Нитрилаза из rhodococcus rhodochrous ncimb 11216

Нитрилаза из rhodococcus rhodochrous ncimb 11216

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид с активностью нитрилазы, к конструктам нуклеиновых кислот, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, а также к векторам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот или конструкты нуклеиновых кислот. Далее изобретение относится к последовательностям аминокислот, которые кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, и к микроорганизмам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, или к конструктам нуклеиновых кислот или векторам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот или конструкты нуклеиновых кислот.

Кроме того, изобретение относится к ферментативному способу получения карбоновых кислот из соответствующих нитрилов.

Алифатические, ароматические и гетероароматические карбоновые кислоты представляют собой важные соединения для органической химии синтеза. Они являются исходными продуктами для множества фармацевтических активных веществ или активных веществ для средств защиты растений.

Из литературы известен целый ряд различных ферментативных процессов синтеза для получения ахиральных или хиральных карбоновых кислот. Так например, ферментативным способом получают оптически активные аминокислоты. Недостатком при этом является то, что для каждой аминокислоты нужно разрабатывать свой способ. Чтобы можно было получать по возможности широкий спектр различных соединений, применяют химические или ферментативные способы. При химических способах недостатком является то, что стереоцентры должны быть построены, как правило, многостадийным, широко не применяемым, сложным синтезом.

Ферментативный синтез хиральных карбоновых кислот описан в целом ряде патентных заявок и патентов. Международная заявка WO 92/05275 описывает синтез энантиомерных α-гидрокси-α-алкил- или α-алкилкарбоновых кислот в присутствии оптически активного биологического материала. Другие синтезы оптически активных α-замещенных кислот микроорганизмами описываются в ЕР-В-0348901, ЕР-В-0332379, ЕР-А-0348901 или его эквиваленте, US 5283193, ЕР-А-0449648, ЕР-В-0473328, ЕР-В-0527553 или его эквиваленте, US 5296373, ЕР-А-0610048, ЕР-А-0610049, ЕР-А-0666320 или WO 97/32030.

Биотехнологические синтезы ахиральных карбоновых кислот микроорганизмами описываются, например, в ЕР-А-0187680, ЕР-А-0229042, WO 89/00193, JP 08173152, JP 06153968, FR 2694571, ЕР-А-0502476, ЕР-А-0444640 или ЕР-А-0319344.

Недостаток этих процессов состоит в том, что они часто приводят к продуктам с низкой оптической чистотой и/или что проходят с малым выходом по времени и пространству. Это приводит к экономически неинтересным процессам. Кроме того, недостатком является то, что ферменты, которые имеются в применяемых для синтеза ахиральных или хиральных карбоновых кислот микроорганизмах, как правило, имеют только органиченный спектр субстратов, т.е. микроорганизмами превращаются только определенные алифатические, ароматические или гетероароматические нитрилы. Особенно ароматические и гетероароматические нитрилы, как, например, цианотиофены или бензонитрилы, преобразуются микроорганизмами или плохо, или вообще не преобразуются в соответствующие карбоновые кислоты.

Задачей изобретения поэтому является разработка ферментативных способов получения ахиральных и/или хиральных карбоновых кислот, которые не имеют вышеприведенных недостатков и особенно доступны для получения ахиральных или хиральных карбоновых кислот из соответствующих нитрилов.

Эта задача решается выделенной по изобретению последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей полипептид с активностью нитрилазы, и выбранной из группы, включающей

а) последовательность нуклеиновых кислот с представленной в SEQ ID NO:1 последовательностью,

б) последовательности нуклеиновых кислот, которые как результат дегенерированного генетического кода отводятся от представленной в SEQ ID NO:1 последовательности нуклеиновых кислот,

в) производные представленной в SEQ ID NO:1 последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды с представленными в SEQ ID NO: 2 аминокислотными последовательностями и имеющие по меньшей мере 95% гомологию на аминокислотном уровне, без значительного снижения ферментативной активности полипептидов.

Под гомологией последовательности нуклеиновых кислот по изобретению с последовательностью SEQ ID NO:1 следует понимать, например, аллельные варианты, которые имеют 95%-ную гомологию на отведенном аминокислотном уровне, предпочтительно по меньшей мере 97% гомологию, особенно предпочтительно по меньшей мере 98% и чрезвычайно предпочтительно по меньшей мере 99% гомологию по всему участку последовательности. По частичному участку последовательностей гомология может лежать предпочтительно выше. Отведенная от SEQ ID NO:1 аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2. Аллельные варианты охватывают, в частности, функциональные варианты, которые получаются делецией, инсерцией или замещением нуклеотидов из представленной в SEQ ID NO:1 последовательности, причем ферментативную активность отведенных синтезированных протеинов следует сохранять и незначительно снижать для внесения одного или нескольких генов в организм. Под незначительно сниженной активностью следует понимать ферментативную активность, которая имеет предпочтительно по меньшей мере 10%, предпочтительно 30%, особенно предпочтительно 50%, и с особой степени предпочтительно 70% ферментативной активности представленного в SEQ ID NO:2 фермента. Изобретение относится, таким образом, к аминокислотным последовательностям, которые кодируются вышеприведенными группами последовательностей нуклеиновых кислот. Предпочтительно изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые кодируются последовательностью SEQ ID NO:1.

Далее под гомологией последовательности SEQ ID NO:1 следует понимать, например, грибковые или бактериальные гомологи, сокращенные последовательности, однонитевые ДНК или РНК кодирующей и некодирующей ДНК-последовательности. Гомологи последовательности SEQ ID NO:1 имеют на уровне ДНК гомологию по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, особенно предпочтительно по меньшей мере 80%, в особой степени предпочтительно по меньшей мере 90% по всему приведенному в SEQ ID NO:1 участку ДНК.

Кроме того, под гомологией SEQ ID NO:1 следует понимать производные, такие как, например, варианты промотеров. Промотеры, которые включены перед приведенными нуклеотидными кислотами, могут быть изменены посредством одной или нескольких замен нуклеотидов, посредством инерции (инерции) и/или делеции (делеций), без отрицательного воздействия на функциональность, соответственно эффективность промотеров. Далее промотеры могут быть повышены в их активности изменением их последовательности или же могут быть полностью заменены на более активные промотеры также и организмов другого вида.

Под производными следует также понимать варианты, последовательность нуклеотидов которых изменена в пределах от -1 до -200 пар оснований перед стартовым кодоном и от 0 до 1000 пар оснований после стопкодона таким образом, что изменяется экспрессия генов и/или экспрессия протеинов предпочтительно повышается.

Предпочтительно последовательность SEQ ID NO:1 или ее гомологи можно выделять из бактерий, предпочтительно из грамположительных бактерий, предпочтительно из видов Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, Mycobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Proactinomyces или Bacillus, особенно предпочтительно из бактерий вида Rhodococcus, Mycobacterium или Nocardia, чрезвычайно предпочтительно из бактерий вида Rhodococcus sp., Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous или Mycobacterium rhodochrous известными специалисту в данной области методами.

Последовательности SEQ ID No:1 или ее гомологи или части этих последовательностей могут быть выделены, например, обычными способами гибридизации или ПЦР-техники из других грибов или бактерий. Эти ДНК-последовательности гибридизируют при стандартных условиях с последовательностями по изобретению. Для гибридизации применяются предпочтительно короткие олигонуклеотиды консервированных участков, например из активного центра, которые могут быть определены посредством сравнения с другими нитрилазами и нитрилгидратазами известным специалисту образом. Однако для гибридизации могут применяться более длинные фрагменты нуклеиновых кислот по изобретению или полные последовательности. В зависимости от применяемых нуклеиновой кислоты, олигонуклеотида, более длинного фрагмента или полной последовательности и в зависимости от того, какой вид нуклеиновой кислоты ДНК или РНК применяется для гибридизации, варьируются эти стандартные условия. Так например, температура плавления для ДНК: ДНК-гибрида на прибл. на 10°С ниже, чем ДНК: РНК-гибридов такой же длины.

Под стандартными условиями следует понимать в зависимости от нуклеиновой кислоты температуры между 42 и 58°С в водном буферном растворе с концентрацией между 0,1 до 5 × SSC (причем 1 × SSC = 0,15 М NaCl, 15 мМ цитрата натрия, рН 7,2) или дополнительно в присутствии 50% формамида, например, 42°С in 5 × SSC, 50% формамида. Предпочтительно условия гибридизации составляют для ДНК:ДНК-гидрида 0,1 × SSC и температура между 20°С и 45°С, предпочтительно между 30°С и 45°С. Для ДНК:ДНК-гидрида условия гибридизации предпочтительно при 0,1 × SSC и температура между 30°С и 55°С, предпочтительно между 45°С и 55°С. Эти указанные температуры для гибридизации являются, например, рассчитанными значениями точки плавления для нуклеиновой кислоты длиной прибл. 100 нуклеотидов и с G + С-содержанием в 50% в присутствии формамида. Экспериментальные условия для гибридизации ДНК описаны в известных учебниках по генетике, как например в Sambrook и др., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, и могут быть рассчитаны по известным специалисту формулам, например, в зависимости от длины нуклеиновых кислот, вида гибридов или G + С-содержания. Дальнейшую информацию по гибридизации специалист может найти в следующей литературе: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Под конструктом нуклеиновой кислоты по изобретению следует понимать гены нитрилазы последовательности SEQ ID NO:1 и их гомологи, которые функционально связаны с одним или несколькими регуляторными сигналами, предпочтительно, для повышения экспрессии генов. При этих регуляторных последовательностях речь идет, например, о последовательностях, которые связываются с индукторами или репрессорами и таким образом регулируют экспрессию нуклеиновых кислот. Дополнительно к этим регуляторным последовательностям может еще иметься естественная регуляция этих последовательностей перед собственными структурными генами и, в случае необходимости, она может быть генетически изменена, так что естественная регуляция исключена и экспрессия генов повышена. Конструкт нуклеиновой кислоты может, однако, быть построен проще, т.е. дополнительные регуляторные сигналы перед последовательностью SEQ ID NO:1 или ее гомологами не инсерируются и естественный промотер со своей регуляцией не удален. Вместо этого естественную регуляцию мутируют таким образом, что больше не происходит регуляции и экспрессия генов повышается. Конструкт нуклеиновой кислоты может, кроме того, содержать также одну или несколько так называемых энхансерных последовательностей, функционально связанных с промотером, которые позволяют повышенную экспрессию последовательности нуклеиновых кислот. Также на 3′-конце ДНК-последовательности могут быть дополнительно инсерированы последовательности, такие как дальнейшие регуляторные элементы или терминаторы. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержаться в одной или нескольких копиях в конструкте. В конструкте могут содержаться еще другие маркеры, такие как резистентные антибиотикам или комплементирующие ауксотропии гены, в случае необходимости, для селекции на конструкт.

Предпочтительные регуляторные последовательности для способа по изобретению содержатся, например, в таких промоторах, как cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- или в λ-P_L-промоторе, которые применяются предпочтительно в грамотрицательных бактериях. Другие регуляторные последовательности содержатся, например, в грамоположительных промотерах amy и SPO2, дрожжевых и грибных промотерах ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. В этой связи предпочтительны также и промотеры пируватдекарбоксилазы и метанолоксилазы, например, из Hansenula. Для регуляции могут также применяться искуственные промотеры.

Конструкт нуклеиновых кислот для экспрессии в организме-хозяине инсерируется, предпочтительно, в векторе, как, например, плазмиде, фаге или прочем ДНК, который обеспечивает оптимальную экспрессию генов. Эти векторы представляют собой дальнейший объект изобретения. Подходящие векторы имеются, например, в Е. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, рКСЗО, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-BI, lgt11 или pBdCI, в стрептомицетах рlJ101, plJ364, plJ702 или plJ361, в бациллах pUB110, pC194 или pBD214, в Corynebacterium pSA77 или pAJ667, в грибах pALS1, plL2 или рВВИб, в дрожжах 2μМ, pAG-1, YEp6, YEp13 или pEMBLYe23 или в растениях pLGV23, pGHIac⁺, pBIN19, pAK2004 или pDH151. Приведенные плазмиды представляют собой малый выбор возможных плазмид. Дальнейшие плазмиды известны специалисту в данной области и могут быть найдены, например, в книге Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.Н. и др. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Предпочтительно конструкт нуклеиновых кислот для экспрессии других имеющихся генов содержит дополнительно еще 3′ и/или 5′-концы регуляторных последовательностей для повышения экспрессии, которые в зависимости от выбранного организма-хозяина и гена или генов выбираются для оптимальной экспрессии.

Эти регуляторные последовательности должны позволять нацеленную экспрессию генов и экспрессию протеинов. Это может означать, в зависимости от организма-хозяина, то, что ген экспримируется или сверхэкспримируется только после индукции или, что он экспримируется и/или сверхэкспримируется сразу.

Регуляторные последовательности, соответственно факторы, могут предпочтительно положительно воздействовать на генную экспрессию внесенных генов и этим самым повышать ее. Усиление регуляторных элементов может предпочтительно осуществляться на температурном уровне, для чего применяются сильные транскрипционные сигналы и/или "энхасеры". Наряду с этим возможно также и усиление трансляции за счет того, что, например, улучшается стабильность мРНК.

При другой форме выполнения вектора содержащий конструкт нуклеиновой кислоты по изобретению или нуклеиновую кислоту по изобретению конструкт должен вводиться в организм-хозяин в форме линейной ДНК и через гетерологическую или гомологическую рекомбинацию интегрироваться в геном организма-хозяина. Линейная ДНК может состоять из линеаризированного вектора, такого как плазмид, или только из конструкта нуклеиновой кислоты или из нуклеиновой кислоты.

Для оптимальной экспрессии гетерологических генов в организме следует предпочтительно изменять последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с примененным в организме специфичным "codon usage". Этот "codon usage" может легко определяться с помощью компьютерного сравнения других известных генов соответствующего организма.

В качестве организмов-хозяев для нуклеиновой кислоты по изобретению или конструкта нуклеиновой кислоты пригодны, в принципе, все прокариотические или эукариотические организмы. Предпочтительно в качестве организмов-хозяев применяют такие микроорганизмы, как бактерии, грибы или дрожжи. Предпочтительно применяют грамположительные или грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Streptomycetaceae, Mycobacteriaceae или Nocardiaceae, особенно препочтительно бактерии вида Escherichia, Pseudomonas, Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces или Rhodococcus. В особой степени предпочтительны роды Escherichia coli, Rhodococcus rhodochrous, Nocardia rhodochrous, Mycobacterium rhodochrous или Streptomyces lividans.

Организм-хозяин согласно изобретению содержит при этом преимущественно по меньшей мере один протеинный агент для укладки синтезированных им полипептидов и, в частности, описываемых в настоящем изобретении последовательностей нуклеионовых кислот с активностью нитрилазы и/или кодирующие этот агент гены, причем этот агент имеется в количестве, которое больше, чем количество, соответствующее основному количеству рассматриваемого микроорганизма. Кодирующие этот агент гены содержатся в хромосоме или в экстрахромосомных элементах, таких как, например, плазмиды.

Другим объектом изобретения является способ получения хиральных или ахиральных карбоновых кислот, отличающийся тем, что нитрилы в присутствии кодируемой нуклеиновыми кислотами по изобретению аминокислотной последовательности и растущего, покоящегося или открытого вышеприведенного микроорганизма (= организма-хозяина), который содержит или последовательность нуклеиновых кислот по изобретению, или конструкт нуклеиновых кислот по изобретению, который держит нуклеиновую кислоту по изобретению связанной с одним или несколькими регуляторными сигналами, или вектор по изобретению, преобразуют в хиральные или ахиральные карбоновые кислоты.

Предпочтительная форма выполнения способа по изобретению заключается в превращении хиральных или ахиральных алифатических нитрилов в соответствующие карбоновые кислоты.

Другая форма выполнения способа получения хиральных или ахиральных карбоновых кислот отличается тем, что нитрилы общей формулы I

преобразуют в присутствии кодируемой нуклеиновые кислоты по изобретению аминокислотной последовательности или растущего, покоящегося или раскрытого вышеприведенного микроорганизма, который содержит или последовательность нуклеиновых кислот по изобретению, или конструкт нуклеиновых кислот по изобретению, который держит нуклеиновую кислоту по изобретению связанной с одним или несколькими регуляторными сигналами, или вектор по изобретению, в карбоновые кислоты общей формулы II

причем заместители в формулах I и II имеют следующее значение:

n = равно 0 или 1

m = равно 0, 1, 2 или 3, причем при m>2 между двумя смежными атомами углерода не обязательно имеется двойная связь,

р = равно 0 или 1

А, В, D и Е означают независимо друг от друга СН, N или CR³

Н = означает О, S, NR⁴, СН или CR³, если n=0, или СН, N или CR³, если n=1,

причем два смежных остатка А, В, D, Е или Н вместе могут образовывать другое замещенное или незамещенное, ароматическое, насыщенное или ненасыщенное кольцо, содержащее от 5 до 8 атомов в кольце, которое может содержать один или несколько гетероатомов, таких как О, N или S, и причем не больше трех остатков А, В, D, Е или Н представляют собой гетероатом,

R¹ означает водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-C₁-алкилили C₁-С₁₀алкокси-, замещенный или незамещенный арил- или гетарил-, гидрокси-, галоген-, С₁-С₁₀-алкиламино- или амино-,

R² означает водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀алкил- или C₁-С₁₀алкокси-, замещенный или незамещенный арил- или гетарил-, гидрокси-, C₁-С₁₀алкиламино- или амино-,

R³ означает водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀алкил-, или C₁-С₁₀алкокси замещенный или незамещенный арил-, гетарил-, гидрокси-, галоген-, С₁-С₁₀алкиламино- или амино-,

R⁴ означает водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀алкил-.

R¹ означает в соединениях формул I и II водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀алкил- или C₁-С₁₀-алкокси-, замещенный или незамещенный арил- или гетарил-, гидрокси-, галоген- как фтор, хлор или бром, C₁-С₁₀алкиламино- или амино-.

В качестве алкильных остатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкильные остатки, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил-, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, n-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метил-пропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил. Предпочтительны метил, этил, н-пропил, н-бутил, и-пропил или и-бутил.

В качестве алкоксиостатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкокси-цепи, такие как, например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси, 1-метилпропокси, 2-метилпропокси, 1,1-диметилэтокси, пентокси, 1-метилбутокси, 2-метилбутокси, 3-метилбутокси, 1,1-диметилпропокси, 1,2-диметилпропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-этилпропокси, гексокси, 1-метилпентокси, 2-метилпентокси, 3-метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметилбутокси, 1,2-диметилбутокси, 1,3-диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3-диметилбутокси, 1-этилбутокси, 2-этилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-триметил-пропокси, 1-этил-1-метилпропокси, 1-этил-2-метилпропокси, гексилокси, гептилокси, оксилокси, нонилокси или децилокси и другие гомологи с разветвленными цепями.

В качестве арила- следует привести замещенные или незамещенные арильные остатки, которые содержат от 6 до 20 атомов углеродов. При этом речь идет о конденсированных друг к другу ароматических кольцах или о ароматических кольцах, которые связаны мостиками с помощью алкильных, алкилкарбонильных, алкенильных или алкенилкарбонильных цепей, карбонила, кислорода или азота. Арильные остатки могут быть соединены с основным скелетом еще через С₁-С₁₀алкильную, С₃-С₈алкенильную, С₃-С₆алкинильную или С₃-С₈-циклоалкильную цепь. Предпочтительны фенил или нафтил.

В качестве гетарила следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные кольцевые системы с одним или несколькими гетероароматическими, от 3- до 7-членными кольцами, которые могут содержать один или несколько гетероатомов, таких как N, О или S и, в случае необходимости, могут быть связаны через С₁-С₁₀-алкильные, С₃-С₈-алкенильные или С₃-С₈-циклоалкинильные цепи со скелетом. Примерами таких гетарильных остатков являются пиразол, имидазол, оксазол, изооксазол, тиазол, триазол, пиридин, хинолин, изохинолин, акридин, пиримидин, пиридазин, пиразин, феназин, пурин или птеридин. Гетарильные остатки могут быть связаны через гетероатомы или через различные атомы углерода в кольце или в кольцевой системе или через заместители со скелетом. Предпочтительны пиридин, имидпзол, пиримидин, пурин, пиразин или хинолин.

В качестве алкиламиноостатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкиламиноцепи, такие как, например, метиламино, этиламино, n-пропиламино, 1-метилэтиламино, n-бутиламино, 1-метилпропиламиноамино-, 2-метилпропиламино, 1,1-диметилэтиламино, n-пентиламино, 1-метилбутиламино, 2-метилбутиламино, 3-метилбутиламино, 2,2-диметилпропиламино, 1-этилпропиламино, н-гексиламино, 1,1-диметилпропиламино, 1,2-диметилпропиламино, 1-метилпентиламино, 2-метилпентиламино, 3-метилпентиламино, 4-метилпентиламино, 1,1-диметилбутиламино, 1,2-диметилбутиламино, 1,3-диметилбутиламино, 2,2-диметилбутиламино, 2,3-диметилбутиламино, 3,3-диметилбутиламино, 1-этилбутиламино, 2-этилбутиламино, 1,1,2-триметилпропиламино, 1,2,2-триметилпропиламино, 1-этил-1-метилпропиламино, 1-этил-2-метилпропиламино, н-гептиламино, н-окстиламино, н-нониламино или н-дециламино. Предпочтительны метиламино, этиламино, н-пропиламино, н-бутиламино, и-пропиламино или и-бутиламино.

В качестве заместителей приведенных остатков для R¹ пригодны, например, один или несколько таких заместителей, как галоген, такой, как фтор, хлор или бром, тио, циано, нитро, амино, гидрокси, алкил, алкокси, алкенил, алкенилокси, алкинил или другие ароматические или другие насыщенные или ненасыщенные неароматические кольца или кольцевые системы. Предпочтительны алкильные остатки, такие как С₁-С₆-алкил, например, метил, этил, пропил или бутил, арил, например, фенил, галоген, например, хлор, фтор или бром, гидрокси или амино.

R² означает в соединениях формул I и II водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀-алкил- или C₁-С₁₀-алкокси-, замещенный или незамещенный арил- или гетарил-, гидрокси-, C₁-С₁₀-алкиламиноили амино-.

В качестве алкильных остатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкильные цепи, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил-, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, n-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, n-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил. Предпочтение отдается метилу, этил, н-пропилу, н-бутилу, и-пропилу или и-бутилу.

В качестве алкоксиостатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкоксицепи, как например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси, 1-метилпропокси, 2-метилпропокси, 1,1-диметилэтокси, пентокси, 1-метилбутокси, 2-метилбутокси, 3-метилбутокси, 1,1-диметилпропокси, 1,2-диметилпропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-этилпропокси, гексокси, 1-метилпентокси, 2-метилпентокси, 3-метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметилбутокси, 1,2-диметилбутокси, 1,3-диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3-диметилбутокси, 1-этилбутокси, 2-этилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-триметилпропокси, 1-этил-1-метилпропокси, 1-этил-2-метилпропокси, гексилокси, гептилокси, октилокси, нонилокси или децилокси их гомологи с разветвленными цепями.

В качестве арила- следует привести замещенные или незамещенные, арильные остатки, которые содержат от 6 до 20 атомов углерода в кольце или в кольцевой системе. При этом речь может идти о конденсированных друг к другу ароматических кольцах или об ароматических кольцах, которые связаны мостиком через алкильные, алкилкарбонильные, алкенильные или алкенилкарбонильные цепи, карбонил, кислород или азот. Арильные остатки могут, в случае необходимости, быть связаны еще через C₁-С₁₀-алкильную, С₃-С₈-алкенильную, С₃-С₈-алкинильную или С₃-С₈-циклоалкильную цепь со скелетом. Предпочтительны фенил или нафтил.

В качестве гетарила- следует привести замещенные или незамещенные, простые или конденсированные ароматические кольцевые системы с одним или несколькими гетероароматическими 3- до 7-членными кольцами, которые могут содержать один или несколько таких гетероатомов, как N, О или S, и, в случае необходимости, могут быть связаны со скелетом через C₁-С₁₀-алкильную, С₃-С₈-алкенильную или С₃-С₈-циклоалкильную цепь. Примерами таких гетарильных остатков являются пиразол, имидазол, оксазол, изоксазол, тиазол, триазол, пиридин, хинолин, изохинолин, ацидин, пиримидин, пиридазин, пиразин, феназин, пурин или птеридин. Гетарильные остатки могут быть связаны со скелетом через гетероатомы или через различные атомы углерода в кольце или кольцевой системе или через заместители. Предпочтительны пиридин, имидазол, пиримидин, пурин, пиразин или хинолин.

В качестве алкиламиноостатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные С₁-С₁₀алкиламиноцепи, как например, метиламино, этиламино, н-пропиламино, 1-метилэтиламино, n-бутиламино, 1-метилпропиламиноамино-, 2-метилпропиламино, 1,1-диметилэтиламино, н-пентиламино, 1-метилбутиламино, 2-метилбутиламино, 3-метилбутиламино, 2,2-диметилпропиламино, 1-этилпропиламино, н-гексиламино, 1,1-диметилпропиламино, 1,2-диметилпропиламино, 1-метилпентиламино, 2-метилпентиламино, 3-метилпентиламино, 4-метилпентиламино, 1,1-диметилбутиламино, 1,2-диметилбутиламино, 1,3-диметилбутиламино, 2,2-диметилбутиламино, 2,3-диметилбутиламино, 3,3-диметилбутиламино, 1-этилбутиламино, 2-этилбутиламино, 1,1,2-триметилпропиламино, 1,2,2-триметилпропиламино, 1-этил-1-метилпропиламино, 1-этил-2-метилпропиламино, н-гептиламино, н-октиламино, н-нониламино или н-дециламино. Предпочтительны метиламино, этиламино, н-пропиламино, н-бутиламино, и-пропиламино или и-бутиламино.

В качестве заместителей приведенных остатков для R² пригодны, например, один или несколько таких заместителей, как галоген, например, фтор, хлор или бром, тио, нитро, амино, гидрокси, алкил, алкокси, алкенил, алкенилокси, алкинил или другие ароматические или другие насыщенные или ненасыщенные неароматические кольца или кольцевые системы. Предпочтительны при этом такие алкильные остатки, как C₁-С₆алкил, например, метил, этил, пропил или бутил, арил, например, фенил, галоген, например, хлор, фтор или бром, гидрокси или амино.

R³ означает в соединениях формул I и II водород, замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-С₁₀алкил- или C₁-С₁₀-алкокси-, замещенный или незамещенный арил- или гетарил-, гидрокси-, галоген, такой, как фтор, хлор или бром, C₁-С₁₀алкиламиноили амино-.

В качестве алкильных остатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-С₁₀алкильные цепи, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил-, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-окстил, н-нонил или н-децил. Предпочтительны метил, этил, н-пропил, н-бутил, и-пропил или и-бутил.

В качестве алкоксиостатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные С₁-С₁₀-алкоксицепи, например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси, 1-метилпропокси, 2-метилпропокси, 1,1-диметилэтокси, пентокси, 1-метилбутокси, 2-метилбутокси, 3-метилбутокси, 1,1-диметилпропокси, 1,2-диметилпропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-этилпропокси, гексокси, 1-метилпентокси, 2-метилпентокси, 3-метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметилбутокси, 1,2-диметилбутокси, 1,3-диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3-диметилбутокси, 1-этилбутокси, 2-этилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-триметилпропокси, 1-этил-1-метилпропокси, 1-этил-2-метилпропокси, гексилокси, гептилокси, октилокси, нонилокси или децилокси и из гомологи с разветвленными цепями.

В качестве арила- следует привести замещенные или незамещенные, арильные остатки, которые содержат от 6 до 20 атомов углерода в кольце или кольцевой системе. При этом речь может идти о конденсированных друг к другу ароматических кольцах или о ароматических кольцах, которые через алкильные, алкилкарбонильные, алкенильные или алкенилкарбонильные цепи, карбонил, кислород или азот связаны мостиками. Арильные остатки, в случае необходимости, могут быть еще связаны со скелетом через C₁-С₁₀алкильную, С₃-С₈алкенильную, С₃-С₈алкинильную или С₃-С₈циклоалкильную цепь. Предпочтительны фенил или нафтил.

В качестве гетарила- следует привести замещенные или незамещенные, простые или конденсированные ароматические кольцевые системы с одним или несколькими гетероароматическими 3- до 7-членными кольцами, которые могут содержать один или несколько гетероатомов, таких как N, О или S и, в случае необходимости, через C₁-С₁₀алкильную, С₃-С₈алкенильную или С₃-С₈-циклоалкильную цепь могут быть связаны со скелетом. Примерами подобных гетарильных остатков являются пиразол, имидазол, оксазол, изооксазол, тиазол, триазол, пиридин, хинолин, изохинолин, акридин, пиримидин, пиридазин, пиразин, феназин, пурин или птеридин. Гетарильные остатки могут быть связаны со скелетом через гетероатомы или через различные атомы углерода в кольце или кольцевой системе или через заместители. Предпочтительны пиридин, иимдазол, пиримидин, пурин, пиразин или хинолин.

В качестве алкиламиноостатков следует назвать замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-C₁₀-алкиламиноцепи, такие как, например, метиламино, этиламино, н-пропиламино, 1-метилэтиламино, н-бутиламино, 1-метилпропиламиноамино-, 2-метилпропиламино, 1,1-диметилэтиламино, н-пентиламино, 1-метилбутиламино, 2-метилбутиламино, 3-метилбутиламино, 2,2-диметилпропиламино, 1-этилпропиламино, н-гексиламино, 1,1-диметилпропиламино, 1,2-диметилпропиламино, 1-метилпентиламино, 2-метилпентиламино, 3-метилпентиламино, 4-метилпентиламино, 1,1-диметилбутиламино, 1,2-диметилбутиламино, 1,3-диметилбутиламино, 2,2-диметилбутиламино, 2,3-диметилбутиламино, 3,3-диметилбутиламино, 1-этилбутиламино, 2-этилбутиламино, 1,1,2-триметилпропиламино, 1,2,2-триметилпропиламино, 1-этил-1-метилпропиламино, 1-этил-2-метилпропиламино, н-гептиламино, н-окстиламино, н-нониламино или н-дециламино. Предпочтительны метиламино, этиламино, н-пропиламино, н-бутиламино, и-пропиламино или и-бутиламино.

В качестве заместителей приведенных остатков для R³ пригодны, например, один или несколько таких заместителей, как галоген, например, фтор, хлор или бром, тио, нитро, амино, гидрокси, алкил, алкокси, алкенил, алкенилокси, алкинил или другие ароматические или другие насыщенные или ненасыщенные неароматические кольца или кольцевые системы. Предпочтительны такие алкильные остатки, как C₁-C₆-алкил, такой как метил, этил, пропил или бутил, арил, такой как фенил, галоген, такой как фтор, хлор, или бром, гидрокси или амино.

R⁴ означает в соединениях формул I и II водород или замещенный или незамещенный, разветвленный или неразветвленный C₁-C₁₀алкил-.

В качестве алкильных остатков следует привести замещенные или незамещенные, разветвленные или неразветвленные C₁-C₁₀алкильные цепи, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил-, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил, н-нонил или н-децил. Предпочтительны метил, этил, н-пропил, н-бутил, и-пропил или и-бутил.

В качестве заместителей приведенных остатков для R⁴ пригодны, например, один или несколько таких заместителей, как галоген, такой как фтор, хлор или бром, тио, нитро, амино, гидрокси, алкил, алкокси, алкенил, алкенилокси, алкинил или другие ароматические или другие насыщенные или ненасыщенные неароматические кольца или кольцевые системы. Предпочтительны при этом такие алкильные остатки, как С₁-С₆алкил, такой как метил, этил, пропил или бутил, арил, такой как фенил, галоген, такой как хлор, фтор или бром, гидрокси или амино.

Также и алифатические, насыщенные или ненасыщенные динитрилы могут применяться в способе по изобретению.

Способ по изобретению проводится преимущественно при значении рН от 4 до 11, предпочтительно от 4 до 9.

Далее в способе применяют предпочтительно от 0,01 до 10 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 10 мас.%, особенно предпочтительно от 0,5 до 5 мас. нитрил