Новая фармацевтическая композиция

Новая фармацевтическая композиция

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буфере, пригодном для поддержания значения рН раствора в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Такую композицию предпочтительно применяют для профилактики и лечения заболеваний, связанных с эритропоэзом.

Эритропоэз представляет собой процесс образования эритроцитов, который служит для восполнения клеточной деструкции. Эритропоэз представляет собой контролируемый физиологический механизм, в результате которого образуется количество эритроцитов, достаточное для соответствующего насыщения ткани кислородом. Встречающийся в естественных условиях человеческий эритропоэтин (hEPO) продуцируется в почке и представляет собой гуморальный плазматический фактор, стимулирующий образование эритроцитов (Р.Carnot и С.Deflandre, C.R.Acad. Sci. 143: 432 (1906); A.J.Erslev, Blood 8: 349 (1953); K.R.Reissmann, Blood 5: 372 (1950); L.O.Jacobson, E.Goldwasser, W.Freid и L.F.Pizak, Nature 179: 6331-6334 (1957)). Встречающийся в естественных условиях ЕРО стимулирует деление и дифференцировку коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге и проявляет свою биологическую активность посредством связывания с рецепторами на эритоидных предшественниках (B.S.Krantz, Blood 77: 419 (1991)).

Эритропоэтин был получен путем биологического синтеза с использованием методики рекомбинантной ДНК (J.C.Egrie, T.W.Strickland, J.Lane и др., Immunobiol. 72: 213-224 (1986)), и он представляет собой продукт клонированного гена человеческого ЕРО, который встраивали и экспрессировали в клетках ткани яичника китайского хомячка (СНО-клетки). Первичная структура доминирующей полностью процессированной формы hEPO представлена в SEQ ID NO:1. В ней присутствуют два дисульфидных мостика между Cys⁷-Cys¹⁶¹ и Cys²⁹-Cys³³. Молекулярная масса полипептидной цепи ЕРО без фрагментов сахара составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЕРО примерно 40% молекулярной массы приходится на долю углеводных групп, которые приводят к гликозилированию протеина в сайтах гликозилирования протеина (H.Sasaki, В.Bothner, A.Dell и М.Fukuda, J.Biol. Chem. 262: 12059 (1987)).

Поскольку человеческий эритропоэтин играет ключевую роль в образовании эритроцитов, то этот гормон можно применять при лечении заболеваний крови, для которых характерно низкое производство эритроцитов или производство аномальных эритроцитов. В клинических условиях ЕРО применяют для лечения анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (J.W.Eschbach, J.C.Egri, M.R.Downing и др., NEJM 316: 73-78 (1987); J.W.Eschbach, M.H.Abdulhadi, J.K.Browne и др.. Ann. Intern. Med.111: 992 (1988); J.C. Egrie, J.W. Eschbach, T.McGuire, J.W.Adamson, Kidney Intl. 33: 262 (1988); V.S.Lim, R.L.Degowin, D.Zavala и др.. Ann. Intern. Med. 110: 108-114 (1989)) и пациентов, страдающих СПИДом, и пациентов, страдающих раком и подвергающихся химиотерапии (R.P.Danna, S.A.Rudnick, R.I. Abels в: Garnick M.B. (ред.) Erythropoietin in Clinical Application - An International Perspective, New York, NY: Marcel Dekker; стр.301-324 (1990)).

Известные фармацевтические композиции имеют по меньшей мере один из перечисленных ниже недостатков:

- Они представляют собой лиофилизаты. Помимо того, что процесс их производства является сложным, недостатком лиофилизатов является то, что их необходимо восстанавливать перед осуществлением инъекции людям. Это приводит к необходимости осуществления медицинским персоналом дополнительных операций, что является затруднительным и сопряжено с риском неправильного обращения с фармацевтическим продуктом;

- Они содержат в качестве добавки человеческий сывороточный альбумин. Поскольку человеческий сывороточный альбумин представляет собой продукт, полученный из общей воды организма человека, то существует риск возникновения вирусных инфекций в результате загрязнения альбуминового препарата. Возможны также аллергические реакции.

- Все поступающие в настоящее время в продажу композиции, содержащие эритропоэтин, являются нестабильными при повышенных температурах, т.е. при температурах, превышающих температуру холодильника, которая, как правило, составляет 2-8°С. Поэтому их необходимо хранить в холодильнике (2-8°С) и нельзя хранить при комнатной температуре (приблизительно 20°С). Это приводит к дополнительным расходам, связанным с процессом хранения при пониженной температуре и необходимостью иметь для этого соответствующее оборудование, а также затрудняет применение лекарственного средства. Понятие «нестабильный» в контексте настоящего описания обозначает, что хранение при повышенных температурах, например, при 25°С, в течение продолжительного периода времени (например, в течение нескольких месяцев или более 6 месяцев) приводит к разложению протеина. В контексте настоящего описания понятие «разложение» обозначает физические изменения (например, агрегацию или денатурацию) и химические изменения (например, окисление или в целом модификацию химических связей) молекулы протеина, которые, как известно, происходят прежде всего при повышенных температурах (выше 8°С). Инкубация протеина при температурах, близких или превышающих его температуру фазового перехода (которую называют также температурой плавления), приводит к развертыванию протеина, т.е. при этом теряется нативная структура и биологическая активность полипептида. Температура фазового перехода строго коррелирует с термостабильностью протеина и зависит от окружающей среды, в которой находится протеин (например, от значения рН, присутствия солей, ионной силы, наличия буферной субстанции и т.п.). Например, денатурация может приводить к агрегации молекул эритропоэтина, т.е. образованию димеров (с ковалентными или нековалентными связями), агрегатов более высокого порядка и даже отдельных частиц. Это приводит к снижению эффективности лекарственного средства и может вызывать нежелательные побочные действия после инъекции людям.

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача создать фармацевтическую композицию, которая позволяет минимизировать или устранить указанные выше недостатки.

Согласно настоящему изобретению задачу решают путем создания фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буферном растворе, имеющем значение рН в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что включение эритропоэтина в такую композицию улучшает его стабильность при температурах, превышающих температуру холодильника (2-8°С), прежде всего при комнатной температуре (т.е. ниже 25°С), и даже при более высоких температурах, например при 40°С. Это означает, что композицию можно хранить без охлаждения в течение продолжительного периода времени и при этом не происходит существенной потери активности и существенного разложения.

Если не указано иное, то понятия, применяемые для иллюстрации и определяющие значение и объем различных терминов, используемых при описании настоящего изобретения, имеют следующие значения.

Понятие «многозарядный неорганический анион» обозначает неорганический анион, имеющий два или более отрицательных зарядов на молекулу, например, анион сульфата SO₄ ^2- или анион фосфата, т.е. кислый фосфат HPO₄ ^2-. Многозарядный неорганический анион можно добавлять в форме соответствующей соли, например натриевой соли, калиевой соли и их смесей и/или в форме буфера, например, фосфатного буфера.

Понятие «изоосмотический или изотонический» обозначает раствор, который можно смешивать с общей водой организма, не оказывая влияния на ее компоненты. Растворы, которые являются изотоническими с кровью, такие как 0,9%-ный раствор хлорида натрия, имеют такое же осмотическое давление, что и сыворотка, и они не влияют на мембраны эритроцитов. Как правило, растворы, которые являются изотоническими с кровью, имеют осмотическое давление приблизительно 290 мОсм/кг Н₂О.

Понятие «сильная неорганическая кислота» обозначает неорганические кислоты, диссоциация которых в 1н. растворе составляет от 20 до 100%, например, H₂SO₄.

Понятие «фармацевтически приемлемый» в контексте настоящего описания означает, что буфер или соли являются приемлемыми с точки зрения токсичности.

Понятие «разбавитель» обозначает входящий в состав медицинского препарата ингредиент, который не обладает фармакологической активностью, но который является необходимым или желательным с фармацевтической точки зрения. Например, разбавитель может представлять собой жидкость для растворения предназначенного(ых) для инъекции лекарственного(ных) средства(в), например воду.

Понятие «растворители» относится к жидкости, которая содержит растворенную в ней другую субстанцию, т.е. растворяет ее, например к воде.

Понятие «консерванты» относится к субстанции, которую добавляют в фармацевтическую композицию для предупреждения роста бактерий, например бензалконийхлорид или бензиловый спирт.

Понятие «полиол» относится к любой субстанции, несущей несколько гидроксильных групп, в том числе к многоатомным спиртам и углеводам. Многоатомные спирты включают такие соединения, как сорбит, маннит и глицерин. Углеводы представляют собой циклические молекулы, несущие кето- или альдегидную группу, такие, например, как сахароза или трегалоза.

Понятие «эритропоэтин» или «протеин эритропоэтин» относится к протеину, обладающему in vivo биологической активностью, приводящей к тому, что клетки костного мозга увеличивают продуцирование ретикулоцитов и эритроцитов, который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые описаны ниже.

Понятие «пэгилированный эритропоэтин (Пэг-ЕРО или ПЭГ-ЕРО) относится к протеину эритропоэтину, ковалентно связанному с одним-тремя производными полиэтилена, как это описано ниже.

Понятие «устройство» обозначает приспособление, предназначенное для конкретной цели. В контексте настоящего изобретения цель заключается в осуществлении, поддержании или облегчении введения жидкой фармацевтической композиции.

Описание чертежей

Фиг.1: Первичная структура человеческого ЕРО (165 аминокислот) (SEQ ID NO:1).

Фиг.2: Первичная структура человеческого ЕРО (166 аминокислот) (SEQ ID NO:2).

Фиг.3: Влияние значения рН на термостабильность. Представлен график зависимости температуры фазового перехода от значения рН.

Фиг.4: Влияние ионной силы на термостабильность. Представлен график зависимости температуры фазового перехода от концентрации фосфата.

Фиг.5: Зависимость термостабильности от типа буферной субстанции.

Фиг.6: Приведены данные, свидетельствующие о том, что сульфат является также приемлемым буфером/добавкой при низких значениях рН (например, при рН 6,2), в то время как фосфат при рН 6,2 менее эффективен, чем при рН 7,5. Это свидетельствует о том, что сульфат обеспечивает высокий уровень термостабильности даже при низких значениях рН.

Фиг.7: Зависимость агрегации ПЭГ-ЕРО от значения рН. Образцы ПЭГ-ЕРО после теплового стресса (как описано выше) анализировали с помощью ПААГ-ДСН. Протеины окрашивали серебром. Полоса 1: стандарт молекулярной массы. Полоса 2: рН 5. Полоса 3: рН 5, после восстановления. Полоса 4: рН 6. Полоса 5: рН 6, после восстановления. Полоса 6: рН 6,5. Полоса 7: рН 6,5, после восстановления. Полоса 8: рН 7. Полоса 9: рН 7, после восстановления. Полоса 10: ПЭГ-ЕРО, без теплового стресса.

Фиг.8: Приведены данные о том, что использование ацетилцистеина в концентрации 1 мг/мл в качестве антиоксиданта предупреждает образование агрегатов в условиях теплового стресса. Агрегация ПЭГ-ЕРО в условиях теплового стресса (80°С в течение 20 мин): полоса 1: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5, без стресса; полоса 2: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5, в условиях стресса; полоса 3: ПЭГ-ЕРО при рН 6,2, в условиях стресса; полоса 4: ПЭГ-ЕРО при рН 6,2, в условиях стресса, после восстановления; полоса 5: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5+1 мг/мл N-ацетилцистеина, в условиях стресса; полоса 6: ПЭГ-ЕРО при рН 7,5+1 мг/мл N-ацетилцистеина, в условиях стресса, после восстановления.

Фиг.9: Содержание сиаловой кислоты (NANA) в образцах новых композиций, включающих ПЭГ-ЕРО, хранившихся в течение 6 месяцев при различных температурах.

Фиг.10: Анализ в опытах на мышах биологической активности образцов, содержащих ПЭГ-ЕРО, которые хранились в течение 6 месяцев при различных температурах в 10 мМ фосфате натрия, 40 мМ сульфате натрия, 3% (мас./об.) манните, рН 6,2.

Фиг.11: Сопоставление хроматограмм, полученных методом гель-фильтрации, для образцов, содержащих ПЭГ-ЕРО, которые хранились в течение 6 месяцев при различных температурах в 10 мМ фосфате натрия, 40 мМ сульфате натрия, 3% (мас./об.) манните, рН 6,2 (сверху вниз: буфер, исходный продукт, 4°С, 25°С, 30°С и 40°С).

Более конкретно, настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции, содержащей протеин эритропоэтин, многозарядный неорганический анион в фармацевтически приемлемом буфере, пригодном для поддержания значения рН раствора в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, и необязательно один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой жидкий раствор, например водный раствор. В предпочтительном варианте осуществления указанные выше фармацевтические композиции представляют собой изотонические растворы.

Анион предпочтительно выбирают из анионов сильных неорганических кислот, таких как H₂SO₄, Н₃PO₄ или лимонная кислота. Таким образом, предпочтительные анионы выбирают из группы, включающей сульфат, фосфат и цитрат, предпочтительным является сульфат или фосфат, наиболее предпочтительным является сульфат. Концентрация многозарядного неорганического аниона может составлять от 10 до 200 ммолей/л, например, для сульфатного аниона она может составлять от 10 до 200 ммолей/л.

В качестве буфера, применяемого согласно изобретению для поддержания значения рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,0, предпочтительно от 5,8 до 6,7, более предпочтительно от 6,0 до 6,5 и наиболее предпочтительно на уровне приблизительно 6,2, можно применять обычные буферы на основе органических или неорганических кислот (например, фосфатный буфер, аргинин/Н₂SO₄/Na₂SO₄-буфер или любую другую фармацевтически приемлемую буферную систему). В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит фосфатный буфер или аргинин/Н₂SO₄/Na₂SO₄-буфер, более предпочтительно фосфатный буфер с концентрацией 10-50 ммолей/л. Очевидно, что комбинации этих буферных систем также подпадают под объем настоящего изобретения. Значение рН можно регулировать с помощью соответствующего основания, например, NaOH, в фосфатной буферной системе, и соответствующей кислоты, например, серной кислоты в аргининовой буферной системе, соответственно.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Такие фармацевтически приемлемые эксципиенты можно выбирать из группы, включающей фармацевтически приемлемые соли, разбавители, и/или растворители, и/или консерванты и т.д., например, агенты для регулирования тоничности (агенты, обеспечивающие изотоничность), полиолы, антиоксиданты или неионогенные поверхностно-активные вещества. Примерами таких субстанций являются хлорид натрия, хлорид кальция, сорбит, маннит, глицерин, сахароза, трегалоза, ацетилцистеин, полисорбат 20, полисорбат 80 или плуроник F68.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции могут содержать полиол, выбранный из группы, включающей маннит, сорбит, глицерин, трегалозу и сахарозу, предпочтительно маннит. Концентрация полиола может составлять 1-10% (мас./об.).

Примерами антиоксидантов являются цистеин, метионин, ацетилцистеин или аскорбиновая кислота, предпочтительно метионин. Антиоксиданты, как правило, можно добавлять в концентрации от 0,01 до 0,5% (мас./об.), или, например, в случае метионина, в концентрации 1-20 мМ.

Вышеописанные композиции необязательно могут содержать также обеспечивающий изотоничность агент в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,9 мас.%. Такие соединения известны в данной области; примерами таких агентов являются хлорид натрия или сульфат натрия. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиции представляют собой изотонические растворы. Вышеописанные композиции могут содержать также неионогенные детергенты полисорбат 20, полисорбат 80 или плуроник F68, предпочтительно плуроник F68, например, в количестве до 1% (мас./об.), более предпочтительно до 0,1% (мас./об.), например, от 0,001 до 0,01% (мас./об.).

Вышеописанная композиция может содержать также другие соли, например, до 1 ммоля/л CaCl₂.

Настоящее изобретение относится прежде всего к получению фармацевтических композиций, содержащих в качестве обладающего фармацевтической активностью ингредиента эритропоэтин. Понятие "эритропоэтин" или "протеин эритропоэтин" или "ЕРО" обозначает следующее: указанные понятия относятся прежде всего к гликопротеину, например, человеческому эритропоэтину, например, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или в SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, практически гомологичную указанным последовательностям, биологические свойства которого обусловливают стимуляцию производства эритроцитов и стимуляцию деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. В контексте настоящего описания эти понятия включают такие протеины, которые преднамеренно модифицированы, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза, или в результате случайных мутаций. Эти понятия также включают аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, и аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Эти понятия включают как встречающийся в естественных условиях, так и полученный рекомбинантным путем человеческий эритропоэтин.

Как это подробно описано ниже, методы получения и очистки ЕРО хорошо известны в данной области. Эритропоэтин представляет собой встречающийся в естественных условиях или рекомбинантный протеин, предпочтительно человеческий, который можно получать из любого доступного источника, например, из тканей, путем синтеза протеина, из клеточной культуры с использованием встречающихся в естественных условиях или рекомбинантных клеток. Это понятие включает любой протеин, обладающий активностью эритропоэтина, например, из группы мутеинов или иным образом модифицированных протеинов. Рекомбинантный ЕРО можно получать путем экспрессии в линиях клеток СНО, ВНК (клетки почки детеныша хомяка) или HeLa (культура опухолевых клеток Элен Лейк), методом рекомбинантной ДНК или путем эндогенной активации гена. Методы экспрессии протеинов, включая эндогенную активацию гена, хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах US 5733761, 5641670 и 5733746 и в опубликованных международных заявках на патент WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждого из указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительными видами ЕРО для получения продуктов, содержащих гликопротеин эритропоэтин, являются виды человеческого ЕРО. Более предпочтительно виды ЕРО представляют собой человеческий ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или в SEQ ID NO:2, более предпочтительно аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

Кроме того, эритропоэтин может представлять собой аналог гликопротеина, имеющий от 1 до 6 дополнительных сайтов гликозилирования. Гликозилирование протеина, несущего одну или несколько олигосахаридных групп, происходит в определенных положениях на полипептидном каркасе и оказывает сильное влияние на физические свойства протеина, такие как стабильность протеина, секрецию, внутриклеточную локализацию и биологическую активность. Существует два типа гликозилирования. O-сшитые олигосахариды связываются с остатками серина или треонина, а N-сшитые олигосахариды связываются с остатками аспарагина. Одним из типов олигосахаридов, обнаруженных как в N-сшитых, так и в O-сшитых олигосахаридах, является N-ацетилнейраминовая кислота (сиаловая кислота), принадлежащая к семейству аминосахаров, несущих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота, как правило, представляет собой концевой остаток как на N-сшитых, так и на O-сшитых олигосахаридах и, поскольку она несет отрицательный заряд, она придает гликопротеину кислотные свойства. Человеческий эритропоэтин, имеющий 165 аминокислот, содержит три N-сшитых и одну O-сшитую олигосахаридные цепи, на долю которых приходится приблизительно 40% общей молекулярной массы гликопротеина. Гликозилирование N-сшитыми олигосахаридами происходит на остатках аспарагина в положениях 24, 38 и 83, а гликозилирование O-сшитыми олигосахаридами происходит на остатке серина в положении 126. Концевые остатки сиаловой кислоты модифицируют олигосахаридные цепи. Удаление с помощью ферментов всех остатков сиаловой кислоты из гликозилированного эритропоэтина приводит к потере активности in vivo, но не приводит к потере активности in vitro, поскольку сиалилирование эритропоэтина препятствует его связыванию и последующему клиренсу печеночным связывающим протеином.

Понятие «эритропоэтин», используемое применительно к фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает аналоги человеческого эритропоэтина, имеющие одну или несколько замен в аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина, которые приводят к увеличению количества сайтов связывания с сиаловой кислотой. Такие гликопротеиновые аналоги можно создавать путем сайтнаправленного мутагенеза, приводящего к добавлениям, делециям или заменам аминокислотных остатков, вызывающим увеличение количества или изменение сайтов, пригодных для гликозилирования. Гликопротеиновые аналоги, имеющие содержания сиаловой кислоты, превышающие содержание, характерное для человеческого эритропоэтина, создают путем введения сайтов, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, обусловливающую их биологическую активность. Гликопротеины по настоящему изобретению включают также аналоги, имеющие повышенные уровни присоединения углеводов в сайте гликозилирования, для чего, как правило, осуществляют замену одной или нескольких аминокислот непосредственно вблизи N-сшитого или O-сшитого сайта. Гликопротеины по настоящему изобретению включают также аналоги, имеющие одну или несколько аминокислот, простирающихся от С-конца эритропоэтина и имеющие по меньшей мере один дополнительный углеводный сайт. Протеины эритропоэтины, входящие в состав композиции по настоящему изобретению, включают также аналоги, имеющие аминокислотную последовательность, которая характеризуется перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Такая перегруппировка сайта гликозилирования представляет собой делецию одного или нескольких сайтов гликозилирования в человеческом эритропоэтине и добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, не встречающихся в естественных условиях. Увеличение количества углеводных цепей на эритропоэтине и, следовательно, количества остатков сиаловой кислоты в молекулах эритропоэтина может придавать ценные свойства, такие как более высокая растворимость, повышенная устойчивость к протеолизу, пониженная иммуногенность, большее время полужизни в сыворотке и более высокая биологическая активность. Аналоги эритропоэтина, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, описаны более подробно в заявке на Европейский патент 640619 на имя Elliot, опубликованной 1 марта 1995 г.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит протеины эритропоэтины, имеющие аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере один дополнительный сайт гликозилирования, такие как эритропоэтины, имеющие (но не ограничиваясь ими) последовательность человеческого эритропоэтина, включающую модификацию, выбранную из числа перечисленных ниже модификаций:

Asn³⁰Thr³²,

Asn⁵¹Thr⁵³,

Asn⁵⁷Thr⁵⁹,

Asn⁶⁹,

Asn⁶⁹Thr⁷¹,

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹,

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²,

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²,

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰,

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹,

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹,

Asn¹³⁶Thr¹³⁸,

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰.

Thr¹²⁵ и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

Условные обозначения, используемые в настоящем описании для указания модификации аминокислотной последовательности, означают, что аминокислота(ы) в положении(ях) последовательности соответствующего немодифицированного протеина (например, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 hEPO), указанных верхним(и) индексом(ами) заменены на аминокислоту(ы), указанную(ые) непосредственно перед соответствующим верхним индексом.

Протеин эритропоэтин может являться также аналогом, имеющим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбоксильном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один сайт гликозилирования. Дополнительная аминокислотная последовательность может включать пептидный фрагмент, полученный из карбоксильного конца человеческого относящегося к хориону гонадотропина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей (а) человеческий эритропоэтин, имеющий аминокислотную последовательность SerSerSerSerLysAlaProProProSerLeuProSerProSerArgLeuProGlyProSerAspThrProIleLeuProGln (SEQ ID NO:3), простирающуюся от карбоксильного конца; (б) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ ЕРО; и (в) аналог, указанный в разделе (а), дополнительно включающий Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

Протеин эритропоэтин может также являться аналогом, имеющим аминокислотную последовательность, которая включает перегруппировку по меньшей мере одного сайта гликозилирования. Перегруппировка может представлять собой делецию любого из N-связанных углеводных сайтов в человеческом эритропоэтине и добавление N-связанного углеводного сайта в положение 88 аминокислотной последовательности человеческого эритропоэтина. Предпочтительно гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, включающей Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO и Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ EPO.

В более предпочтительном варианте в качестве протеина эритропоэтина, входящего в состав описанной выше фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может применять также его пэгилированные производные. Пэгилированные производные эритропоэтина и содержащие их композиции известны в данной области и описаны, например, в ЕР-А-539167, ЕР-А-605963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, патенте US 556. ЕР-А-584876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, патентах US 5359030 и 5681811, патенте US 4179337, японском патенте, WO 98/32466, патенте US 5324650. Предпочтительными вариантами видов пэгилированного эритропоэтина являются описанные ниже производные.

В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение относится также к конъюгату эритропоэтина, который содержит описанный выше протеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, имеющие последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную путем добавления 1-6 сайтов гликозилирования или перегруппировки по меньшей мере одного сайта гликозилирования; где эритропоэтин ковалентно связан с «n» поли(этиленгликольными) группами формулы -СО-(СН₂)_х-(OCH₂CH₂)_m-OR, в которых радикал -СО (т.е. карбонил) каждой поли(этилен)гликольной группы образует амидную связь с одной из указанных аминогрупп; R обозначает (низш.)алкил; х равно 2 или 3; m представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900; n равно 1-3; и n и m выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата за вычетом молекулярной массы гликопротеина эритропоэтина составляла от 20 до 100 кДа. В настоящем изобретении предложены также фармацевтические композиции, содержащие описанные выше конъюгаты, в которых содержание конъюгатов, в которых n равно 1, составляет по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно 96% от общего количества всех конъюгатов, содержащихся в композиции.

Более конкретно указанные выше конъюгаты могут быть представлены формулой (I)

где Р обозначает описанный выше остаток протеина эритропоэтина (т.е. не содержащий аминогруппу или аминогруппы, которые образуют амидную связь с карбонилом, представленным в формуле I), обладающие биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга; и где R обозначает (низш.)алкил; х равно 2 или 3; m представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900; n равно 1-3; и n и m выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса конъюгата за вычетом молекулярной массы гликопротеина эритропоэтина составляла от 20 до 100 кДа.

В контексте настоящего описания понятие «(низш.)алкил» обозначет алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, несущую 1-6 атомов углерода. Примерами (низш.)алкильных групп являются метил, этил и изопропил. Согласно настоящему изобретению R может представлять собой любой (низш.)алкил. Предпочтительными являются конъюгаты, в которых R представляет собой метил.

Символ «m» обозначает количество этиленоксидных звеньев (ОСН₂СН₂) в поли(этиленоксидной) группе. Одна этиленоксидная субъединица ПЭГ (полиэтиленгликоль) имеет молекулярную массу приблизительно 44 Да. Таким образом, молекулярная масса конъюгата (за вычетом молекулярной массы ЕРО) зависит от числа «m». В конъюгатах по настоящему изобретению «m» представляет собой число от приблизительно 450 до приблизительно 900 (что соответствует молекулярной массе от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа), предпочтительно от приблизительно 650 до приблизительно 750 (что соответствует молекулярной массе от приблизительно 30 кДа). Число m выбирают таким образом, чтобы образующийся конъюгат по настоящему изобретению обладал физиологической активностью, сравнимой с активностью немодифицированного ЕРО, при этом его активность может быть равна, превышать или составлять часть соответствующей активности немодифицированного ЕРО. Понятие «молекулярная масса имеет приблизительно» указанную величину означает, что ее величина достаточно близка к указанному значению, которое определяют с помощью обычных аналитических методов. Число «m» выбирают таким образом, чтобы молекулярная масса каждой поли(этиленгликольной) группы, ковалентно связанной с гликопротеином эритропоэтином, составляла от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа, предпочтительно приблизительно 30 кДа.

В конъюгатах по настоящему изобретению число «n» обозначает количество поли(этиленгликольных) групп, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая ε-аминогруппы аминокислоты лизина и/или N-концевые аминогруппы) протеина эритропоэтина с помощью амидной(ых) связи(ей). Конъюгаты по настоящему изобретению могут иметь одну, две или три ПЭГ-группы на молекулу ЕРО. «n» представляет собой целое число от 1 до 3, предпочтительно «n» равно 1 или 2, более предпочтительно «n» равно 1. Предпочтительными конъюгатами из числа описанных выше конъюгатов являются соединения, где х равно 2, m обозначает число от 650 до 750, n равно 1 и R обозначает метил.

Соединения формулы (I) можно получать из известных полимеров:

где R и m имеют указанные выше значения, путем конденсации соединения формулы II с гликопротеином эритропоэтином. Соединения формулы (II), в которых х равно 3, представляют собой сукцинимидиловые эфиры альфа(низш.)алкоксиполи(этиленгликоля) и масляной кислоты ((низш.)алкокси-ПЭГ-СМК). Соединения формулы (II), в которых х равно 2, представляют собой сукцинимидиловые эфиры альфа(низш.)алкоксиполи(этиленгликоля) и пропионовой кислоты ((низш.)алкокси-ПЭГ-СПК). Для получения амида можно использовать любой из обычных методов для осуществления взаимодействия активированного эфира с амином. В описанной выше реакции указанный в качестве примера сукцинимидиловый эфир представляет собой уходящую группу, позволяющую осуществлять образование амида. Применение сукцинимидиловых эфиров, таких как соединения формулы II, для получения конъюгатов с протеинами описано в патенте US 5672662, выданном 30 сентября 1997 г. (на имя Harris и др.).

Человеческий ЕРО содержит девять свободных аминогрупп, т.е. N-концевую аминогруппу плюс ε-аминогруппы 8 остатков лизина. Было установлено, что когда пэгилирующий реагент объединяют с СМК-производным формулы II, то при значении рН 7,5, соотношении протеин: ПЭГ, равном 1:3, и температуре реакции 20-25°С образуется смесь, содержащая моно-, ди- и следовые количества трипэгилированных продуктов. Если пэгилирующий реагент представлял собой СПК-производное формулы II, то в аналогичных условиях, за исключением того, что соотношение протеин: ПЭГ составляло 1:2, получали в основном монопэгилированные продукты. Пэгилированный ЕРО можно вводить в виде смеси или в виде различных пэгилированных видов, выделенных с помощью катионообменной хроматографии. Манипулируя условиями реакции (например, соотношением реагентов, значением рН, температурой, концентрацией протеина, продолжительностью реакции и т.д.) можно изменять относительные количества различных пэгилированных продуктов.

Описанные выше фармацевтические композиции могут содержать также указанный выше протеин эритропоэтин, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий биологической активностью in vivo, вызывающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, имеющие первичную структуру человеческого эритропоэтина, модифицированную путем добавления 1-6 сайтов гликозилирования; где гликопротеин ковалентно связан с одной-тремя (низш.)алкоксиполи(этиленгликольными) группами, причем каждая поли(этиленгликольная) группа ковалентно связана с гликопротеином с помощью линкера формулы -C(O)-X-S-Y- с фрагментом С(O) линкера, в результате чего образуется амидная связь с одной из аминогрупп, Х обозначает -(CH₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, k равно 1-10, Y обозначает

или

средняя молекулярная масса каждого поли(этиленгликольного) фрагмента составляет от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 51 до приблизительно 175 кДа. Такие виды эритропоэтина могут быть представлены также формулой (III)

где R может представлять собой любой (низш.)алкил, т.е. алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, несущую один-шесть атомов углерода, такую как метил, этил, изопропил и т.д. Предпочтительно алкил представляет собой метил. Х может представлять собой -(CH₂)_k-или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k имеет значение от 1 до приблизительно 10. Предпо