Днк, кодирующая белок, который участвует в синтезе трегалозы (варианты), и способ получения l-глутаминовой кислоты (варианты)

Днк, кодирующая белок, который участвует в синтезе трегалозы (варианты), и способ получения l-глутаминовой кислоты (варианты)

Реферат

Предпосылки изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новой бактерии, вырабатывающей L-глутаминовую кислоту, и способа получения L-глутаминовой кислоты путем ферментации с ее использованием. L-глутаминовая кислота является важной аминокислотой с точки зрения продуктов питания, лекарственных средств и т.д.

Описание уровня техники

Традиционно L-глутаминовую кислоту вырабатывают в основном с помощью способов ферментации, используя так называемые коринебактерии (коринеформные бактерии) продуценты L-глутаминовой кислоты, относящиеся к роду Brevibacterium, Corynebacterium или Microbacterium, или их мутантные штаммы (Amino Acid Fermentation, pp.195-215, Gakkai Shuppan Center, 1986).

Известно, что в ходе выработки L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации также в качестве вторичного продукта образуется трегалоза. Следовательно, были разработаны способы разрушения или метаболизма образующейся трегалозы. Такими способами являются способ выработки аминокислоты с помощью ферментации с использованием коринеформной бактерии, у которой индуцирована пролиферационная активность с утилизацией трегалозы (открытый японский патент (Kokai) №5276935), и способ выработки аминокислоты с помощью ферментации с использованием коринеформной бактерии, у которой амплифицирован ген, кодирующий фермент, катаболизирующий трегалозу (корейская патентная публикация (В1) №165836). Однако неизвестно, как подавить образование самой трегалозы у бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты.

У Escherichia coli синтез трегалозы катализируется трегалозо-6-фосфатсинтазой. Известно, что этот фермент кодируется геном otsA. Кроме того, также сообщалось, что штамм Escherichia coli с разрушенным геном otsA способен только к слабому росту в гиперосмотической среде (H.M.Glaever et al., 1998, J. Bacteriol., 70 (6), 2841-2849). Однако соотношение между разрушением гена otsA и выработкой веществ определено не было.

С другой стороны, хотя ген treY известен у бактерии Brevibacterium helvolum, принадлежащей к роду бактерий Brevibacterium, для них какой-либо ген типа otsA не известен. Что касается бактерий, относящихся к роду Mycobacterium, то известен механизм, в котором реакция катализируется продуктом, который кодируется геном treS (трегалозосинтаза (TreS)), причем этот ген отличается от гена otsA и гена treY, будучи геном, кодирующим фермент метаболического пути биосинтеза трегалозы (К.A. De Smet et al., 2000, Microbiology, 146 (1), 199-208). Однако этот метаболический путь использует мальтозу в качестве субстрата и не связан с обычной ферментацией L-глутаминовой кислоты, в которой исходным материалом является глюкоза, фруктоза или сахароза.

Краткое содержание изобретения

Объектом настоящего изобретения является повышение эффективности выработки L-глутаминовой кислоты в процессе получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации с использованием коринеформных бактерий за счет подавления выработки трегалозы, являющейся вторичным продуктом.

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью достижения указанного выше объекта. В результате они обнаружили, что бактерия, относящаяся к роду Brevibacterium, включает ген otsA и ген treY, как и Mycobacterium tuberculosis, а эффективность выработки L-глутаминовой кислоты была улучшена за счет разрушения по крайней мере одного из этих генов. Таким образом, они довели до завершения настоящее изобретение.

Следовательно, настоящим изобретением предусматривается нижеследующее.

(1) Коринеформная бактерия (коринебактерия), обладающая способностью вырабатывать L-глутаминовую кислоту, причем способность к синтезу трегалозы у данной бактерии снижена или исключена.

(2) Коринеформная бактерия в соответствии с (1), причем способность синтезировать трегалозу снижена или исключена за счет внесения мутации в хромосомный ген, кодирующий фермент метаболического пути трегалозного синтеза, или разрушения этого гена.

(3) Коринеформная бактерия в соответствии с (2), причем ген, кодирующий фермент метаболического пути трегалозного синтеза, включает ген, кодирующий трегалозо-6-фосфатсинтезу, ген, кодирующий мальтоолигозилтрегалозосинтазу, или оба данных гена.

(4) Коринеформная бактерия в соответствии с (3), причем ген, кодирующий трегалозо-6-фосфатсинтазу, кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO 30, а ген, кодирующий мальтоолигозилтрегалозосинтазу, кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO 32.

(5) Способ выработки L-глутаминовой кислоты, включающий культивирование коринеформной бактерии в соответствии с любым из (1)-(4) в культуральной среде с целью получения и накопления L-глутаминовой кислоты в среде и сбор L-глутаминовой кислоты из среды.

(6) ДНК, кодирующая белок, определенный далее в (А) или (В):

(A) белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 30;

(B) белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 30, включающий замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью трегалозо-6-фосфатсинтазы.

(7) ДНК в соответствии с (6), являющаяся ДНК, определенной далее в (а) или (b):

(a) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, включающую по крайней мере нуклеотидные остатки под номерами 484-1938 из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 29;

(b) ДНК, способная в жестких условиях гибридизовать с нуклеотидной последовательностью, включающей по крайней мере нуклеотидные остатки под номерами 484-1938 из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 29, проявляющая гомологичность на уровне 55% или выше по сравнению с вышеуказанной нуклеотидной последовательностью и кодирующая белок, обладающий активностью трегалозо-6-фосфатсинтазы.

(8) ДНК, кодирующая белок, определенный далее в (А) или (В):

(А) белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 32;

(Б) белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 32, включающий замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и обладающий активностью мальтоолигозилтрегалозосинтазы.

(9) ДНК в соответствии с (8), которая является ДНК, определенной далее в (а) или (b):

(a) ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, включающую по крайней мере нуклеотидные остатки под номерами 82-2514 из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 31;

(b) ДНК, способная в жестких условиях гибридизовать с нуклеотидной последовательностью, включающей по крайней мере нуклеотидные остатки под номерами 82-2514 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 31, проявляющая гомологию на уровне 60% или выше по отношению к вышеуказанной нуклеотидной последовательности и кодирующая белок, обладающий активностью мальтоолигозилтрегалозосинтазы.

Активность трегалозо-6-фофатсинтазы обозначает активность по катализу реакции, в которой α,α-трегалозо-6-фосфат и УДФ образуются из УДФ-глюкозы и глюкозо-6-фосфата, а активность мальтоолигозилтрегалозосинтазы обозначает активность по катализу реакции, в которой мальтотриозилтрегалоза образуется из мальтопентозы.

В соответствии с настоящим изобретением эффективность выработки L-глутаминовой кислоты в системе получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации с использованием коринеформных бактерий может быть повышена за счет подавления выработки трегалозы, являющейся вторичным продуктом.

Предпочтительные варианты изобретения

Здесь и далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Коринеформная бактерия по настоящему изобретению является коринеформной бактерией, обладающей активностью по выработке L-глутаминовой кислоты, при которой способность к синтезу трегалозы снижена или исключена. Коринеформные бактерии, упоминаемые в связи с настоящим изобретением, включают группу микроорганизмов, определенных у Bergey, 1974, ″Manual of Determinative Bacteriology″, 8th edition, p.599: они являются аэробными грам-положительными палочками, у которых отсутствуют кислотоустойчивость и способность к аэробному образованию спор. До настоящего времени их классифицировали в род Brevibacterium, однако в настоящее время объединяют в роде Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), и они включают бактерии, относящиеся к роду Brevibacterium или Microbacterium, которые близкородственны роду Corynebacterium. Примеры таких коринеформных бактерий приведены ниже.

Corynebacterium acetoacidophilum

Corynebacterium acetoglutamicum

Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitalis

Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)

Brevibacterium album

Brevibacterium cerium

Microbacterium ammoniaphilum

В частности, в качестве примера можно привести следующие штаммы.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511

Corynebacterium callunae ATCC 15991

Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC13868

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240

Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871

Brevibacterium album ATCC 15111

Brevibacterium cerium ATCC 15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

Упоминавшаяся выше способность таких коринеформных бактерий к синтезу трегалозы может быть снижена или исключена путем мутирования или разрушения гена, кодирующего фермент, вовлеченный в метаболический путь синтеза трегалозы, с применением мутагенной обработки или методов генетической рекомбинации. Такая мутация может являться мутацией, которая подавляет транскрипцию или трансляцию гена, который кодирует фермент метаболического пути синтеза трегалозы, или мутацией, которая обусловливает элиминацию или подавление фермента, вовлеченного в метаболический путь синтеза трегалозы. Ферментом метаболического пути синтеза трегалозы может, например, являться трегалозо-6-фосфатсинтаза, мальтоолигозилтрегалозосинтаза или они оба.

Разрушение гена, кодирующего фермент метаболического пути синтеза трегалозы, может быть осуществлено путем замены гена по механизму гомологичной рекомбинации. Ген в хромосоме коринеформной бактерии может быть разрушен путем трансформации коринеформной бактерии с использованием ДНК, включающей ген, который кодирует фермент метаболического пути синтеза трегалозы, модифицированный таким образом, чтобы его часть была делетирована, в результате чего фермент метаболического пути синтеза трегалозы не смог бы нормально функционировать (ген «делеционного типа»), с последующей рекомбинацией между геном «делеционного типа» и нормальным геном на хромосоме. Такое разрушение гена с помощью гомологичной рекомбинации к настоящему времени разработано. В связи с этим можно упомянуть метод, в котором используют линейную ДНК или кольцевую ДНК, которые не реплицируются в коринеформных бактериях, и метод, в котором используют плазмиду, включающую сайт начала репликации, чувствительный к температуре. Однако метод, в котором используют кольцевую ДНК, которая не способна реплицироваться в коринеформных бактериях, или плазмиду, включающую чувствительный к температуре сайт начала репликации, является предпочтительным.

В качестве примера гена, кодирующего фермент метаболического пути синтеза трегалозы, например, можно привести, ген otsA или ген treY, или он может включать их оба. Поскольку нуклеотидные последовательности гена otsA или гена treY Brevibacterium lactofermentum и фланкирующих их участков были установлены в настоящем изобретении, данные гены можно легко выделить путем формирования праймеров на основе последовательностей и проведения ПЦР (полимеразной цепной реакции: см. Т.J.White et al., 1989, Trends Genet., 5, 185) с использованием праймеров и хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum в качестве матрицы.

Нуклеотидная последовательность, включающая ген otsA, и нуклеотидная последовательность, включающая ген treY Brevibacterium lactofermentum, полученные в описанных далее примерах, показаны в SEQ ID NO 29 и 31 соответственно. Кроме того, аминокислотные последовательности, кодируемые данными нуклеотидными последовательностями, показаны в SEQ ID NO 30 и 32 соответственно.

Каждый из генов otsA и treY может быть таким геном, который кодирует белок, включающий замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот по одному или нескольким положениям, предусматривая то, чтобы активность трегалозо-6-фосфатсинтазы или мальтоолигозилтрегалозосинтазы, кодируемых ими, не нарушалась. Хотя число таких «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положений или типов аминокислотных остатков в составе пространственной структуры белка, предпочтительно оно составляет 1-40, более предпочтительно 1-20, еще более предпочтительно 1-10.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, что и описанные выше трегалозо-6-фосфатсинтаза или мальтоолигозилтрегалозосинтаза, может быть получена, например, путем модифицирования каждой из нуклеотидных последовательностей, например, с помощью метода направленного (сайт-специфичного) мутагенеза таким образом, чтобы один или большее число аминокислотных остатков в конкретном сайте включали бы замену, делецию, вставку, добавление или инверсию. Такая ДНК, модифицированная в соответствии с описанным выше, также может быть получена с помощью известной традиционной обработки мутагеном. Мутагенная обработка включает метод обработки ДНК, кодирующей трегалозо-6-фосфатсинтазу или мальтоолигозилтрегалозосинтазу in vitro, например, гидроксиламином, и метод обработки микроорганизма, например, бактерии, относящейся к роду Escherichia, несущей ДНК, кодирующую трегалозо-6-фосфатсинтазу или мальтоолигозилтрегалозосинтазу, ультрафиолетом или мутагенным агентом, обычно применяемым для мутагенной обработки, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистая кислота.

Замена, делеция, вставка, добавление или инверсия нуклеотида в соответствии с описанным выше также охватывает встречающийся в естественных условиях мутантный вариант или вариант, основывающийся, например, на индивидуальной изменчивости или межвидовых или межродовых различиях микроорганизмов, которые несут трегалозо-6-фосфатсинтазу или мальтоолигозилтрегалозосинтазу.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, что и описанные выше трегалозо-6-фосфатсинтаза или мальтоолигозилтрегалозосинтаза, может быть получена с помощью экспрессии такой ДНК, имеющей мутацию в соответствии с описанным выше, в подходящей клетке, и анализа активности трегалозо-6-фосфатсинтазы или активности мальтоолигозилтрегалозосинтазы у экспрессированного продукта.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как и трегалозо-6-фосфатсинтаза, также может быть получена путем выделения ДНК, способной в жестких условиях гибридизовать с ДНК, имеющей, например, нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидным положениям 484-1938 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO 29, или с зондом, который можно сформировать на материале нуклеотидной последовательности, характеризующейся гомологией на уровне 55% или больше, предпочтительно 65% или больше, более предпочтительно 75% или больше по отношению к вышеуказанной нуклеотидной последовательности и обладающей активностью трегалозо-6-фосфатсинтазы из ДНК, кодирующей трегалозо-6-фофатсинтазу, имеющую мутацию, или из несущей ее клетки. Сходным образом, ДНК, кодирующая по существу такой же белок, что и мальтоолигозилтрегалозосинтаза, также может быть получена путем выделения ДНК, способной в жестких условиях гибридизовать с ДНК, имеющей, например, нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидным положениям 82-2514 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO 31, или с зондом, который может быть сформирован на основе нуклеотидной последовательности, проявляющей гомологию на уровне 60% или больше, предпочтительно 70% или больше, более предпочтительно 80% или больше по отношению к указанной выше нуклеотидной последовательности и обладающий активностью мальтоолигозилтрегалозосинтазы из ДНК, кодирующей мальтоолигозилтрегалозосинтазу, имеющей мутацию, или из несущей ее клетки.

По использованию в данном тексте «жесткие условия» указывают на условия, при которых образуется так называемый специфичный гибрид, а неспецифичный гибрид не образуется. С использованием любого числового значения точно определить такие условия затруднительно. Однако, например, жесткие условия включают условие, при котором ДНК, характеризующиеся высоким уровнем гомологии, например, ДНК, характеризующиеся гомологией на уровне не менее чем 55%, предпочтительно не менее чем 60%, гибридизуют друг с другом, а ДНК, характеризующиеся гомологией меньше указанного выше уровня, не гибридизуют друг с другом. Как альтернатива, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуют друг с другом при солевой концентрации, соответствующей стандартным условиям промывки при гибридизации по Саузерну, т.е. 1×SSC, 0,1% ДСН, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% ДСН, при 60°С.

В качестве зонда также можно использовать частичную последовательность каждого из генов. Такой зонд может быть сформирован с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов, сформированных на основе нуклеотидной последовательности каждого гена в качестве праймеров, и фрагмента ДНК, включающего каждый ген, - в качестве матрицы. Когда в качестве зонда используют фрагмент ДНК длиной примерно 300 п.н., условия промывки при гибридизации могут заключаться в 2×SSC, 0,1% ДСН при 50°С.

Гены, способные гибридизовать при таких условиях, которые описаны выше, включают те гены, у которых в кодирующий участок генов внесен стоп-кодон, и те гены, которые не имеют активности вследствие мутации в активном центре. Однако такие мутанты легко могут быть удалены путем лигирования каждого из генов на имеющийся в продаже экспрессирующий вектор и измерения активности трегалозо-6-фосфатсинтазы или активности мальтоолигозилтрегалозосинтазы.

Когда ген otsA или ген treY используют для разрушения данных генов на хромосомах коринеформных бактерий, то отсутствует необходимость в наличии активностей кодируемых трегалозо-6-фосфатсинтазы или мальтоолигозилтрегалозосинтазы. Далее ген otsA или ген treY, использованные для разрушения гена, могут представлять собой ген, происходящий от иного микроорганизма, лишь бы он мог претерпевать гомологичную рекомбинацию с такими же генами коринеформных бактерий. Например, можно упомянуть ген otsA бактерии, относящейся к роду Escherichia или Mycobacterium, ген treY бактерии, относящийся к роду Arthrobacter, Brevibacterium helvolum, или бактерии, относящейся к роду Rhizobium.

Ген «делеционного типа» для гена otsA или гена treY может быть получен путем вырезания некоторого участка с помощью рестриктазы (рестриктаз) из состава фрагмента ДНК, включающего один из данных генов или их части, с целью делетирования по крайней мере части кодирующего участка или регулирующего экспрессию сегмента, такого как промотор.

Кроме того, ген «делеционного типа» также может быть получен путем проведения ПЦР с использованием праймеров, сконструированных таким образом, чтобы часть гена делетировалась. Более того, ген «делеционного типа» может быть получен путем точковой нуклеотидной мутации, например мутации типа «сдвига рамки считывания».

Разрушение гена otsA будет охарактеризовано здесь далее. Разрушение гена treY может быть осуществлено сходным образом.

Ген otsA в составе хромосомы хозяина может быть заменен на ген «делеционного типа» otsA следующим образом. Для этого ген «делеционного типа» otsA и маркерный ген резистентности к лекарственному средству, такому как канамицин, хлорамфеникол, тетрациклин и стрептомицин, вносят в состав плазмиды, которая не способна автономно реплицироваться в коринеформных бактериях, с получением рекомбинантной ДНК. Коринеформная бактерия может быть трансформирована данной рекомбинантной ДНК, и штамм-трансформант можно прокультивировать в культуральной среде, содержащей лекарственное средство, с целью получения штамма-трансформанта, у которого рекомбинантная ДНК была внесена в хромосомную ДНК. Как альтернатива такой штамм-трансформант может быть получен с использованием температурочувствительной плазмиды, взятой в качестве указанной плазмиды, и культивирования трансформантов при температуре, при которой чувствительная к температуре плазмида не может реплицироваться.

У штамма, у которого рекомбинантная ДНК внесена в хромосому в соответствии с описанным выше, рекомбинантная ДНК обусловливает рекомбинацию с последовательностью гена otsA, которая исходно находится на хромосоме, а два химеризованных гена, включающих хромосомный ген otsA и ген otsA «делеционного типа», встраиваются в хромосому таким образом, чтобы другие фрагменты рекомбинантной ДНК (векторная часть и маркерный ген резистентности к лекарственному средству) оказывались бы расположены между ними.

Затем с целью оставить в составе хромосомной ДНК только ген otsA «делеционного типа» одну копию гена otsA удаляют из хромосомной ДНК вместе с векторной частью (включая маркерный ген резистентности к лекарственному средству) по механизму рекомбинации двух генов otsA. В этом случае нормальный ген otsA остается в хромосомной ДНК, а ген otsA «делеционного типа» вырезается, или, наоборот, ген otsA «делеционного типа» остается в хромосомной ДНК, а нормальный ген otsA вырезается. Подтвердить то, какой тип гена остается в хромосомной ДНК, можно с помощью анализа структуры гена otsA на хромосоме методом ПЦР, гибридизации и подобного.

Коринеформная бактерия, используемая в настоящем изобретении, может характеризоваться повышенной активностью фермента, который катализирует биосинтез L-глутаминовой кислоты, в дополнение к делеции или снижению способности синтезировать трегалозу. Примерами фермента, который катализирует биосинтез L-глутаминовой кислоты, являются глутаматдегидрогеназа, глутаминсинтетаза, глутаматсинтаза, изоцитратдегидрогеназа, аконитатгидратаза, цитратсинтаза, пируваткарбоксилаза, фосфоенолпируваткарбоксилаза, фосфоенолпируватсинтаза, енолаза, фосфоглицеромутаза, фосфоглицераткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, фруктозобифофатальдолаза, фосфофруктокиназа, глюкозофосфатизомераза и т.д.

Кроме того, у коринеформной бактерии, используемой в настоящем изобретении, может быть снижен в активности или сделан дефектным фермент, который катализирует реакцию образования иного соединения, нежели L-глутаминовая кислота, образующегося в результате ответвления от метаболического пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примерами такого фермента являются α-кетоглутаратдегидрогеназа, изоцитратлиаза, фосфатацетилтрансфераза, ацетаткиназа, ацетогидроксиматсинтаза, ацетолактатсинтаза, формиатацетилтрансфераза, лактатдегидрогеназа, L-глутаматдекарбоксилаза, 1-пирролиндегидрогеназа и т.д.

Более того, путем внесения температурочувствительной мутации по фактору подавления активности биотина, такого как поверхностно-активные агенты, в коринеформную бактерию, обладающую способностью вырабатывать L-глутаминовую кислоту, данная бактерия становится способной вырабатывать L-глутаминовую кислоту в культуральной среде, содержащей избыточное количество биотина в отсутствие фактора подавления активности биотина (см. международную патентную заявку WO 96/06180). В качестве такой коринеформной бактерии можно упомянуть Brevibacterium lactofermentum штамма AJ13029, заявленный в WO 96/06180. Штамм AJ13029 был депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (в настоящее время независимая административная организация - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Япония, почтовый индекс 305-5466)) 2 сентября 1994 года с получением депозитарного номера FERM Р-14501. Затем он был перенесен в международный депозитарий на условиях Будапештского договора 1 августа 1995 года с присвоением ему депозитарного номера FERM BP-5189.

Когда коринеформную бактерию, обладающую способностью вырабатывать L-глутаминовую кислоту, у которой снижена или исключена способность синтезировать трегалозу, культивируют в подходящей среде, L-глутаминовая кислота накапливается в среде.

Культуральной средой, используемой для выработки L-глутаминовой кислоты, является обычная среда, которая содержит источник углерода, источник азота, неорганические ионы и другие органические следовые питательные компоненты, если это необходимо. В качестве источника углерода возможно использование сахаров, таких как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, ромовая патока и гидролизат крахмала; спиртов, таких как этанол и инозитол; или органических кислот, таких как уксусная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.

В качестве источника азота можно использовать неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония и ацетат аммония, аммиак, органический азот, такой как пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, вытяжку замоченных зерен кукурузы и соевый гидролизат, газообразный аммиак, водный раствор аммиака и т.п.

В качестве добавляемых неорганических ионов (или их источников) служат малые количества фосфата калия, сульфата магния, ионов железа, ионов магния и т.п. Что касается органических следовых питательных компонентов, то желательно добавлять незаменимые вещества, такие как витамин B₁, дрожжевой экстракт и т.п. в подходящих количествах в зависимости от необходимости.

Культивирование предпочтительно осуществляют в аэробных условиях со встряхиванием, перемешиванием с аэрацией или подобным в течение 16-72 часов. Температуру культуры контролируют на уровне 30-45°С, а рН соблюдают в процессе культивирования на уровне 5-9. Для такой корректировки рН можно использовать неорганические или органические вещества с кислой или щелочной реакцией, газообразный аммиак и т.д.

Сбор L-глутаминовой кислоты из ферментационного бульона может быть проведен, например, с помощью методов, основанных на использовании ион-обменных полимеров, кристаллизации и т.д. В частности, L-глутаминовая кислота может быть адсорбирована на анион-обменном полимере и снята с него или кристаллизована путем нейтрализации.

Примеры

Здесь и далее настоящее изобретение будет охарактеризовано более конкретно путем отсылки к нижеследующим примерам.

Пример 1

Конструирование штамма Brevibacterium lactofermentum с разрушенным геном otsA

<1> Клонирование гена otsA

Поскольку ген otsA Brevibacterium lactofermentum известен не был, он был выделен с использованием нуклеотидной последовательности гена otsA другого микроорганизма, взятого в качестве эталона. К настоящему времени гены otsA Escherichia и Mycobacterium установлены с их полными нуклеотидными последовательностями (I.Kaasen et al., 1994, Gene, 145 (1), 9-15; K.A.De Smet et al., 2000, Microbiology, 146 1), 199-208). Следовательно, с учетом аминокислотной последовательности, расшифрованной с данных нуклеотидных последовательностей, сначала были синтезированы ДНК-праймеры PI (SEQ ID NO 1) и Р2 (SEQ ID NO 2) для ПЦР. ДНК-праймеры P1 и Р2 соответствовали участкам нуклеотидных положений 1894-1913 и 2531-2549 нуклеотидной последовательности гена otsA Escherichia coli (GenBank, депозитарный №X69160) соответственно. Также они соответствовали участкам нуклеотидных положений 40499-40518 и 41166-41184 гена otsA Mycobacterium tuberculosis (GenBank, депозитарный №Z95390) соответственно.

Затем была проведена ПЦР с использованием праймеров Р1 и Р2 и хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 в качестве матрицы в цикле, включающем реакции при 94°С в течение 0,5 минуты, 50°С в течение 0,5 минуты и 72°С в течение 4 минут, что было повторено на протяжении 30 циклов. В результате был получен по существу единственный тип амплифицированного фрагмента длиной примерно 600 п.н. Данный амплифицированный фрагмент клонировали в состав плазмидного вектора pCR2.1 с использованием набора Original ТА Coning kit, производимого фирмой Invitrogen, с получением pCotsA. Затем была определена нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента.

Основываясь на нуклеотидной последовательности частичного фрагмента гена otsA, полученного в соответствии с описанным выше, ДНК-праймеры Р10 (SEQ ID NO 8) и Р12 (SEQ ID NO 10) были вновь синтезированы, и неизвестные участки, фланкирующие данный частичный фрагмент, были амплифицированы методом «обратной ПЦР» (T.Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16, 81-86; H.Ochman et al., 1988, Genetics, 120, 621-623). Хромосомная ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 была разрезана рестриктазами BamHI, BglII, ClaI, HindIII, KpnI, MluI, MunL, SalI или XhoI и лигирована на себя с использованием ДНК-лигазы Т4 (Takara Shuzo). С использованием полученной в результате ДНК в качестве матрицы и ДНК-праймеров Р10 и Р12 ПЦР проводили в цикле, включающем реакции при 94°С в течение 0,5 минуты, 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 4 минут, что повторяли на протяжении 30 циклов. В результате при использовании ClaI или BglII в качестве рестриктазы в каждом случае получали амплифицированный фрагмент длиной 4 т.п.н. Нуклеотидные последовательности данных амплифицированных фрагментов напрямую определяли с использованием ДНК-праймеров Р5-Р9 (SEQ ID NO 3-7) и Р11-Р15 (SEQ DI NO 9-13). Таким образом, полноразмерная нуклеотидная последовательность гена otsA Brevibacterium lactofermentum АТС 13869 была определена в соответствии с показанным в SEQ ID NO 29. Аминокислотная последовательность, кодируемая данной нуклеотидной последовательностью, показана в SEQ ID NO 29 и 30.

При определении уровней гомологии последовательности упомянутого выше гена otsA по сравнению с геном otsA Escherichia coli (GenBank, депозитарный №Х69160) и геном Mycobacterium tuberculosis (GenBank, депозитарный №Z95390) нуклеотидная последовательность продемонстрировала уровни гомологии 46,3% и 55,9% соответственно, а гомологии аминокислотных последовательностей составила 30,9% и 51,7% соответственно. Уровни гомологии были подсчитаны с использованием программы GENETIX-WIN (Software Development), основанной на методе Липмана-Персона (Science, 227, 1435-1441 (1985)).

<2> Конструирование плазмиды для разрушения гена otsA

С целью анализа присутствия или отсутствия улучшающего эффекта по выработке L-глутаминовой кислоты в результате разрушения гена, кодирующего фермент метаболического пути биосинтеза трегалозы у коринеформных бактерий, формировали плазмиду для разрушения гена otsA. Плазмиду для разрушения гена otsA конструировали следующим образом. ПЦР проводили с использованием плазмиды pCotsA, ранее сконструированной при клонировании гена otsA, в качестве матрицы и праймеров Р29 (SEQ ID NO 33) и РЗО (SEQ ID NO 34), включающих рестрикционный ClaI-сайт, в цикле, включающем реакции при 94°С в течение полуминуты, 55°С в течение полуминуты и 72°С в течение 8 минут, что повторяли на протяжении 30 циклов. Амплифицированный фрагмент был расщеплен рестриктазой ClaI, затуплен по концам с использованием ДНК-полимеразы фага Т4 (Takara Shuzo) и лигирован на себя с использованием лигазы фага Т4 (Takara Shuzo) с получением плазмиды pCotsAC, которая включает ген otsA, имеющий мутацию сдвига рамки (нуклеотиды 1258-1300 из SEQ ID NO 29 были делетированы) приблизительно по его центральной части.

<3> Формирование штамма с разрушенным геном otsA

С использованием плазмиды pCotsAC для разрушения гена бактерию Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, вырабатывающую L-глутаминовую кислоту, трансформировали методом электропорации, а полученные трансформанты отбирали исходя из их способности расти в культуральной среде СМ2В, содержащей 20 мг/л канамицина. Поскольку в плазмиде pCotsAC для разрушения гена otsA нет сайта начала репликации, который мог бы функционировать в Brevibacterium lactofermentum, полученные в результате использования плазмиды трансформанты претерпевали гомологичную рекомбинацию, происходящую между генами otsA на хромосоме Brevibacterium lactofermentum и в плазмиде pCotsAC для разрушения гена. На материале прошедших гомологичную рекомбинацию штаммов, полученных в соответствии с описанным выше, штаммы, у которых векторная часть плазмиды pCotsAC для разрушения гена утрачивалась вследствие повторного прохождения гомологичной рекомбинации, отбирали на основе приобретенного признака чувствительности к канамицину, являющегося маркерным признаком.

На материале штаммов, полученных в соответствии с описанным выше, был отобран штамм, у которого закрепилась желательная мутация типа сдвига рамки. Отбор такого штамма осуществляли с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК, экстрагированной из штамма, который стал чувствительным к канамицину, в качестве матрицы и ДНК-праймеров Р8 (SEQ ID NO 14) и Р13 (SEQ ID NO 11) в цикле, включающем реакции при 94°С в течение полминуты, 55°С в течение полминуты и 72°С в течение 1 минуты, что повторяли на протяжении 30 циклов, и секвенирования полученного амплифицированного фрагмента с использованием ДНК-праймера Р8 с целью подтверждения дисфункции гена otsA вследствие внесения мутации типа сдвига рамки. Полученный в соответствии с описанным выше штамм обозначили как штамм ΔОА.

Пример 2

Конструирование штамма с разрушенным геном treY

<1> Клонирование гена treY

Поскольку ген treY у Brevibacterium lactofermentum не известен, он был получен с использованием нуклеотидных последовательностей генов treY других микроорганизмов в качестве эталонов для сравнения. Нуклеотидные последовательности генов treY к настоящему времени были установлены для родов Arthrobacter, Brevibacterium и Rhizobium (K.Maruta et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta, 1289 (1), 10-13; GenBank, депозитарный №AF039919; K.Maruta et al., 1996, Biosci. Biotechnol. Biochem., 60 (4), 717-720). Следовательно, с учетом аминокислотной последовательности, расшифрованной по данным нуклеотидным последовательностям, вначале были синтезированы ДНК-праймеры Р3 (SEQ ID NO 14) и Р4 (SEQ ID NO 15) для ПЦР. ДНК-праймеры Р3 и Р4 соответствуют участкам нуклеотидных положений 975-992 и 2565-2584 нуклеотидной последовательности гена treY видов рода Arthrobacter (GenBank, депозитарный №D63343) соответственно. Далее, они соответствуют участкам нуклеотидных положений 893-910 и 2486-2505 гена treY Brevibacterium helvolum (GenBank, депозитарный №AF039919) соответственно. Кроме того, они соответствуют участкам нуклеотидных положений 862-879 и 2452-2471 гена treY видов рода Rhizobium (GenBank, депозитарный №D78001).

После этого ПЦР проводили с использованием праймеров Р3 и Р4 и хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 в качестве матрицы в цикле, включающем реакции при 94°С в течение 0,5 минуты, 55°С в течение 0,5 минуты и 72°С в течение 2 минут, что повторяли на протяжении 30 циклов. В результате был получен по существу единственный тип амплифицированного фрагмента длиной примерно 1,6 т.п.н. Данный амплифицированный фрагмент клонировали в плазмидный вектор pCR2.1 с использованием набора Original ТА Cloning Kit, производимого Invitrogen. Затем нуклеотидную последовательность определяли на протяжении примерно 0,6 т.п.н.

Основываясь на нуклеотидной последовательности частичного фрагмента гена treY, полученного в соответствии с описанным выше, ДНК-праймеры Р16 (SEQ ID NO 16) и Р26 (SEQ ID NO 26) были вновь синтезированы, и неизвестные участки, фланкирующие данный частичный фрагмент, были амплифицированы с помощью обратной ПЦР (T.Triglia et al., 1988, Nucleic Acids Res., 16, 81-86; H.Ochman et al., 1988, Genetics, 120, 621-623). Хромосомная ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 была расщеплена рестриктазой BamHI, HindIII, SalI или XhoI и лигирована на себя с использованием ДНК-лигазы фага Т4 (Takara Shuzo). С использованием полученного в качестве матрицы и ДНК-праймеров Р16 и Р26 ПЦР проводили в цикле, включающем реакции при 94°С в течение 0,5 минуты, 55°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 4 минут, что повторяли на протяжении 30 циклов. В результате при использовании HindIII или SalI в качестве рестриктаз был получен амплифицированный фрагмент длиной 0,6 т.п.н. или 1,5 т.п.н., соответственно. Нуклеотидные последовательности данных амплифицированных фрагментов были напрямую определены с использованием ДНК-праймеров Р16-Р28 (SEQ ID NO 16-28). Таким образом, полноразмерная нуклеотидная последовательность гена treY Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 была установлена, как это показано в SEQ ID NO 31. Аминокислотная последовательность, кодируемая данной нуклеотидной последовательностью, показана в SEQ ID NO 31 и 32.

При определении уровня гомологии последовательности упомянутого выше гена treY по отношению к гену treY Arthrobacter sp. (GenBank, депозитарный №D63343), гену treY Brevibacterium helvolum (GenBank, депозитарный №AF039919) и гену treY Rhizobium sp. (GenBank, депозитарный №D78001) нуклеотидная последовательность продемонстрировала уровни гомо