покрытия ею носителя, как это происходит в агломераторе с псевдоожиженным слоем. В этом случае полученные гранулы могут включать агломерат, как это может быть получено в агломераторе с псевдоожиженным слоем.

Предпочтительно, чтобы смешивание содержащей фитазу жидкости и твердого носителя дополнительно включало перемешивание смеси. Это может улучшать пластичность смеси в целях ускорения грануляции (например, экструзии).

Если гранулированный материал образуется с помощью экструзии, ее предпочтительно выполнять при низком давлении. Это может давать преимущества, поскольку температура смеси, подвергаемой экструзии, не будет изменяться или только слегка увеличится. Экструзия при низком давлении включает продавливание в Fuji Paudal сетчатом или однофильерном прессе. Предпочтительно, чтобы экструзия не приводила к тому, что температура продавливаемого материала поднималась выше 40°С. При экструзии гранулы можно получать естественным образом (гранулы могут отламываться после прохождения через фильеру) или можно применять их разрезание.

Подходящие гранулы должны содержать воду в количестве от 30 до 40%, также от 33 до 37%. Подходит содержание фермента от 3 до 10%, например от 5 до 9%.

Полученные гранулы могут подвергаться округлению (например, с помощью скатывания) в таком аппарате, как аппарат для придания сферической формы, например, MARUMERIZER™, и/или прессованию. Гранулам можно придать сферическую форму до высушивания, так как это может снизить образование пыли в конечном гранулированном материале и/или может облегчить любое покрытие гранулированного материала.

Гранулы можно затем высушить так, как это делается в сушилке с псевдоожиженным слоем, или в случае агломерации в псевдоожиженном слое можно немедленно высушить (в агломераторе) для получения (твердого сухого) гранулированного материала. Специалистами в этой области могут быть применены другие известные способы для высушивания гранул в пищевой промышленности, производстве кормов или ферментов. Подходит текучий гранулированный материал.

Высушивание предпочтительно проводят при температуре от 25 до 60°С, также от 30 до 50°С. В этом случае высушивание может продолжаться от 10 минут до нескольких часов, например от 15 до 30 минут. Требуемый интервал времени, конечно, должен зависеть от количества высушиваемых гранул, но в качестве ориентира он составляет от 1 до 2 секунд на кг гранул.

После высушивания гранул полученный гранулированный материал предпочтительно характеризуется содержанием воды от 3 до 10%, таким как от 5 до 9%.

Для гранулированного материала может быть применено покрытие для придания дополнительных (например, преимущественных) характеристик или свойств, таких как низкое содержание пыли, окраски, защита фермента от воздействия окружающей среды, наличие активности различных ферментов в одной грануле или их сочетание. Гранулы могут быть покрыты жиром, воском, полимером, солью, мазью и/или более жидкой мазью или покрытием (например, жидким), содержащим (второй) фермент или их комбинацию. Должно быть очевидным, что могут применяться несколько желаемых слоев (различных) покрытий. Большое число известных способов подходит для нанесения покрытия(тий) на гранулированный материал, которые включают применение псевдоожиженного слоя, высокоскоростного гранулятора, смешивающего гранулятора или Nauta-миксера.

В других вариантах в гранулированный материал могут быть включены дополнительные ингредиенты, например, такие как технологические добавки для дальнейшего улучшения стабильности гранул и/или стабильности гранулированного материала при хранении. Большое количество таких предпочтительных добавок обсуждается ниже.

В гранулированный материал могут быть включены соли (например, с твердым носителем или жидкостью). Предпочтительно (как предположено в заявке ЕР-А-0758018) могут быть добавлены соли неорганических кислот, которые могут улучшать переработку и стабильность при хранении сухого препарата фитазы. Предпочтительно, чтобы соли неорганических кислот включали двухвалентный катион, такой как цинк, магний и кальций. Наиболее предпочтительным анионом является сульфат.

Предпочтительно (как предложено в заявке ЕР-А-0758018) могут быть добавлены соли неорганических кислот, которые могут улучшать переработку и стабильность при хранении сухого препарата фермента. Предпочтительно, чтобы соли неорганических кислот были водорастворимыми. Они могут включать двухвалентный катион, такой как цинк (в частности), магний и кальций. Наиболее предпочтительным анионом является сульфат, хотя можно применять другие анионы, которые обладают растворимостью в воде. Соли можно добавлять (например, к смеси) в твердой форме. Однако соль(ли) можно растворять в воде или в содержащей фермент жидкости до смешивания с твердым носителем. Подходит, если соль предлагается в количестве, по меньшей мере, 15% (вес/вес, по отношению к ферменту), таком как, по меньшей мере, 30%. Однако процент может быть настолько высок, как 60% или даже 70% (опять вес/вес, по отношению к ферменту). Эти количества могут быть применимы либо к гранулам, либо к гранулируемому материалу. Гранулированный материал может таким образом включать менее чем 12% (вес/вес) соли, например от 2,5 до 7,5%, например от 4 до 6%.

Если соль дается в воде, то ее количество может быть от 5 до 30% (вес/вес), таком как от 15 до 25%.

Дальнейшее улучшение стабильности гранул может быть достигнуто путем включения гидрофобных, образующих гель или медленно растворяющихся (например, в воде) соединений. Они могут составлять от 1 до 10%, например от 2 до 8% и предпочтительно от 4 до 6% по весу (исходя из веса воды и ингредиентов твердого носителя). Подходящие вещества включают производные целлюлоз, такие как НРМС (гидроксипропилметилцеллюлоза), CMC (карбоксиметилцеллюлоза), НЕС (гидроксиэтилцеллюлоза); поливиниловые спирты (PVA); и/или съедобные масла. Могут быть добавлены (например, в смесь для грануляции) съедобные масла, такие как соевое масло или рапсовое масло в качестве технологической добавки, хотя, как правило, предпочтительно, чтобы гидрофобные вещества (например, пальмовое масло) отсутствовали.

Предпочтительно, чтобы гранулы имели относительно узкое распределение по размеру (например, чтобы они были монодисперсными). Это может обеспечить гомогенное распределение фитазы в гранулах и/или гранулированного материала с ферментом в корме для животных. Способ изобретения преследует цель получить гранулированный материал с узким распределением по размеру. Однако, если это необходимо, в способ может быть включена дополнительная стадия для дальнейшего сужения распределения гранул по размеру, такая как просеивание. Подходящим распределением гранулированного материала по размеру является размер между 100 мкм и 2000 мкм, предпочтительно между 200 мкм и 1800 мкм и оптимально между 300 мкм и 1600 мкм. Гранулы могут быть неправильной (но предпочтительно правильной) формы, например приближающейся к сферической.

Другой(гие) подходящий(щие) фермент(ты) могут быть включены в корм для животных, который включает корм для комнатных домашних животных. Функцией этих ферментов часто является улучшение скорости переработки пищи, например, с помощью снижения вязкости или путем уменьшения действия определенных компонентов пищи, препятствующего ее усвоению. Могут быть также использованы ферменты корма для того, чтобы снизить количество соединений, которые в навозе вредны для окружающей среды. Предпочтительными ферментами для этих целей являются: карбогидразы, такие как амилолитические ферменты и ферменты, гидролизующие клеточную стенку растений, которые включают целлюлазы, такие как β-глюканазы, гемицеллюлазы, такие как ксиланазы, или галактаназы; пептидазы, галактозидазы, пектиназы, эстеразы; протеазы, предпочтительно с нейтральным и/или кислым оптимумом рН; и липазы, предпочтительно фосфолипазы, такие как панкреатические фосфолипазы А2 млекопитающих. Предпочтительно, чтобы фермент не включал ферменты, гидролизующие крахмал (например, амилазы). В некоторых вариантах могут быть исключены протеазы, так как они могут наносить вред при их проглатывании. Если ферментом является фермент, разрушающий клеточную стенку растений, например целлюлаза, и, в частности, гемицеллюлаза, такая как ксиланаза, то конечный гранулированный материал может иметь активность фермента в диапазоне от 3000 до 100000, предпочтительно от 5000 до 80000 и оптимально от 8000 до 70000 EXU/г (единиц ксиланазы на г). Если ферментом является целлюлаза, такая как β-глюканаза, то конечный гранулированный материал может иметь активность фермента от 500 до 15000, предпочтительно от 1000 до 10000 и оптимально от 1500 до 7000 BGU/г (единиц β-глюканазы на г).

Гранулы могут включать от 5 до 20, например от 7 до 15% фермента(тов). Фермент может быть природным или полученный рекомбинантным способом.

Предпочтительный способ в соответствии с изобретением, следовательно, включает:

а. Смешивание водной содержащей фитазу жидкости и твердого носителя, включающего, по меньшей мере, 15% (вес/вес) съедобного углеводного полимера, например смешивание твердого носителя с водной, содержащей фермент жидкостью;

б. Необязательное перемешивание полученной смеси;

в. Гранулирование, например, с помощью механической переработки смеси для того, чтобы получить содержащие фермент гранулы, например, путем применения гранулятора или с помощью экструзии;

г. Необязательное округление гранул;

д. Высушивание полученных гранул для получения содержащего фермент гранулированного материала.

В течение всего процесса необходимо следить за тем, чтобы максимальная температура при обработке фермента(тов) поддерживалась ниже 80°С.

Гранулированный материал согласно изобретению подходит для применения при приготовлении корма для животных. При этом широчайшем варианте изобретение охватывает гранулированный материал, включающий фитазу и съедобный углеводный полимер, причем гранулированный материал имеет активность, по меньшей мере, 6000 единиц фитазы/г. В таких способах гранулированный материал смешивают с пищевыми веществами либо как таковой, либо как часть премикса. Характеристики гранулированного материала в соответствии с изобретением дают возможность применять их в качестве компонента смеси, которая хорошо подходит в качестве корма для животных, особенно, если смесь обрабатывают паром и затем брикетируют. В таких брикетах высушенные гранулы могут быть видимыми или различимыми.

Подходит, если корм для животных, премикса или полуфабриката включает от 0,05 до 2,0, например от 0,3 до 1,0, оптимально от 0,4 до 0,6 единиц фитазы/г. Ксиланаза может присутствовать в количестве от 0,5 до 50, например от 1 до 40 EXU/г. Кроме того, может присутствовать еще целлюлаза в количестве от 0,1 до 1,0, например от 0,2 до 0,4 BGU/г.

Корм может иметь содержание воды от 10 до 20%, например от 12 до 15%. Подходящим количеством фермента(тов) является от 0,0005 до 0,0012%, такое как, по меньшей мере, 5 ч/милл.

Кроме того, объектом изобретения является еще способ стимуляции роста животного, включающий кормление животного по диете, которая включает гранулированный материал согласно изобретению или корм, премикс или полуфабрикат согласно изобретению.

Подходящие животные включают сельскохозяйственных животных (свиней, домашнюю птицу, крупный рогатый скот), нежвачных животных или животных с однокамерным желудком (свиней, птицу, домашнюю птицу, морских животных, таких как рыбы), жвачных животных (крупный или мелкий рогатый скот, например коров, овец, коз, оленей, телок, ягнят). Домашняя птица включает цыплят, кур и индюшек.

Последующие примеры представлены единственно с целью иллюстрации изобретения и не являются или не истолковываются как лимитирующие.

Пример 1

Ферментация A. niger CBS 513.88

Препараты спор гриба Aspergillus niger получали, следуя стандартным способам.

Споры и затем клетки проводили через серию разовых ферментации во флаконах Эрленмейера вплоть до ферментера емкостью 10 л. После роста в разовой культуре содержимое этого ферментера использовали в качестве инокуляционного материала для конечной разовой ферментации в объеме 500 л.

Использованная среда содержала: 91 г/л кукурузного крахмала (BDH chemicals); аммоний 38 г/л глюкозы·Н₂O; 0,6 г/л MgSO₄·7Н₂О; 0,6 г/л KCl; 0,2 г/л FeSO₄·7Н₂O и 12 г/л KNO₃. рН поддерживали при 4,6±0,3 автоматическим титрованием 4N NaOH или 4N Н₂SO₄.

Клетки выращивали при 28°С при автоматически контролируемой концентрации растворенного кислорода при 25% насыщении воздухом. Образование фитазы достигало максимального уровня 5-10 ед/мл через 10 дней ферментации.

Ферментацию повторяли с использованием сульфата аммония вместо кукурузного крахмала (установив эквивалентное содержание усваиваемого азота).

Пример 2

Очистка и характеристика фитазы: определение фитазной активности 100 мкл бульонного фильтрата (разведенного в случае необходимости) или супернатанта, или 100 мкл деминерализованной воды в качестве контроля добавляли в инкубационную смесь со следующим составом:

- 0,25 М натрийацетатный буфер с рН 5,5 или

- глицин-HCl буфер; рН 2,5

- 1 мМ фитиновая кислота, натриевая соль

- полувода до 900 мкл.

Полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 10% ТХУ (трихлоруксусной кислоты). После прекращения реакции добавляли 2 мл реагента (3,66 г FeSO₄·4Н₂O в 50 мл раствора молибдата аммония (2,5 г (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4Н₂О и 8 мл Н₂SO₄, разведенные до 250 мл деминерализованной водой).

Интенсивность синей окраски измеряли спектрофотометрически при 750 нм. Измерения являются показателем содержания выделенного фосфата, в отношении калибровочной кривой для фосфата в диапазоне 0-1 ммоль/л.

Пример 3

А. Экспрессия фитазы в A. niger CBS 513.88, трансформированном экспрессионными векторами, содержащими ген фитазы A. Ficuum, соединенный с промоторными и/или сигнальными последовательностями гена амилоглюкозидазы (AG) А. niger.

Для достижения гиперэкспрессии фитазы в А. niger была разработана экспрессионная кассета, в которой ген фитазы A. ficuum находился под контролем промотора амилоглюкозидазы (AG) А. niger в сочетании с сигнальной последовательностью. В случае более длинной лидирующей последовательности промоторную последовательность AG соединяли с последовательностью, кодирующей фитазу, включая лидирующую последовательность фитазы, присоединенную к фрагменту гена фитазы, кодирующему зрелый белок (см. пример 10 заявки ЕР-А-0420358).

В. Экспрессия гена фитазы под контролем промотора AG в А. niger

Штамм CBS 513.88 А. niger (депонированный 10 октября 1988 года) трансформировали 10 мкг фрагмента ДНК известными способами (например, см. пример 9 заявки ЕР-А-0420358). Выделяли одиночные трансформированные клетки A. niger для каждой экспрессионной кассеты и споры наносили на селективные ацетамид-агаровые чашки. Споры каждого трансформанта получали из клеток, росших в течение 3 дней при 37°С на содержащих 0,4% картофельной декстрозы (Oxoid, Англия) агаровых чашках. Продуцирование фитазы тестировали во встряхиваемых сосудах при следующих условиях.

Приблизительно 1×10⁸ спор инокулировали в 100-мл среды предварительного культивирования, содержащей (на литр):

1 г КН₂PO₄; 30 г мальтозы; 5 г дрожжевого экстракта;

10 г казеинового гидролизата; 0,5 г MgSO₄·7H₂O и 3 г твина-80.

рН доводили до 5,5.

После выращивания в течение ночи при 34°С в роторном шейкере 1 мл растущей культуры инокулировали в 100 мл основной среды культивирования, содержащей (на литр): 2 г КН₂PO₄; 70 г мальтодекстрина (maldex MDO3, Amylum); 12,5 г дрожжевого экстракта; 25 г казеинового гидролизата; 2 г К₂SO₄; 5 г MgSO₄·7H₂O; 0,03 г ZnCl₂; 0,02 г CaCl₂; 0,05 MnSO₄·4H₂O и FeSO₄; 3 г твина-80, рН доводили до 5,6.

Мицелий выращивали в течение, по меньшей мере, 140 часов. Продукцию фитазы измеряли, как описано в примере 2. Ферментацию повторяли с применением эквивалентных количеств глюкозы и сульфата аммония в качестве источников углерода и азота. Бульон фильтровали для получения фильтрата, который отделяли от биомассы. Наибольшую фитазную активность, равную 280 ед/мл, получали при применении экспрессионной кассеты PFYT3 (промотор AG/лидирующая последовательность фитазы).

Пример 4

Очистка фитазы из фильтрата

Очистку для получения высокоочищенной фитазы проводили следующим образом:

1. Катионообменная хроматография при рН 4,9

2. Катионообменная хроматография при рН 3,8

3. Анионообменная хроматография при рН 6,3

4. Ультрафильтрация

1. Фильтрат фитазы разводили 20 раз водой и устанавливали рН 4,9. Этот материал пропускали через колонку с S-сефарозой для высокоскоростного хроматографирования, уравновешенную 20 мМ буфером: лимонная кислота/NaOH с рН 4,9. Собирали несвязавшийся материал, включая фитазу, и использовали на следующей стадии.

2. рН материала с рН 4,9 доводили до 3,8 и фитазу связывали с S-сефарозой для высокоскоростного хроматографирования в колонке, уравновешенной 2 мМ буфером лимонная кислота/NaOH с рН 3,8. Фитазу элюировали с колонки 20 мМ буфером NaPO₄, 50 мМ NaCl с рН 7,6.

3. рН объединенных фракций фитазы, полученных на второй катионообменной стадии, доводили до 6,3 и фитазу связывали с Q-сефарозой для высокоскоростного хроматографирования в колонке, уравновешенной 10 мМ буфером KPO₄ с рН 6,3. Фитазу элюировали, используя градиент концентрации NaCl до 1 М в том же буфере.

Таблица 1Итоговые результаты очистки
Образец	Степень очистки
Исходный фильтрат	1
После катионообменника, рН 4,9	1,07
После катионообменника, рН 3,9	1,2
После анионообменника	1,46

Конечный (после анионообменника) продукт, содержащий 10 мг белка/мл, концентрировали десятикратно с помощью ультрафильтрации с применением Amicon Stirred Cell (модуль на 2 л) и мембраны Kalle E35 при давлении 3 бар (3-10⁵ N/m²).

Конечная концентрация очищенной фитазы достигала 280-300 г/