Растворимый мутантный ctla4 и его применение

Растворимый мутантный ctla4 и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к растворимому CTLA4, являющемуся мутантным вариантом CTLA4 дикого типа, сохраняющим способность связывать CD80 и/или CD86.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антиген-неспецифические межклеточные взаимодействия между Т-лимфоцитами и антигенпредставляющими клетками (АРС) вызывают Т- клеточные костимулирующие сигналы, вызывающие Т-клеточный ответ на антиген (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-3 67). Костимулирующие сигналы определяют величину Т-клеточного ответа на антиген и то, активирует или инактивирует этот ответ последующие реакции на антиген (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:445-480).

Активация Т-клеток в отсутствие костимуляпии приводит к остановке Т-клеточного ответа или к анергическому Т-клеточному ответу (Schwartz,R.H. (1992) Cell 71:1065-1068). Один ключевой костимулирующий сигнал образуется при взаимодействии рецептора Т-клеточной поверхности CD28 с родственными В7 молекулами на антигенпрезентирующих клетках (например, так же известными как В7-1 и В7-2, или CD80 и CD86 соответственно) (P.Linsley and J.Ledbetter (1993) Annu.Rev. Immunol. 11:191-212). Вещество, известное в настоящее время как CD80 (В7-1), было первоначально описано как активационный антиген, связанный с человеческими В-клетками (Yokochi,T. et al. (1981) J. Immunol 128:823-827; Freeman, G.J. et al.(1989) J. Immunol. 143:2714-2722) и соответственно идентифицируемый как противорецептор в отношении родственных Т-клеточных молекул CD28 и CTLA4 (Linsley, Р., et al. (1990) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031-5035; Linsley, P.S. et al. (1991a) J. Exp. Med. 173:721-730; Linsley, P.S. et al. (1991b) J. Exp. Med. 174:561-570).

Позднее на антигенпредставляющих клетках был идентифицирован другой противорецептор для CTLA4 (Azuma.N. et al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman (1993a) Science 262:909-911: Freeman. G.J. et. al. (1993b) J. Exp. Med. 178:2185-2192: Hathcock.K.L.S., et al. (1994) J. Exp. Med. 180:631-640: Lenschow, D.J. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11054-11058; Ravi-Wolf. Z., 0993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11182-11186: Wu, Yet al., (1993) J. Exp. Med. 178:1789-1793). Это вещество, известное в настоящее время как CD86 (Caux, С., et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1841-1848), но также называемое В7-0 (Azuma et al. (1993, см. выше) или В7-2 (Freeman et al. (1993a), см. выше), имеет последовательность, примерно на 25% идентичную последовательности CD80 на ее внеклеточном участке (Azuma et al. (1993), см. выше; (Freeman et al. (1993a), см. выше, (1993b), см. выше). Клетки, трансфицируемые CD86, инициируют опосредуемые CD86 Т-клеточные реакции (Azuma et al. (1993), см. выше; Freeman et al. (1993a), (1993b), см. выше).

Сравнение экспрессии CD80 и CD86 являлось предметом нескольких исследований (Azuma et al. (1993), см. выше; Hathcock, et al. (1994), см. выше; Larsen, С.Р., et al. (1994) J. Immunol. 152:5208-5219; Stack, R.M., et al., (1994) J. Immunol 152:5723-5733). Современные данные показывают, что экспрессия CD80 и CD86 регулируется по-разному и наводят на мысль, что экспрессия CD86 имеет тенденцию предшествовать экспрессии CD80 в процессе иммунного ответа.

Растворимые формы CD28 и CTLA4 были созданы слиянием вариабельных (v)-подобных внеклеточных областей CD28 и CTLA4 с константными областями иммуноглобулина (Ig), что дает в результате CD28Ig и CTLA4Ig. CTLA4Ig связывает как CD80-позитивные, так и CD86-позитивные клетки более сильно, чем CD28Ig (Linsley, P., et al. (1994) Immunity 1:793-80). Многие из зависимых от Т- клеток иммунных реакций блокируются CTLA4Ig как in vitro, так и in vivo (Linsley, et al., (1991b), см. выше; Linsley, P.S. et. al. (1992а) Science 257:792-795: Linsley, P.S. etal. C1992bU.Exp.Med. 176:1595-1604: Lenschow, D.J. et al., (1992), Science 257:789-792; Tan, P. et al., (1992) J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).

Peach et al., (J. Exp. Med. (1994) 180:2049-2058) идентифицировал участки внеклеточной области CTLA4, которые являются важными для прочного связывания с CD80. Конкретно гексапептидный мотив (MYPPPY) в области, подобной гипервариабельному участку 3 (CDR3), был идентифицирован как полностью консервативная область у всех членов семейства CD28 и CTLA4. Мутагенез со сканированием аланина с помощью мотива MYPPPY в CTLA4 и в выбранных остатках CD28Ig ослабляет или прекращает связывание с CD80.

Были также созданы химерные молекулы, взаимодействующие с гомологичными областями CTLA4 и CD28. Молекулы HS4, HS4-A и HS4-B были конструированы "пересадкой" CDR3-подобных участков CTLA4, которые содержали также часть карбоксильного конца, продолженную так, чтобы включать определенные неконсервативные аминокислотные остатки на CD28Ig. Эти гомологичные мутанты проявили более высокую авидность связывания с CD80, чем CD28Ig.

В другой группе химерных гомологичных мутантов CDR1-подобную область CTLA4, которая не является консервативной в CD28 и, как прогнозировалось, пространственно прилегает к CDR3-подобному участку, "пересаживали" в HS4 и HS4-A. Эти химерные гомологичные мутантные молекулы (обозначенные HS7 и HS8) продемонстрировали даже более высокую авидность связывания с CD80, чем CD28Ig.

Химерные гомологичные мутантные молекулы были также получены пересадкой в HS7 и HS8 CDR2-подобного участка CTLA4, но эта комбинация дополнительно не улучшает авидность связывания с CD80. Следовательно, был определен мотив MYPPPY CTLA4 и CD28, но некоторые неконсервативные аминокислотные остатки CDR1- и CDR3-подобных участков также ответственны за повышенную авидность связывания CTLA4 с CD80.

Было показано, что CTLA4Ig эффективно блокирует обусловленную CD80 Т-клеточную дополнительную стимуляцию (костимуляцию), но не эффективен для блокады CD86-позитивных иммунных реакций. Были созданы молекулы растворимого мутантного CTLA4, в частности, имеющего более высокую авидность к CD86, чем CTLA4 дикого типа, как, возможно, более способные блокировать примирование антиген-специфических активированных клеток, чем CTLA4Ig.

Сохраняется необходимость в более совершенном CTLA4 для создания улучшенных фармацевтических композиций для супрессии иммунного ответа и для терапии рака, чем известные ранее растворимые формы CTLA4.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно изобретение предоставляет растворимый мутантный CTLA4, молекулы которого связываются с CD80 и/или CD86. Мутантные молекулы по изобретению включают такие молекулы, которые могут распознавать любой из CD80 и CD86 либо оба, и связываться с любым из CD80 и CD86 или с обоими. В некоторых вариантах изобретения мутантные молекулы по изобретению связывают CD80 и/или CD86 с более высокой авидностью, чем CTLA4.

Одним из примеров мутантной молекулы CTLA4 является L104EA29YIg (фиг.7), представленная в данном описании. Другим примером мутантной молекулы CTLA4 является L104EIg (фиг.8), представленная в данном описании. L104EA29YIg и L104EIg связываются с CD80 и CD86 с более высокой авидностью, чем CTLA4Ig.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 показан анализ равновесного связывания L104EA29YIg, L104EIg и CTLA4Ig дикого типа с CD86Ig.

Фигуры 2А и 2В иллюстрирует данные анализа FACS, показывающего связывание L104EA29YIg, L104EIg и CTLA4Ig с человеческими CD80- и CD86-трансфицированными СНО клетками, как описано в примере 2, см. ниже.

На фигурах 3А и 3В показано ингибирование пролиферации CD80-позитивных и CD86-позитивных СНО-клеток, как описано ниже в примере 2.

На фигурах 4А и 4В показано, что L104EA29YIg более эффективно ингибирует пролиферацию первичных и вторичных аллостимулированных Т-клеток, чем CTLA4Ig, как описано ниже в примере 2.

Фигуры 5А-С иллюстрируют, что L104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует продуцирование цитокинов IL-2 (фиг.5А), IL-4 (фиг.5В) и γ-интерферона (фиг.5С) аллостимулированных человеческих Т-клеток, как описано ниже в примере 2.

На фигуре 6 показано, что L104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig ингибирует пролиферацию фитогемагглютинин(РНА)-стимулируемых Т-клеток обезьян, как описано ниже в примере 2.

На фигуре 7 изображена нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантной молекулы CTLA4 (L104EA29YIg), содержащая сигнальный пептид; мутантная внеклеточная область CTLA4, начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ig, как описано ниже в примере 1.

На фигуре 8 изображена нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантной молекулы CTLA4 (L104EIg), содержащая сигнальный пептид; мутантная внеклеточная область CTLA4, начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ig, как описано ниже в примере 1.

На фигуре 9 изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность CTLA4Ig, содержащая сигнальный пептид; аминокислотная последовательность внеклеточной области CTLA4 дикого типа, начиная с метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124; и область Ig.

На фигурах 10А-С представлены результаты PAGE в SDS-геле (фиг.10А) для CTLA4Ig (дорожка 1), L104EIg (дорожка 2) и L104EA29YIg (дорожка 3А): и результаты эксклюзионной по размеру хроматографии для CTLA4Ig (фиг.10В) и L104EA29YIg (фиг.10С).

На фигурах 11А и 11В изображена ленточная диаграмма V-подобной складки внеклеточного Ig CTLA4, полученная решением структуры методом ЯМР-спектроскопии. На фиг.11В дан развернутый вид области S25-R33 и области MYPPPY, показывающий положение и ориентацию боковой цепи мутаций, повышающих авидность, L104 и А29.

На фигуре 12 дана схематическая диаграмма вектора, piLN-LEF29Y, с инсерцией L104EA29YIg.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Следующие слова и фразы, применяемые в данном описании, имеют указанные ниже значения.

Применяемый в данном описании "CTLA4 дикого типа" имеет аминокислотную последовательность природного полноразмерного CTLA4 (Патенты США 5434131, 5844095, 5851795) или его внеклеточной области, которая связывает CD80 и/или CD86, и/или препятствует CD80 и/или CD86 связываться с их лигандами. В конкретных вариантах изобретения внеклеточная область CTLA4 дикого типа начинается с метионина в положении +1 и оканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточная область CTLA4 дикого типа начинается с аланина в положении -1 и заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124. CTLA4 дикого типа представляет собой белок клеточной поверхности, содержащий N-концевую внеклеточную область, трансмембранную область и С-концевую цитоплазматическую область. Внеклеточная область связывается с целевыми антигенами (мишенями), такими как CD80 и CD86. В природной клетке белок CTLA4 дикого типа транслируется в виде незрелого полипептида, который включает сигнальный пептид на N-конце. Незрелый белок претерпевает посттрансляционное, которое включает отщепление и удаление сигнального пептида с образованием продукта расщепления CTLA4, имеющего вновь образованный N-конец, который отличается от N-конца незрелой формы. Специалист в данной области техники понимает, что может происходить дополнительное посттрансляционное процессирование, при котором из вновь образованного N-конца продукта расщепления CTLA4 удаляется одна или более аминокислот. Молекула зрелой формы CTLA4 включает внеклеточную область CTLA4 или любую ее часть, связывающуюся с CD80 и/или CD86.

"CTLA4Ig" представляет собой растворимый слитый белок, содержащий внеклеточную область CTLA4 дикого типа или ее часть, которая связывает CD80 и/или CD86, соединенного с концом Ig. Особый вариант изобретения содержит внеклеточную область CTLA4 дикого типа, начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; или начиная с аланина в положении -1 и заканчивая аспарагиновой кислотой в положении +124; участок соединения, аминокислотный остаток глутамин в положении +125; и иммуноглобулиновый участок, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 (фигура 9).

Применяемое в данном описании понятие "слитый белок" определяется как одна или более аминокислотных последовательностей, соединенных друг с другом с помощью хорошо известных в технике методов и методов, описанных в патентах США 5434131 или 5637481. При этом соединенные аминокислотные последовательности образуют один слитый белок.

Применяемое в данном описании выражение "молекула мутантного CTLA4" ("мутантный CTLA4") может обозначать молекулу полноразмерного CTLA4 (полноразмерный CTLA4) или ее (его) части (производные или фрагменты), которые содержат мутацию или множественные мутации в CTLA4 (предпочтительно во внеклеточной области CTLA4), так, что она (он) становится аналогичной(-ым), но не идентичной(-ым) молекуле CTLA4 дикого типа (CTLA4 дикого типа). Молекулы мутантного CTLA4 могут включать в себя биологически или химически активную не-CTLA4 молекулу, либо эта молекула может быть присоединена к молекуле мутантного CTLA4. Молекулы мутантного соединения могут быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или могут быть связаны с поверхностью. Молекулы мутантного CTLA4 могут включать всю внеклеточную область CTLA4 или ее части, например фрагменты или производные. Мутантный CTLA4 можно получать синтетически или методами рекомбинантнои ДНК.

Употребляемый в данном описании термин "мутация" обозначает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности полипептида дикого типа. В данном случае он обозначает изменение во внеклеточной области CTLA4 дикого типа. Изменение может представлять собой изменение аминокислоты, которое включает замены, делеции, добавления или усечения (сокращения). Мутантная молекула может содержать одну или несколько мутаций. Мутации в нуклеотидной последовательности могут вызывать или не вызывать мутации в аминокислотной последовательности, что очень понятно из уровня техники. А именно некоторые нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту. Примеры включают кодоны CGU, CGG, CGC и CGA, кодирующие аминокислоту аргинин (R); или кодоны GAU и GAC, кодирующие аминокислоту - аспарагиновую кислоту (D). Следовательно, белок может кодироваться одной или более нуклеиновой кислотой, которые отличаются специфической нуклеотидной последовательностью, но все же кодируют белки с идентичными последовательностями. Ниже даны последовательности, кодирующие аминокислоту:

Аминокислота	Символ	Однобуквенный символ	Кодоны
Аланин	А1а	A	GCU, GCC, GCA, GCG
Цистеин	Cys	С	UGU, UGC
Аспарагиновая
кислота	Asp	D	GAU, GAC
Глутаминовая кислота	Glu	E	GAA, GAG
Фенилаланин	Phe	F	UUU, UUC
Глицин	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Гистидин	His	H	CAU, CAC
Изолейцин	He	I	AUU, AUC, AUA
Лизин	Lys	К	AAA, AAG
Лейцин	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC,
			CUA, CUG
Метионин	Met	M	AUG
Аспарагин	Asn	N	AAU, AAC
Пролин	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Глутамин	Gin	Q	CAA, CAG
Аргинин	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG, AGA,
			AGG

		9
Серин	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG,
			AGU, AGC
Треонин	Thr	Т	ACU, ACC, ACA, ACG
Валин	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
Триптофан	Trp	w	UGG
Тирозин	Туг	Y	UAU, UAC

Употребляемый в данном описании термин "внеклеточная область CTLA4" обозначает часть CTLA4, которая распознает CD80 и/или CD86 и связывается с ними. Например, внеклеточная область CTLA4 включает участок от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124. Или же внеклеточная область CTLA4 включает участок от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фигура 9). Внеклеточная область включает фрагменты или производные CTLA4, которые связываются с CD80 и/или CD86.

Употребляемый в данном описании термин "не-CTLA4 белковая последовательность" или "не-CTLA4 молекула" обозначает любую молекулу, которая не связывается с CD80 и/или CD86 и не препятствует связыванию CTLA4 с ее целью. Пример включает, без ограничения, константную область иммуноглобулина (Ig) или ее часть. Предпочтительно константная область иммуноглобулина представляет собой константную область человеческого Ig или Ig обезьян, например человеческий С (гамма) 1, включая шарнир, области СН2 и СН3. Константная область Ig может мутировать, ослабляя его эффекторные функции (Патенты США 5637481 и 6132992).

Употребляемое в данном описании выражение "фрагмент мутантной молекулы CTLA4" обозначает часть мутантной молекулы CTLA4, предпочтительно внеклеточную область CTLA4 или ее участок, который распознает мишень, например CD80 и/или CD86, и связывается с нею.

Употребляемое в данном описании выражение "производное мутантного CTLA4" ("молекулы мутантного CTLA4") обозначает соединение, имеющее последовательность, по меньшей мере, на 70% сходную с последовательностью внеклеточной области CTLA4, и функции, аналогичные функциям этой области, т.е. оно распознает CD80 и/или CD86 и связывается с ними.

Употребляемый в данном описании "часть (участок) молекулы CTLA4" включает фрагменты и производные (молекулы) CTLA4, которые связываются с CD80 и/или CD86.

Для более полного понимания настоящего изобретения ниже представлено следующее описание.

КОМПОЗИЦИИ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Настоящее изобретение предоставляет растворимый мутантный CTLA4, который распознает CD80 и/или CD86 и связывается с ними. В некоторых вариантах изобретения растворимые мутантные CTLA4 проявляют более высокую авидность к CD80 и/или CD86, чем CTLA4Ig.

Примеры мутантого CTLA4 включают L104EA29YIg (Фигура 7). Аминокислотная последовательность L104EA29YIg может начинаться с аланина в положении -1 аминокислоты и оканчиваться лизином в положении +357 аминокислоты. Или же аминокислотная последовательность L104EA29YIg может начинаться метионином в положении +1 аминокислоты и заканчиваться лизином в положении +357 аминокислоты. CTLA4-участок L104EA29YIg охватывает метионин в положении аминокислоты +1 вплоть до аспарагиновой кислоты в положении +124 аминокислоты. L104EA29YIg содержит область соединения - аминокислотный остаток глутамин в положении +125 - и участок иммуноглобулина, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 (фигура 7). Авидность L104EA29YIg при связывании с CD80, примерно, вдвое выше авидности CTLA4Ig дикого типа (далее называемого CTLA4Ig) и, примерно, в 4 раза выше при связывании с CD86. Такое более сильное связывание приводит к тому, что L104EA29YIg более эффективно блокирует иммунные реакции, чем CTLA4Ig.

Молекулы мутантного CTLA4 содержат, по меньшей мере, внеклеточную область CTLA4 или ее участок, который связывается с CD80 и/или CD86. Внеклеточная область молекулы мутантного CTLA4 содержит аминокислотную последовательность, начиная от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг.7 или 8). Или же внеклеточная область CTLA4 может включать аминокислотную последовательность, начиная с аланина в положении -1 вплоть до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг.7 или 8).

В одном варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок, включающий внеклеточную область CTLA4, имеющую одну или более мутаций в области аминокислотной последовательности, начиная от серина в положении +25 и кончая аргинином в положении +33 (S25-R33). Например, аланин в положении +29 CTLA4 дикого типа можно заменить на тирозин (кодоны: UAU, UAC). Или же аланин можно заменить на лейцин (кодоны: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), фенилаланин (кодоны: UUU, UUC), триптофан (кодон: UGG) или треонин (кодоны: ACU, АСС, АСА, ACG). Как легко поймут специалисты в данной области, урацил (U), нуклеотид последовательности РНК, соответствует тимину (Т), нуклеотиду последовательности ДНК.

В другом варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточную область CTLA4, имеющую одну или более мутаций в или близ области аминокислотной последовательности, начиная с метионина в положении +97 и кончая глицином в положении +107 (M97-G107). Например, лейцин в положении +104 CTLA4 дикого типа можно заменить на глутаминовую кислоту (кодоны: GAA, GAG). Мутантный CTLA4, содержащий такую замену, называется в данном описании L104EIg (фиг.8).

Еще в одном варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточную область CTLA4, содержащую одну или более мутаций в областях S25-R33 и M97-G107. Например, в одном варианте изобретения мутантный CTLA4 содержит в положении +29 тирозин вместо аланина; и в положении +104 глутаминовую кислоту вместо лейцина. Мутантный CTLA4, содержащий такую замену, называется в данном описании L104EA29YIg (фиг.7). Нуклеиновая кислота, которая кодирует L104EA29YIg, содержится в pD16 L104EA29YIg и депонирована 19 июня 2000 года Американской Коллекцией Культур Клеток (АТСС), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (АТСС No. PTA-2104). Вектор pD16 L104EA29YIg является производным от вектора pcDNA3 (INVITROGEN).

Изобретение далее включает растворимый мутантный CTLA4, содержащий внеклеточную область CTLA4, как показано на фиг.7 или 8, или его часть (части), и фрагмент, который изменяет растворимость, аффинность и/или валентность мутантного CTLA4.

В соответствии с практикой применения изобретения фрагмент может представлять собой константную область иммуноглобулина или ее часть. Для применения in vivo предпочтительно, чтобы константная область иммуноглобулина не вызывала вредного иммунного ответа у субъекта. Например, в клинических протоколах может быть предпочтительным, чтобы молекулы мутанта включали константные области человеческого или обезьяньего иммуноглобулина. Одним из примеров подходящей области иммуноглобулина является человеческий С (гамма) 1, содержащий шарнирную, СН2 и СН3 области. Возможны другие изотипы. Кроме того, возможны другие константные области (предпочтительно другие слабо- или неиммуногенные константные области иммуноглобулина).

Другие фрагменты включают полипептидные метки. Примеры подходящих меток включают, без ограничения, молекулы р97, env gp120, Е7 и ova (Dash, В., etal. (1994) J.Gen. Virol. 75:1389-97: Ikeda, Т., et al. (1994) Gene 138:193-6; Falk, К., et al. (1993) Cell. Immunol 150:447-52: Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204:789-93). Возможно применять другие молекулы в качестве меток (Gerard, С. et al. (1994) Neuroscience 62:721-739; Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D, et al. (1987) Science 238:1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233:209-212).

Изобретение далее включает растворимые мутантные слитые белки CTLA4Ig, предпочтительно более реактогенные в отношении антигена CD80 и/или CD86 по сравнению с CTLA4 дикого типа. Одним из примеров является L104EA29YIg, как показано на фиг.7.

В другом варианте изобретения молекула растворимого мутантного белка CTLA4 включает соединительный аминокислотный остаток, расположенный между участком CTLA4 и участком иммуноглобулина. Участок соединения аминокислот может быть любой аминокислотой, включающей глутамин. Соединительная аминокислота (участок соединения) может вводиться методами молекулярной генетики или синтетическими химическими методами, известными из уровня техники.

В другом варианте изобретения молекула растворимого мутантного белка CTLA4 включает участок иммуноглобулина (например, шарнирную СН2 и СН3 области), где любой остаток цистеина или все цистеиновые остатки в шарнирной области иммуноглобулинового участка заменены на серин, например цистеиновые остатки в положениях +130, +136 или +139 (фиг.7 или 8). Мутантные молекулы могут также включать пролин в положении +148, замененный на серин, как показано на фиг.7 или 8.

Молекула растворимого мутантного белка CTLA4 может включать последовательность сигнального пептида, связанную с N-концом внеклеточной области СТLА4-участка мутантной молекулы. Сигнальный пептид может представлять собой любую последовательность, которая позволяет мутантной молекуле секретировать, включая сигнальный пептид онкостатина М (Malick, et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853), или CD5 (Jones, N.H. et al., (1986) Nature 323:346-349), или сигнальный пептид любого внеклеточного белка.

Молекула мутантного соединения может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный с N-концом внеклеточной области CTLA4, и молекулу человеческого иммуноглобулина (например, шарнирную, СН2 и СН3 области), связанную с С-концом внеклеточной области CTLA4. Эта молекула включает сигнальный пептид онкостатина М, охватывающий аминокислотную последовательность, начиная с метионина в положении -26 и вплоть до аланина в положении -26, участок CTLA4, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124, участок соединения аминокислот - глутаминовый остаток - в положении 125 и участок иммуноглобулина, охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357.

Растворимый мутантный белок CTLA4 можно получать методами рекомбинантной ДНК (молекулярными) или химическими синтетическими методами. Молекулярные методы включают следующие стадии: интродукция подходящей клетки-хозяина с молекулой нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует и кодирует молекулу растворимого мутантного CTLA4; культивирование интродуцированной таким образом клетки-хозяина в условиях, которые позволяют клетке-хозяину экспрессировать мутантные молекулы; и выделение экспрессирующего мутантного белка. Участок сигнального пептида мутантной молекулы делает возможной экспрессию белка на поверхности клетки и секрецию его клеткой-хозяином. Транслируемые мутантные молекулы могут претерпевать посттрансляционную модификацию, включающую отщепление сигнального пептида с образованием зрелого белка, содержащего участки CTLA4 и иммуноглобулина. Отщепление может осуществляться после аланина в положении -1, что дает молекулу зрелого мутантного белка, содержащего метионин в положении +1 в качестве первой аминокислоты (фиг.7 или 8). Или же отщепление может проходить после метионина в положении -2, что дает молекулу зрелого мутантного белка, содержащего аланин в положении -1 в качестве первой аминокислоты.

Предпочтительным вариантом изобретения является молекула растворимого мутантного белка CTLA4, которая содержит внеклеточную область человеческого CTLA4, связанную с целой молекулой иммуноглобулина или ее частью (например, шарнирной, СН2 и СН3 областями). Молекула этого предпочтительного белка включает CTLA4-участок молекулы растворимого белка, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124, участок соединения аминокислот - глутаминовый остаток - в положении +125 и участок иммуноглобулина, охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357. Участок, содержащий внеклеточную область CTLA4, мутирует так, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может мутировать так, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин, и пролин в положении +148 заменяется на серин. Этот мутантный белок (мутантная молекула) обозначена в данном описании L104EA29YIg (фиг.7).

Другим вариантом мутантной молекулы L104EA29YIg по изобретению является мутантная молекула, имеющая аминокислотную последовательность от аланина в положении -1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124, участок соединения аминокислот - глутаминовый остаток - в положении +125 и участок иммуноглобулина, охватывающий глутаминовую кислоту в положении +126 (например, от +126 до лизина в положении +357). Участок, содержащий внеклеточную область CTLA4, мутирует так, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин; а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы мутирует так, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин, и пролин в положении +148 заменяется на серин. Этот мутантный белок (мутантная молекула) обозначена в данном описании L104EA29YIg (фиг.7). После отщепления сигнальной последовательности L104EA29YIg может начинаться либо с метионина в положении +1, либо с аланина в положении -1.

Другой мутантной молекулой по изобретению является молекула растворимого мутантного белка CTLA4, имеющая внеклеточную область человеческого CTLA4, связанную с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, шарнирной областью, СН2 и СН3). Эта молекула включает часть аминокислотной последовательности, кодирующей CTLA4, начиная с метионина в положении +1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124, участок соединения аминокислот - глутаминовый остаток - в положении +125 и участок иммуноглобулина, охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357. Участок, содержащий внеклеточную область CTLA4, мутирует так, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок молекулы мутирует так, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин, и пролин в положении +148 заменяется на серин. Этот мутантный белок (мутантная молекула) обозначен в данном описании L104EIg (фиг.8).

Альтернативным вариантом L104EIg является молекула растворимого мутантного CTLA4, содержащая внеклеточную область CTLA4, связанную с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, шарнирной областью, СН2 и СН3). Эта предпочтительная молекула включает часть аминокислотной последовательности от аланина в положении -1 и до аспарагиновой кислоты в положении +124, участок соединения аминокислот - глутаминовый остаток - в положении +125 и участок иммуноглобулина, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357. Участок, содержащий внеклеточную область CTLA4, мутирует так, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок мутантной молекулы мутирует так, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серии, и пролин в положении +148 заменяется на серин. Этот мутантный белок (мутантная молекула) обозначен в данном описании L104EIg (фиг.8).

Кроме того, настоящее изобретение включает молекулу растворимого мутантного CTLA4, имеющую: (а) первую аминокислотную последовательность мембранного гликопротеина, например CD28, CD86, CD80, CD40 и gp39, которая блокирует пролиферацию Т-клеток, слитую со второй аминокислотной последовательностью; (b) вторую аминокислотную последовательность, являющуюся фрагментом внеклеточной области мутантного CTLA4, которая блокирует пролиферацию Т-клеток, такую как, например, молекула аминокислоты, включающая область от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг.7 или 8); и (с) третью аминокислотную последовательность, которая действует как идентификационная метка или повышает растворимость молекулы. Например, третья аминокислотная последовательность может состоять исключительно из аминокислотных остатков шарнирной области, СН2- и СН3-областей молекулы неиммуногенного иммуноглобулина. Примеры подходящих молекул иммуноглобулина включают, без ограничения, человеческий или обезьяний иммуноглобулин, например С (гамма) 1. Также возможны другие изотипы.

Кроме того, изобретение включает нуклеотидные молекулы, имеющие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие молекулам растворимого мутантного CTLA4 по изобретению. В одном варианте изобретения нуклеотидная молекула представляет собой ДНК (например, кДНК) или ее гибрид. Или же нуклеотидные молекулы представляют собой РНК или их гибриды.

Кроме того, данное изобретение включает вектор, который содержит нуклеотидные последовательности по изобретению. Также охватывается система вектора-хозяина. Система вектора-хозяина включает вектор по изобретению в подходящей клетке-хозяине. Примеры подходящих клеток-хозяев включают, без ограничения, клетки прокариот и эукариот.

Изобретение включает фармацевтические композиции для лечения заболеваний иммунной системы, содержащие фармацевтически эффективные количества растворимого мутантного CTLA4. В некоторых вариантах изобретения заболевания иммунной системы опосредуются взаимодействием CD28- и/или СТLА4-позитивных клеток с CD80- и/или СD86-позитивными клетками. Молекулы растворимого мутантного CTLA4 предпочтительно представляют собой молекулы CTLA4, содержащие одну или более мутаций во внеклеточной области CTLA4. Фармацевтическая композиция может включать растворимый мутантный белок CTLA4 и/или нуклеиновую кислоту и/или кодирующие их векторы. В предпочтительных вариантах изобретения растворимый мутантный CTLA4 имеет аминокислотную последовательность внеклеточной области CTLA4, как показано на одной из фигур, 7 или 8 (L104EA29Y или L104E соответственно). Еще более предпочтительно, когда растворимым мутантным CTLA4 является L104EA29YIg, представленный в данном описании. Композиции могут дополнительно содержать другие терапевтические агенты, включая, без ограничения, лекарственные токсины, ферменты, антитела или конъюгаты.

Фармацевтические композиции также предпочтительно включают подходящие носители или адъюванты, содержащие любой материал, который при соединении с соединением (молекулой) по изобретению (например, растворимым мутантным CTLA4, таким как L104EA29Y или L104E) сохраняет активность молекулы и не является реактивным в отношении иммунной системы субъекта. Примеры подходящих носителей и адъювантов включают, без ограничения, человеческий сывороточный альбумин; ионообменники; окись алюминия; лецитин; буферы, такие как фосфаты; глицин; сорбиновая кислота; сорбат калия; и соли или электролиты, такие как протаминсульфат. Другие примеры включают любые стандартные фармацевтические носители, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером; вода; эмульсии, такие как эмульсия масла в воде; и различные увлажняющие средства. Другие носители могут также включать стерильные растворы; таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы. Обычно такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые виды глин, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, смолы, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки и красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными обычными методами. Такие препараты можно также помещать в различные липидные композиции, такие как липосомы, а также в различные полимерные композиции, такие как полимерные микросферы.

Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить обычными способами, включая, но без ограничения, внутривенный (вв), внутрибрюшинный (интраперитонеальный, вб), внутримышечный (вм), подкожный, пероральный способы введения, введение в виде суппозитория или при местном контакте, или имплантация устройства пролонгированного действия, такого как мини-осмотический насос, субъекту.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть в виде различных лекарственных форм, которые включают, без ограничения, жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микровезикулы (микропузырьки), липосомы и растворы для инъекций или вливаний. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.

Наиболее эффективный способ применения и схема приема композиций по изобретению зависят от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья больного и реакции на лечение и мнения лечащего врача. Соответственно дозировки композиций следует корректировать для каждого пациента.

Молекулы растворимого мутантного CTLA4 можно вводить субъекту в количестве и во времени (например, продолжительность и/или число раз), достаточном для того, чтобы блокировать связывание эндогенного В 7 (например, CD 80 и/или CD 86) с (их) соответствующими лигандами в организме субъекта. Тем самым блокада связывания эндогенный В7/лиганд ингибирует взаимодействие В7-позитивных клеток (например, CD80- и/или CD86-позитивных клеток) с CD28- и/или СТ1А4-позитивными клетками. Дозировка терапевтического агента зависит от многих факторов, включая, но без ограничения, характер ткани, в которую вводят агент, вид аутоиммунного (аутоаллергического) заболевания, подлежащего лечению, тяжесть заболевания, состояние здоровья субъекта и реакция субъекта на лечение с помощью агентов. Соответственно дозировка агентов может меняться в зависимости от субъекта и способа введения. Молекулы растворимого мутантного CTLA4 можно вводить в количестве 0,1-20,0 мг/кг веса больного в день, предпочтительно 0,5-10,0 мг/кг/день. Вводить фармацевтические композиции можно через различные промежутки времени. В одном варианте изобретения фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в течение одного часа или более. Кроме того, введение можно повторять в зависимости от тяжести заболевания, а также других факторов, как следует из уровня техники.

Изобретение далее включает способы получения белка, заключающиеся в выращивании системы хозяин-вектор по изобретению таким образом, чтобы продуцировать белок в хозяине, и в выделении полученного при этом белка.

Кроме того, изобре