Способ получения l-аланил-l-глутамина

Способ получения l-аланил-l-глутамина

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к простому и более дешевому способу получения дипептидов.

Предпосылки изобретения

Дипептиды находят применение в различных областях. Например, дипептиды используют в качестве исходных соединений при получении фармацевтических препаратов и функциональных продуктов питания. Например, L-аланил-L-глутамин используется в качестве компонента в не содержащих сыворотку средах, поскольку он является более стабильным и более растворимым в воде, чем L-глутамин.

Обычно дипептиды получают химическим синтезом. Конкретно известны следующие способы. Применяют N-бензилоксикарбонилаланин (в последующем относится к «Z-аланину») и защищенный L-глутамин (Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961) и Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), применяют Z-аланин и защищенный метиловый эфир L-γ-глутаминовой кислоты (Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964), применяют эфир Z-аланина и незащищенный глутамин (патент Японии-1-96194А) и синтезируют производное N-(2-замещенного)пропионилглутамина в качестве промежуточного продукта с использованием 2-замещенного пропионилгалогенида в качестве исходного соединения (патент Японии-6-234715А).

Однако для всех этих способов необходимо введение и удаление защитных групп или синтез промежуточных соединений, в результате ни один из них не является преимущественным и полностью удовлетворительным для промышленного производства.

В качестве показательных способов получения дипептидов с использованием ферментов известна реакция конденсации с использованием N-защищенного-С-незащищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного-С-защищенного аминного компонента (в дальнейшем «реакция 1») и реакция замещения с использованием N-защищенного-С-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного-С-защищенного аминного компонента (в дальнейшем «реакция 2»). Примером реакции 1 является способ получения метилового эфира Z-аспартилфенилаланина из Z-аспарагиновой кислоты и метилового эфира фенилаланина (патент Японии-53-92729А). Пример реакции 2 представляет способ получения ацетилфенилаланиллейцинамида из этилового эфира ацетилфенилаланина и лейцинамида (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Имеется очень мало сообщений о применении N-незащищенного-С-защищенного карбоксильного компонента. Пример реакции замещения с использованием N-незащищенного-С-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного-С-защищенного аминного компонента (в дальнейшем «реакция 3») включает, например, способ получения аргиниллейцинамида из этилового эфира аргинина и лейцинамида, как описано в заявке WO 90/01555. Пример реакции замещения с применением N-незащищенного-С-защищенного карбоксильного компонента и N-незащищенного-С-незащищенного аминного компонента (в последующем «реакция 4») включает, например, способ получения тирозилаланина из этилового эфира тирозина и аланина, как описано в Европейском патенте-278787А. Способами получения, которые могут быть самыми дешевыми среди данных способов получения, являются способы с использованием реакций, которые попадают в категорию «реакции 4», когда число защитных групп в используемых компонентах является минимальным.

Однако ферменты, используемые в обычном примере «реакции 4» (Европейский патент-278787А), включают реагенты на основе относительно дорогих препаратов карбоксипептидазы, полученных из дрожжей, относящихся к роду Saccharomyces, или из грибов, или растений. Полученные дипептиды включают аминокислоты с относительно высокой степенью гидрофобности. В Европейском патенте-278787А не раскрывается способ, в котором используется фермент, полученный из дрожжей, отличных от тех, которые относятся к роду Saccharomyces. Кроме того, неизвестен способ, с помощью которого можно было получить аланилглутамин или аланиласпарагин с высокой гидрофильностью. Таким образом, требуется разработка способа получения таких пептидов в промышленном масштабе и при низкой стоимости.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения было обеспечение способа получения дипептида с использованием доступных и дешевых исходных соединений и дешевого источника фермента (культур микроорганизмов, клеток микроорганизмов, продуктов обработанных клеток микроорганизмов) таким путем, который является преимущественным и простым для промышленного производства.

В результате обширных исследований заявители настоящего изобретения установили, что относящиеся к некоторым бактериям и дрожжам микроорганизмы, которые можно культивировать при низкой стоимости, обладают способностью продуцировать дипептиды из эфиров L-аминокислот и L-аминокислот, которые доступны при низкой стоимости, и таким образом осуществили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение обеспечивает:

[1] Способ получения дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты с использованием одного, выбранного из группы, состоящей из культуры микроорганизма, клеток микроорганизма, выделенных из культуры, продукта обработанных клеток микроорганизма и образующего пептид фермента, полученного из микроорганизма, где микроорганизм относится к роду, выбранному из группы, состоящей из Achromobacter, Acinetobactor, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Beijerinckia, Brevibacterium, Clavibacter, Cryseobacterium, Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Kluyvera, Microbacterium, Micrococcus, Mycoplana, Pantoea, Propionibacterium, Listonella, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Sarcina, Serratia, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Streptomyces, Vibrio, Xanthomonas, Bullera, Candida, Cryptococcus, Filobacidium, Geotrichum, Pachysolen, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporoboromyces, Tremella, Torulaspora, Torulopsis, Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Asaia, Zucharibacter, Actinomadura, Kitasatosporia, Micromonospora, Nocardia, Oerskovia, Saccharothrix и Streptoverticillium, и обладает способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты.

[2] Способ получения дипептида по п.[1], описанному выше, дополнительно включающий добавление ингибитора металлофермента к реакционной смеси при получении дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты с использованием одного, выбранного из группы, состоящей из культуры микроорганизма, клеток микроорганизма, выделенных из культуры, продукта обработанных клеток микроорганизма и образующего пептид фермента, полученного из микроорганизма.

[3] Способ получения дипептида по п.п.[1] или [2], описанным выше, где эфир аминокислоты представляет эфир L-аланина.

[4] Способ получения дипептида по одному из п.п.[1]-[3], описанным выше, где аминокислота представляет L-глутамин.

Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения особо изложены ниже и станут понятными из последующего подробного описания изобретения при обращении к прилагаемым фигурам.

Наилучший способ осуществления изобретения

В способе получения дипептида по настоящему изобретению используется средство, выбранное из группы, состоящей из культуры микроорганизма, клеток микроорганизма, выделенных из культуры, продукта обработанных клеток микроорганизма и образующего пептид фермента, полученного из микроорганизма, где микроорганизм обладает способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты. Реакция, лежащая в основе способа получения дипептида по настоящему изобретению, представлена последующей схемой реакции. Как показано на последующей схеме реакции, «дипептид», в том смысле, в котором этот термин здесь используется, относится к пептидному полимеру, который содержит одну пептидную связь.

R₁CH(NH₂)-COOR+H₂N-CH(COOH-R₂)→R₁CH(NH₂)-CONH-CH(COOH)-R₂+ROH

(где R представляет замещенную или незамещенную углеводородную цепь; R₁ представляет боковую цепь эфира аминокислоты, и R₂ представляет боковую цепь аминокислоты).

Эфир аминокислоты является доступным и дешевым соединением. Способ по настоящему изобретению, в котором эфир аминокислоты и незащищенная аминокислота взаимодействуют в качестве исходных соединений в водном растворе с использованием бактерии или дрожжей в качестве источника фермента, является новым способом получения дипептида и представляет совершенно новый подход. Данный способ делает возможным получать дипептид, который пригоден в качестве исходного соединения для получения дешевых фармацевтических препаратов и функциональных продуктов питания.

В последующем пояснения будут представлены в следующем порядке:

[I] Микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты;

[II] Метод получения дипептида и

[III] Выделение и тому подобное ДНК, кодирующей белок, обладающий образующей пептид активностью.

[I] Микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты

Микроорганизмы, которые можно использовать в настоящем изобретении, особым образом не ограничиваются и можно использовать любой микроорганизм, который обладает способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты. Микроорганизмы, которые обладают способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты, включают такие микроорганизмы, которые относятся к родам Achromobacter, Acinetobactor, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Beijerinckia, Brevibacterium, Clavibacter, Cryseobacterium, Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Kluyvera, Microbacterium, Micrococcus, Mycoplana, Pantoea, Propionibacterium, Listonella, Rhizobium, Rhodococcus, Salmonella, Sarcina, Serratia, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Streptomyces, Vibrio, Xanthomonas, Bullera, Candida, Cryptococcus, Filobacidium, Geotrichum, Pachysolen, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporoboromyces, Tremella, Torulaspora, Torulopsis, Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Asaia, Zucharibacter, Actinomadura, Kitasatosporia, Micromonospora, Nocardia, Oerskovia, Saccharothrix или Streptoverticillium. В частности, в качестве примера можно привести следующие микроорганизмы.

Achromobacter delmarvae FERM BP-6988

Acinetobactor johnsonii ATCC 9036

Aeromonas salmonicida ATCC 14174

Agrobacterium tumefaciens IFO 3058

Alcaligenes faecalis ATCC 8750

Arthrobacter citreus ATCC 11624

Beijerinckia indica ATCC 9037

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Clavibacter michiganense ATCC 7429

Cryseobacterium meningosepticum ATCC 13253

Escherichia coli ATCC 13071

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Erwinia amylovora IFO 12687

Flavobacterium resinovorum ATCC 12524

Kluyvera citrophila FERM BP-6564

Microbacterium imperiale ATCC 8365

Micrococcus luteus ATCC 11880

Mycoplana bullata ATCC 4278

Pantoea ananatis ATCC 23822

Propionibacterium shermanii FERM BP-8100

Listonella anguillarum ATCC 19264

Rhizobium radiobacter ATCC 4720

Rhodococcus rhodochrous ATCC 21198

Salmonella typhimurium FERM BP-6566

Sarcina lutea FERM BP-6562

Serratia grimesii ATCC 14460

Staphylococcus aureus ATCC 12600

Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13270

Streptomyces lavendulae ATCC 11924

Vibrio tyrogenes FERM BP-5848

Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568

Bullera alba FERM BP-8099

Candida krusei IFO 0011

Cryptococcus terreus IFO 0727

Filobacidium capsuligenum IFO 1119

Geotrichum amycelium ATCC 56046

Pachysolen tannophilus IFO 1007

Rhodosporidium dibovatum IFO 1829

Rhodotorula minuta IFO 0879

Saccharomyces unisporus IFO 0724

Sporoboromyces salmonicolor IFO 1038

Tremella foliacea IFO 9297

Torulaspora delbrueckii IFO 1083

Torulopsis ingeniosa FERM BP-8098

Gluconacetobacter liquefaciens IFO 12388

Acetobacter orleanensis IFO 3223

Acetobacter pasteurianus ATCC 9325

Gluconobacter oxydans ATCC 621

Gluconobacter oxydans IFO 3171

Gluconacetobacter hansenii JCM 7643

Asaia ethanolifaciens FERM BP-6751

Zucharibacter floricola FERM BP-6752

Actinomadura madurae ATCC 19425

Kitasatosporia griseola IFO 14371

Micromonospora chersina ATCC 53710

Nocardia globerula ATCC 21602

Oerskovia turbata FERM BP-8122

Saccharothrix australiensis IFO 14444

Streptoverticillium mobaraensis IFO-13819

Среди этих штаммов те штаммы, для которых приведены номера в АТСС, находятся на хранении в Американской коллекции типовых культур (P.O. Box 1549, Manassas VA 20110, США), и они предоставляются соответственно их номерам. Среди этих штаммов те штаммы, для которых приведены номера IFO, находятся на хранении в Институте ферментации, Osaka, Foundation (17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Япония), и они предоставляются соответственно их номерам. Среди этих штаммов те штаммы, для которых приведены номера JCM, находятся на хранении в Институте физических и химических исследований (2-1, Hirosawa, Wako-shi, Saitama-ken 351-0106, Япония), и они предоставляются соответственно их номерам.

Среди тех штаммов, для которых приведены номера FERM, находятся микроорганизмы, которые помещены на хранение в Национальный институт передовой индустриальной науки и технологии в Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония), и им присвоены соответствующие номера. Первоначальное депонирование Achromobacter delmarvae FERM BP-6988, осуществленное 16 января 1998 года, было переведено на международное депонирование 6 января 2000 года. Первоначальное депонирование Kluyvera citrophila FERM BP-6564, осуществленное 23 апреля 1985 года, было переведено на международное депонирование 2 ноября 1998 года. Первоначальное депонирование Propionibacterium shermanii FERM BP-8100, осуществленное 4 декабря 1987 года, было переведено на международное депонирование 1 июля 2002 года. Первоначальное депонирование Salmonella typhilium FERM BP-6566, осуществленное 11 июля 1987 года, было переведено на международное депонирование 2 ноября 1998 года. Первоначальное депонирование Sarcina lutea FERM BP-6562, осуществленное 20 января 1984 года, было переведено на международное депонирование 2 ноября 1998 года. Первоначальное депонирование Vibrio tyrogenes FERM BP-5848, осуществленное 25 апреля 1983 года, было переведено на международное депонирование 4 марта 1997 года. Первоначальное депонирование Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568, осуществленное 14 июня 1995 года, было переведено на международное депонирование 14 июня 1996 года. Первоначальное депонирование Bullera alba FERM BP-8099, осуществленное 24 декабря 1984 года, было переведено на международное депонирование 1 июля 2002 года. Первоначальное депонирование Torulopsis ingeniosa FERM BP-8098, осуществленное 24 августа 1970 года, было переведено на международное депонирование 5 июля 2002 года. Первоначальное депонирование Asaia ethanolifaciens FERM BP-6751 (указание микроорганизма; Bacterium 528 AJ14757) и Zucharibacter floricola FERM BP-6752 (указание микроорганизма; Bacterium S877 AJ14758), осуществленное 18 июня 1998 года, было переведено на международное депонирование 14 июня 1999 года. Oerskovia turbata FERM BP-8122 было передано на международное хранение 22 июля 2002 года.

В качестве данных микроорганизмов можно использовать штаммы дикого типа или мутантные штаммы. В качестве данных микроорганизмов можно использовать даже рекомбинантные штаммы, полученные такими генетическими способами, как слияние клеток или генная инженерия и тому подобное.

Клетки такого организма можно получить культивированием или размножением микроорганизмов в подходящей среде. Среда может быть любой средой, в которой возможно размножение микроорганизма. Например, среда может быть обычной средой, которая содержит источник углерода, источник азота, источник фосфора, источник серы и неорганические ионы, и дополнительно, если необходимо, источник органических питательных веществ, которые обычно используются.

Например, в качестве источника углерода можно использовать любой источник углерода, при условии, что вышеуказанные микроорганизмы могут его использовать. В частности, можно использовать такие сахара, как глюкоза, фруктоза, мальтоза и амилоза; такие спирты, как сорбит, этанол и глицерин; такие органические кислоты, как фумаровая кислота, лимонная кислота, уксусная кислота и пропионовая кислота, а также их соли; такие углеводороды, как парафины, или их смеси.

В качестве источника азота можно использовать такие неорганические соли аммония, как сульфат аммония и хлорид аммония; такие органические соли аммония, как фумарат аммония и цитрат аммония; такие нитраты, как нитрат натрия и нитрат калия; такие органические азотсодержащие соединения, как пептон, дрожжевые экстракты, мясные экстракты и жидкость после замачивания кукурузы или их смеси.

Кроме того, в качестве подходящих смесей можно использовать неорганические соли, соли редких металлов, витамины и подобные источники питательных веществ, которые применяют в обычных средах.

Условия культивирования особым образом не ограничиваются. Например, культивирование можно проводить в аэробных условиях, тщательно контролируя значение рН и температуру в пределах рН от 5 до 8 и температуры от 15°С до 40°С в течение от примерно 12 ч до примерно 48 ч.

[II] Способ получения дипептидов

Способ получения дипептида по настоящему изобретению включает получение дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты с использованием культуры микроорганизма, который обладает способностью продуцировать дипептид из эфира аминокислоты и аминокислоты, клеток микроорганизма, выделенных из культуры, продукта обработанных клеток микроорганизма или образующего пептид фермента, полученного из микроорганизма.

Образующий пептид фермент, продуцируемый микроорганизмом, обладает активностью продуцирования дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты.

Способ действия образующего пептид фермента, продуцированного микроорганизмом, из эфира аминокислоты и аминокислоты может быть способом, при котором субстраты непосредственно вносят в среду при одновременном культивировании вышеуказанного микроорганизма. Альтернативно можно использовать способ, при котором клетки выделяют из среды центрифугированием после завершения культивирования или из культуры микроорганизма, и клетки как они есть или после их отмывания ресуспендируют в буфере и к полученному добавляют эфир аминокислоты и аминокислоту. Альтернативно можно применять клетки, иммобилизованные известным способом, таким как способ с полиакриламидным гелем, способ с каррагеном или способ с гелем из альгината.

Кроме того, можно использовать продукт обработанных клеток микроорганизма, такой как фрагменты клеток, обработанные ацетоном клетки микроорганизма или лиофилизованные клетки микроорганизма. Для разрушения клеток микроорганизма можно использовать разрушение ультразвуком, разрушение прессом Френча, разрушение с помощью стеклянных шариков или подобный метод. Кроме того, в случаях, когда проводят лизис, можно использовать метод с использованием лизоцима из яичного белка, метод с использованием обработки пептидазой или их подходящие комбинации.

Кроме того, образующий пептид фермент можно выделить из продукта обработанных клеток микроорганизма, и образующий пептид фермент можно использовать в виде раствора неочищенного фермента, или, если необходимо, фермент можно очистить перед использованием. В качестве метода очистки фермента из культуры можно использовать обычный метод очистки фермента. В частности, вышеуказанный образующий пептид фермент можно очистить проведением следующих стадий: осаждения клеток центрифугированием или тому подобное, разрушения клеток механическим методом, таким как обработка ультразвуком, с помощью стеклянных шариков или диноизмельчителя, удаления твердого вещества, такого как клеточный дебрис, центрифугированием с получением неочищенного фермента и затем проведения фракционирования ультрацентрифугированием, высаливания, осаждения органическими растворителями, ионообменной хроматографии, адсорбционной хроматографии, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии и тому подобное.

Следует отметить, что термин «образующий пептид фермент, полученный из микроорганизма» включает не только фермент, полученный вышеуказанной стадией очистки из продукта обработанных клеток микроорганизма, но также ферменты, полученные экспрессией гена фермента в гетерогенном или гомогенном штамме-хозяине, т.е. полученные методами так называемой генной инженерии.

То есть, можно использовать фермент и все такие вещества, которые содержат фермент при условии, что они являются фракциями, которые обладают активностью продуцирования дипептида из эфира аминокислоты и аминокислоты. «Содержащие фермент вещества» в том смысле, в котором этот термин здесь используется, могут представлять собой любое вещество, которое содержит фермент, и включают в качестве конкретных форм культуру микроорганизма, который продуцирует фермент, клетки микроорганизмов, выделенные из культуры, продукт обработанных клеток микроорганизма и тому подобное. Культура микроорганизма представляет материал, полученный при культивировании микроорганизма и, в частности, означает смесь клеток микроорганизма, среду, использованную для культивирования микроорганизма, и вещество, продуцированное культивированным микроорганизмом. Кроме того, клетки микроорганизма можно отмыть и использовать в виде отмытых клеток микроорганизма. Дополнительно продукт обработанных клеток включает разрушенные клетки микроорганизма, лизированные клетки микроорганизма, лиофилизированные клетки микроорганизма и тому подобное и, кроме того, неочищенные ферменты, выделенные обработкой клеток микроорганизма, и очищенный фермент, полученный дополнительной очисткой сырого фермента. В качестве очищенного фермента можно использовать частично очищенные ферменты, полученные различными методами очистки. Также можно использовать иммобилизованные ферменты, полученные иммобилизацией частично очищенных ферментов методом с образованием ковалентных связей, адсорбционным методом, методом включения и тому подобное. Кроме того, некоторые микроорганизмы подвергаются лизису уже во время культивирования. В этом случае можно использовать супернатант культуры в качестве материала, который содержит фермент.

Следует отметить, что в случае, когда используют культуру, культивированные клетки микроорганизма, отмытые клетки микроорганизма, продукт обработанных клеток микроорганизма, полученный разрушением или лизированием клеток микроорганизма, часто в материале находятся ферменты, которые не принимают участия в образовании пептидов, а, напротив, расщепляют продуцированный пептид. В этом случае иногда является предпочтительным внесение ингибитора металлофермента, например ингибитора металлопротеазы, такого как этилендиаминотетрауксусная кислота (ЭДТА). Количество для внесения находится в пределах от 0,1 миллимоль (мМ) до 100 мМ, предпочтительно от 1 мМ до 50 мМ.

Что касается количества фермента или материала, содержащего фермент, которое следует использовать, то достаточными являются количества, при которых проявляется желаемый эффект (в последующем «эффективное количество»). Эффективное количество может легко определить специалист в данной области при проведении простого предварительного опыта. Например, в случае, когда используют отмытые клетки микроорганизма, эффективное количество составляет от 1 г (в последующем «г») до 500 г на литр реакционной смеси.

Что касается эфира аминокислоты, то можно применять любой эфир аминокислоты при условии, что он вместе с L-аминокислотой может образовать дипептид в соответствии со субстратной специфичностью образующего пептид фермента. Примеры подобных эфиров включают метиловые эфиры, этиловые эфиры, н-пропиловые эфиры, изопропиловые эфиры, н-бутиловые эфиры, изобутиловые эфиры, трет-бутиловые эфиры и т.д. L-аминокислот. Можно также использовать не только эфиры L-аминокислот, соответствующих встречающемуся в природе типу аминокислот, но также эфиры L-аминокислот или D-аминокислот, не соответствующих встречающемуся в природе типу аминокислот, или их производные. По настоящему изобретению в качестве эфиров аминокислоты предпочтительно использовать эфиры L-аланина. Аминокислота особым образом не ограничивается, и можно использовать любую аминокислоту при условии, что она вместе с эфиром аминокислоты может образовать дипептид в соответствии со субстратной специфичностью образующего пептид фермента. Например, аминокислоты включают L-аминокислоты, С-защищенные L-аминокислоты, D-аминокислоты, С-защищенные D-аминокислоты, амины и тому подобное. Кроме того, в качестве примера можно привести не только амины встречающегося в природе типа, но также амины не встречающегося в природе типа или их производные. Кроме того, в качестве аминокислот можно использовать не только аминокислоты встречающегося в природе типа, но и аминокислоты не встречающегося в природе типа или их производные. В дополнение к α-аминокислотам можно привести примеры β-, γ-и ω-аминокислот и т.д. По настоящему изобретению предпочтительно использовать в качестве аминокислоты L-глутамин.

Концентрации эфира аминокислоты и аминокислоты исходных соединений составляют каждая от 1 мМ до 10 М, предпочтительно от 0,05 М до 2 М. В некоторых случаях является предпочтительным, чтобы аминокислоту добавляли в количестве, эквимолярном или в молярном избытке по отношению к эфиру аминокислоты. Кроме того, если необходимо, например, если субстраты в высоких концентрациях ингибируют реакцию, то субстраты можно вносить последовательно после разбавления до концентраций, которые не оказывают на реакцию ингибирующее действие.

Температура реакции равняется от 3°С до 70°С, предпочтительно от 5°С до 50°С. Значение рН реакционной смеси составляет 2-12, предпочтительно 3-11. Таким образом, при проведении реакции в течение от 2 ч до 48 ч дипептид продуцируется и накапливается в реакционной смеси. Образовавшийся дипептид выделяют обычным методом и, если необходимо, очищают.

[III] Выделение и тому подобное ДНК, кодирующей белок, обладающий образующей пептид активностью

[III-1] Выделение ДНК

Микроорганизмы, используемые в настоящем изобретении, обладают способностью синтезировать дипептиды из эфиров аминокислот и аминокислот. Также возможно получать белки, которые образуют дипептиды из эфиров аминокислот и аминокислот (образующие пептид ферменты), выделением ДНК, кодирующей белки, которые образуют дипептиды из эфиров аминокислот и аминокислот из вышеуказанных микроорганизмов при использовании метода генной инженерии и получением трансформантов. В последующем будет описано воплощение метода выделения ДНК, кодирующей белок, который образует дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты, из микроорганизма и получения трансформанта.

Вначале образующий пептид фермент получают из вышеуказанного микроорганизма, как описано выше, в разделе [II] «Способ получения дипептидов». И затем определяют аминокислотную последовательность очищенного образующего пептид фермента с использованием метода Эдмана (Edman P., Acta Chem., Scand., 4, 227 (1950)), применяя секвенатор производства Applied Biosystems, Inc. Определяют аминокислотную последовательность 30 остатков с N-конца очищенного образующего пептид фермента и на основе установленной аминокислотной последовательности можно вывести последовательность оснований в ДНК, которая кодирует образующий пептид фермент. Для выведения последовательности оснований, входящих в состав ДНК, имеются принятые универсальные кодоны.

На основе выведенной последовательности оснований синтезируют молекулу ДНК примерно из 30 пар оснований. Метод синтеза молекулы ДНК раскрывается в Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981). Кроме того, молекулу ДНК можно синтезировать с использованием синтезатора производства Applied Biosystems, Inc. Молекулу ДНК можно использовать в качестве зонда, когда полноразмерную ДНК, кодирующую образующий пептид фермент, выделяют из хромосомной библиотеки генов микроорганизма. Альтернативно молекулу ДНК можно использовать в качестве праймера, когда ДНК, кодирующую образующий пептид фермент, амплифицируют с помощью ПЦР. Однако ДНК, которая амплифицирована с использованием ПЦР, не включает полноразмерную ДНК, кодирующую образующий пептид фермент, и таким образом полноразмерную ДНК, кодирующую образующий пептид фермент, выделяют из хромосомной библиотеки генов микроорганизма с использованием ДНК, амплифицированной с помощью ПЦР.

Метод ПЦР описан у White T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989) и т.д. Метод получения хромосомной ДНК и метод выделения желаемой молекулы ДНК из библиотеки генов описаны в «Molecular Cloning», 2^nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989), и т.д.

Метод определения последовательности оснований ДНК, кодирующей выделенный образующий пептид фермент, описан в «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley & Sons, Inc. (1985). Кроме того, последовательность оснований можно определить с использованием секвенатора производства Applied Biosystems, Inc.

ДНК, которую можно использовать по настоящему изобретению, не ограничивается молекулами ДНК, полученными, как описано выше. Даже те молекулы ДНК, которые получают внесением искусственной мутации в ДНК, кодирующую образующий пептид фермент, выделенную из хромосомной ДНК клетки определенного микроорганизма, являются теми ДНК, которые можно использовать по настоящему изобретению, если такие молекулы ДНК кодируют образующий пептид фермент. Метод, который часто используют в качестве метода искусственного внесения мутации, представляет сайт-направленный мутагенез, описанный в Method. in Enzymol., 154 (1987).

Кроме того, ДНК, которую можно использовать по настоящему изобретению, также включает ДНК, имеющую последовательность оснований, которая гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом (ДНК или РНК), имеющим последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований ДНК, выделенной из хромосомной ДНК, как описано выше, и кодирующую белок, обладающий активностью продуцирования пептида. Термин «в жестких условиях» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к условиям, при которых образуется так называемый специфический гибрид, и не образуется неспецифический гибрид. Точно определить эти условия в цифровых значениях трудно. Например, можно упомянуть условия, при которых молекулы ДНК, имеющие высокую степень гомологии, например, 50% или выше, предпочтительно 80% или выше, более предпочтительно 90% или выше, гибридизируются друг с другом, а молекулы ДНК, имеющие более низкую степень гомологии, чем эта, не гибридизируются друг с другом, или обычные условия для промывания при постановке Саузерн-блоттинга, при которых гибридизацию проводят при 60°С и концентрации соли, соответствующей 1×SSC и 0,1% SDS, предпочтительно 60°С, 0,1×SSC и 0,1% SDS, более предпочтительно 65°С, 0,1×SSC и 0,1% SDS. Активность образующего пептид фермента уже пояснялась выше. Однако в случае последовательности оснований, которая гибридизуется с комплементарной последовательностью оснований в жестких условиях, желательно, чтобы белок, кодируемый ею, сохранял ферментативную активность, составляющую 10% или выше, более предпочтительно 50% или выше от ферментативной активности белка, имеющего исходную аминокислотную последовательность, в условиях при 50°С и значение рН 8.

Кроме того, по настоящему изобретению также можно использовать белки, в основном кодируемые выделенной ДНК. Следовательно, в настоящем изобретении можно также использовать ДНК, кодирующую белок, который включает замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, кодируемой выделенной ДНК, и который обладает образующей пептид активностью, которая катализирует реакцию, в которой образуется дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты. Термин «несколько» в данном случае относится к числу аминокислотных остатков в ряду, где трехмерная структура белка или активность образующего пептид фермента значительно не затрагивается или не снижается. Конкретно «несколько» означает от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 30, более предпочтительно от 2 до 10. Активность образующего пептид фермента уже была пояснена выше. Однако в случае аминокислотной последовательности, которая включает замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одной или нескольких аминокислот, желательно, чтобы аминокислотная последовательность сохраняла ферментативную активность, составляющую 10% или выше, более предпочтительно 50% или выше от активности белка, имеющего исходную аминокислотную последовательность, в условиях при 50°С и значении рН 8.

Как описано выше, когда ДНК выделяют из микроорганизма, то преимущественно по данному изобретению можно использовать следующие молекулы ДНК. Следует отметить, что, например, определенная последовательность оснований выделенной ДНК названа последовательностью оснований y, а аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью оснований, названа аминокислотной последовательностью Y. Молекулами ДНК, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются:

(i) ДНК, состоящая из последовательности оснований y;

(ii) ДНК, которая гибридизуется с последовательностью оснований, комплементарной последовательности оснований y, в жестких условиях и которая кодирует белок, обладающей образующей дипептид активностью, которая катализирует реакцию, в которой дипептид образуется из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты;

(iii) ДНК, которая кодирует белок, обладающий аминокислотной последовательностью Y, и

(iv) ДНК, которая кодирует белок, обладающий аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности Y, которая включает замену, делецию, вставку, добавление или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладающая образующей пептид активностью, которая катализирует реакцию, в которой образуется дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты.

[III-2] Получение трансформантов

Ниже будет пояснено конструирование трансформантов, которые экспрессируют белок, обладающий образующей пептид активностью. Известен ряд случаев, когда ферменты, физиологически активные вещества и подобные подходящие белки получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Применение технологии рекомбинантной ДНК облегчает массовую продукцию полезных белков, находящихся в природе в минимальных количествах.

Предпочтительные примеры трансформантов, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, включают трансформанты, которые могут экспрессировать белки, такие как описанные ниже в (А), (В) и (С):

(А) белок, который обладает аминокислотной последовательностью Y;

(В) белок, который обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности Y, которая включает замену, делецию, вставку, добавку или инверсию одной или нескольких аминокислот и обладает образующей пептид активностью, которая катализирует реакцию, в которой образуется дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты и

(С) белок, кодированный ДНК, которая гибридизируется с полинуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований y, в жестких условиях и кодирует белок, обладающий образующей пептид активностью, которая катализирует реакцию, в которой образуется дипептид из эфира L-аминокислоты и L-аминокислоты.

Для получения трансформантов, которые экспрессируют белки (А)-(С), обладающие образующей пептид активностью, необходимо только, чтобы молекулы ДНК по (i), (ii), (iii) и (iv), указанные выше в связи с пояснениями к разделу [III-1] «Выделение ДНК» были введены в клетки-хозяева. То есть ДНК по (i), (ii), (iii) или (iv) включают в экспрессирующий вектор, который может экспрессироваться в клетке-хозяине и быть введен в клетку-хозяина.

Мутацию, упомянутую выше в (В), можно получить, например, сайт-направленным мутагенезом, модифицируя последовательность оснований гена фермента по настоящему изобретению так, чтобы аминокислоту в определенном сайте гена фермента можно было подвергнуть замене, делеции, вставке или добавлению. Модифицированную, как описано выше, ДНК можно также получить обычной известной мутационной обработкой. Мутационная обработка включает, например, метод, в котором ДНК, которая кодирует фермент по настоящему изобретению, обрабатывают в условиях in vitro гидроксиламином или тому подобное, и метод, в котором бактерию, которая относится к роду Escherichia, включающую ДНК, кодирующую фермент по настоящему изобретению, обрабатывают мутагеном, обычно используемым для осуществления искусственной мутации, таким как ультрафиолетовые лучи, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или азотистая кислота.

В условиях, когда белок продуцируется в больших количествах при использовании технологии рекомбинантной ДНК, предпочтительное воплощение включает способ, при котором молекулы белка связываются с образованием тел включения белка в трансформанте, который продуцирует белок. Данный метод экспрессирующей продукции имеет преимущество, заключающееся, например, в том, что желаемый белок защищен от расщепления под действием протеаз, которые находятся в клетках микроорганизма, и что желаемый белок можно легко очистить разрушением клеток микроорганизма и последующим центрифугированием.

Полученное таким образом тело включения белка солюбилизируют с помощью белкового модификатора и превращают в физиологически активный белок, который подвергается правильной укладке после проведения активирующего восстановления при удалении модификатора. Имеется много примеров, включая, например, активирующее восстановление человеческого интерлейкеина-2 (патент Японии-61-257931А).

Для получения белка активного типа из тела включения белка необходимо проведение ряда операций, таких как солюбилизация и активирующее восстановление, и таким образом операция становится более сложной, че