Ген синтеза клеточной стенки грибков

Ген синтеза клеточной стенки грибков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к ДНК, кодирующим белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки грибков, к белкам, кодируемым ДНК, способам определения того, влияет ли определенное соединение или не влияет на процесс транспорта, который заключается в транспорте GPI-заякоренных белков к клеточной стенке, и к противогрибковым средствам, влияющим на процесс транспорта, который заключается в транспорте GPI-заякоренных белков к клеточной стенке.

Область предпосылки

В последние годы умение справляться с инфекциями, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, приобретает даже большее значение, чем когда-либо, связано с увеличением количества пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом в результате современных способов химиотерапии и т.д. Глубокий микоз, обусловленный Candida, Aspergillus, Cryptococcus и подобными возбудителями, является причиной части указанных инфекций, и его доля с каждым годом увеличивается. Тот факт, что одна за другой появляются инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, такими как многие авирулентные бактерии, свидетельствует о том, что проблема инфекционных заболеваний не будет решена до тех пор, пока существуют основные заболевания, ослабляющие иммунные функции пациентов. Несмотря на то, что новые стратегии контроля инфекционных заболеваний, включая проблему резистентных бактерий, будут одной из ключевых проблем у быстро стареющего общества, в настоящее время существует очень мало эффективных терапевтических средств.

До настоящего времени терапевтические средства против грибковых инфекций главным образом разрабатывали на основе стратегии создания новых соединений путем химической модификации известной структуры. Однако вследствие таких проблем, как появление резистентных бактерий, существует насущная необходимость в разработке новых лекарственных средств на основе новых механизмов.

Принимая во внимание указанные обстоятельства, авторы изобретения сосредоточились на новом подходе в области противогрибковых средств, в которой еще нет достаточного разнообразия терапевтических средств. А именно, авторы данного изобретения сосредоточили внимание на влиянии предотвращения проявления патогенности патогенами на начало, развитие и персистенцию инфекций. Авторы изобретения полагали, что наиболее эффективным способом, чтобы избежать возникновения и развития инфекции, было бы ингибирование адгезии на хозяине, которая является первой стадией в возникновени инфекции и последующем развитии колонизации. Кроме того, также был осуществлен новый беспрецедентный способ, а именно ингибирование экспрессии факторов адгезии самими факторами.

Для того чтобы ингибировать экспрессию факторов адгезии, авторы данного изобретения обратили свое внимание на гипотезу о том, что гликопротеиды клеточной стенки, такие как факторы адгезии, сначала заякориваются GPI (гликозилфосфатидилинозитолом) на клеточной мембране, а затем транспортируются к клеточной стенке (фиг. 1). К настоящему времени обнаружено, что 30 или более гликопротеидов клеточной стенки, включая адгезионные лиганды, транспортируются посредством GPI-заякоривания (называемые GPI-заякоренными белками). Поэтому предположили, что если ингибировать указанную стадию транспорта, то вполне вероятно можно ингибировать экспрессию в клеточной стенке факторов адгезии и основных белков, составляющих клеточную стенку (Hamada K et al, Mol. Gen. Genet., 258: 53-59, 1998). Сообщалось, что GPI-заякоренные белки присутствуют у Candida, который является патогенным грибком (Kapteyn JC et al, Eur. J. Cell Biol., 65: 402-407, 1994).

Авторы изобретения начали свое исследование, полагая, что новые противогрибковые средства, которые ингибируют синтез клеточной стенки, можно получить путем ингибирования процесса, при котором GPI-заякоренные белки, существующие в клеточной мембране грибка, транспортируются к клеточной стенке.

Сущность изобретения

Целью данного изобретения является разработка противогрибковых средств, оказывающих воздействие, направленное против начала, развития и персистенции инфекций, путем ингибирования экспрессии гликопротеидов клеточной стенки, ингибирования сборки клеточной стенки, а также адгезии на клетках и предотвращения проявления патогенами патогенности.

Чтобы провести скрининг соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, авторы данного изобретения получили репортерную систему, в которой используется слитый белок, содержащий репортерный фермент и сигнал транспорта, существующий на С-конце одного из GPI-заякоренных белков, CWP2 (Van Der Vaat JM et al, J. Bacteriol., 177:3104-3110,1995).

Когда сконструировали ДНК, содержащую ген сигнала секреции + ген репортерного фермента + ген C-конца CWP2 (присутствует или отсутствует), и экспрессировали слитый белок в Saccharomyces cerevisiae (в дальнейшем называемый S. cerevisiae), было показано, что активность репортерного фермента выявляется в клеточной стенке в том случае, когда присутствует С-конец CWP2, и в супернатанте культуры в том случае, когда С-конец CWP2 отсутствует. Таким образом, было сделано предположение, что если процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, будет ингибирован тестируемым образцом, активность репортерного фермента в клеточной стенке будет уменьшаться или активность репортерного фермента будет выявляться в супернатанте культуры. Таким образом, был начат скрининг соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, с использованием указанной репортерной системы.

На основании скрининга с использованием указанной репортерной системы обнаружили несколько соединений, которые ингибируют процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке. Типичным примером является соединение формулы (Ia)

Соединение вышеуказанной формулы (Ia) (в дальнейшем сокращенно называемое "соединение (Ia)") ингибирует рост S. cerevisiae и Candida albicans (в дальнейшем называемого C. albicans), и C. albicans, культивируемый в присутствии вышеуказанного соединения (Ia), проявляет слабую способность к адгезии на клетках. Таким образом, подтвердили, что вышеуказанное соединение (Ia) подходит для достижения исходной цели изобретения, которая заключалась в том, чтобы найти соединение, ингибирующее адгезию грибков вследствие супрессии экспрессии адгезинов грибка на основе ингибирования транспортной системы GPI-заякоренных белков к клеточной стенке. Кроме того, наблюдения с использованием трансмиссионного электронного микроскопа подтвердили, что C. albicans, культивируемый в присутствии вышеуказанного соединения (Ia), имеет нарушения в синтезе своей клеточной стенки.

Используя вышеуказанное соединение (Ia), авторы данного изобретения доказали, что можно получить противогрибковые средства, основанные на механизме, который ингибирует процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке.

Кроме того, чтобы установить белок-мишень, на который действует вышеуказанное соединение (Ia), авторы данного изобретения провели поиск генов, которые придают резистентность вышеуказанному соединению (Ia).

Плазмидную библиотеку генов S. cerevisiae вводили в S. cerevisiae и на основании сверхэкспрессии собирали плазмиды, которые проявляли резистентность к вышеуказанному соединению (Ia). Затем резистентный ген клонировали, определяли нуклеотидную последовательность и ген назвали GWT1 (SEQ ID NO: 1). В S. cerevisiae, сверхэкспрессирующих продукт гена GWT1, вышеуказанный репортерный фермент, который имеет С-конец GPI-заякоренного белка, транспортировался к клеточной стенке даже в присутствии вышеуказанного соединения (Ia). Кроме того, наблюдения под трансмиссионным электронным микроскопом подтвердили, что клеточная стенка нормальна даже в присутствии вышеуказанного соединения (Ia).

Более того, в том случае, когда в геномную ДНК S. cerevisiae случайным образом вводили точечные мутации и выделяли мутантные штаммы R1 и R5, проявляющие специфичную резистентность к вышеуказанному соединению (Ia), обнаружили точечные мутации, заключающиеся в изменениях 405-го кодона гена GWT1 GTC в ATC в мутантном штамме R1 и 140-го кодона GGG в AGG в мутантном штамме R5. Так как резистентность к вышеуказанному соединению (Ia) выявлялась в том случае, когда указанные мутантные гены GWT1 вводили в штамм с нарушенным геном GWT1, обнаружено, что резистентность к данному соединению объясняется только геном GWT1. Следовательно, это подтверждает, что вышеуказанное соединение (Ia) действует непосредственно на продукт гена GWT1, ингибируя функцию белка GWT1.

Подобными способами клонировали резистентные гены C. albicans (SEQ ID NO: 3 и 5), определяли нуклеотидные последовательности и назвали гены CaGWT1.

Кроме того, поиск гомологии в базе данных с использованием GWT1 выявил гомолог (SEQ ID NO: 27) Schizosaccharomyces pombe (называемого в дальнейшем S. pombe). Кроме того, ПЦР с праймерами, основанными на последовательности высоко консервативной области белков, кодируемых генами GWT1 S. cerevisiae, S. pombe и С.albicans, дала гомологи (SEQ ID NO: 39 и 41) Aspergillus fumigatus (в дальнейшем называемого А. fumigatus). Кроме того, выполнение ПЦР, основанной на последовательности, обнаруженной в результате поиска гомологии с GWT1 в базе данных, выявило гомологи (SEQ ID NO: 54 и 58) Cryptococcus neoformans (в дальнейшем называемого С. neoformans).

Более конкретно, данное изобретение относится к следующим объектам:

1) ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью в придании грибку резистентности к соединению, указанному в формуле (Ia), в том случае, когда ДНК сверхэкспрессируется в грибке, где ДНК выбрана из группы, состоящей из следующего:

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или встроены,

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30

2) ДНК, которая кодирует белок, обладающий активностью в снижении количества GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка вследствие дефекта в функции ДНК, где ДНК выбрана из группы, состоящей из

(a) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(c) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 27, 39, 41, 54 или 58,

(d) ДНК, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 6, 28, 40 или 59, в которой одна или более аминокислот присоединены, делетированы, замещены и/или встроены, и

(e) ДНК, которая амплифицирована с использованием в качестве праймеров SEQ ID NO: 29 и 31 или SEQ ID NO: 29 и 30,

и где «жесткие условия» относятся, например, к гибридизации в 4 × SSC при 65°С с последующей промывкой в 0,1 × SSC в течение 1 часа при 65°С; или в другом способе «жесткие условия» представляют собой 4 × SSC при 42°С в 50% формамиде; или гибридизацию в растворе PerfectHyb™ (TOYOBO) в течение 2,5 часов при 65°С с последующей промывкой в (i) растворе 2 × SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 5 минут, (ii) растворе 2 × SSC, 0,05% SDS при 25°С в течение 15 минут и (iii) растворе 0,1 × SSC, 0,1% SDS при 50°С в течение 20 минут;

«дефект функции ДНК» может возникать в том случае, когда функциональный генный продукт ДНК не экспрессируется, или в том случае, когда экспрессия снижена, например, в результате встраивания ДНК, которая не соответствует кодирующему району ДНК, например, селектируемого маркера, с использованием технологии гомологичной рекомбинации;

и уменьшение количества белка, получаемого из GPI-заякоренного белка в клеточной стенке грибка, определяют с использованием любого из следующих способов отдельно или в комбинации: (i) репортерной системы, отражающей процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке, (ii) ELISA, в котором оценивается количество GPI-заякоренного белка в клеточной стенке, (iii) измерения активности GPI-заякоренного белка, такой как адгезия на клетках животных, или (iv) наблюдения гифовой, фибриллярной структуры самого наружного слоя клетки грибка с использованием трансмиссионного электронного микроскопа;

3) белку, кодируемому указанной выше, в пунктах 1 или 2, ДНК;

4) вектору для трансформации клетки, в который встроена ДНК, указанная выше, в пунктах 1 или 2;

5) ДНК, указанной выше, в пунктах 1 или 2, используемой для включения в трансформант;

6) вектору, указанному в пункте 4, используемому для включения в трансформант;

7) способу получения белка, указанного в пункте 3, который включает в себя стадии культивирования указанного выше трансформанта и сбора экспрессированного белка из трансформанта или из супернатанта его культуры;

8) антителу, которое связывается с указанным выше в пункте 3 белком;

9) противогрибковому средству, содержащему в качестве активного ингредиента антитело, указанное выше в пункте 8.

Помимо указанного, в настоящей заявке описаны следующие объекты, относящиеся к данному изобретению.

- Противогрибковое средство, содержащее в качестве активного ингредиента соединение, представленное общей формулой (I), его соль или его гидрат, где в формуле (I)

[R^1a и R^2a идентичны или отличаются друг от друга, и каждый в отдельности обозначает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, замещенную или незамещенную C_1-6алкоксигруппу или группу, представленную формулой

(где X¹ обозначает прямую связь, карбонильную группу или группу, представленную формулой -S(O)₂-;

R^5а и R^6a идентичны или отличаются друг от друга и обозначают атом водорода или замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу). Кроме того, R^1а и R^2а вместе могут образовывать конденсированное кольцо, выбранное из группы, состоящей из замещенного или незамещенного бензольного кольца, замещенного или незамещенного пиридинового кольца, замещенного или незамещенного пиррольного кольца, замещенного или незамещенного кольца тиофена, замещенного или незамещенного фуранового кольца, замещенного или незамещенного кольца пиридазина, замещенного или незамещенного кольца пиримидина, замещенного или незамещенного кольца пиразина, замещенного или незамещенного имидазольного кольца, замещенного или незамещенного оксазольного кольца, замещенного или незамещенного тиазольного кольца, замещенного или незамещенного пиразольного кольца, замещенного или незамещенного изоксазольного кольца, замещенного или незамещенного изотиазольного кольца, замещенного или незамещенного кольца циклогексана и замещенного или незамещенного кольца циклопентана;

R^3a и R^4a идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, карбоксильную группу, формильную группу, гидроксииминогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, C_1-6алкильную группу, C_1-6алкоксигруппу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, группу, представленную формулой -C(O)NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности обозначает атом водорода или C_1-6алкильную группу), формулой -CO₂R^7a (где R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(O)_nR^7a (где n обозначает целое число 0-2 и R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(О)₂NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), группу формулы

(где X² означает прямую связь, карбонильную группу или группу формулы -S(О)₂-;

R^5b и R^6b идентичны или отличаются друг от друга и означают атом водорода, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу или замещенную или незамещенную С_6-14арильную группу), или группу формулы

-Z¹-Z²

(где Z¹ означает прямую связь, атом кислорода, виниленовую или этиниленовую группу;

Z² означает прямую связь или C_1-6алкильную группу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями). R^3a и R^4a вместе могут обозначать метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу, альтернативно R^3a и R^4a вместе могут означать образование конденсированного кольца, выбранного из группы, состоящей из замещенного или незамещенного бензольного кольца, замещенного или незамещенного пиридинового кольца, замещенного или незамещенного пиррольного кольца, замещенного или незамещенного кольца тиофена, замещенного или незамещенного фуранового кольца, замещенного или незамещенного кольца пиридазина, замещенного или незамещенного кольца пиримидина, замещенного или незамещенного кольца пиразина, замещенного или незамещенного имидазольного кольца, замещенного или незамещенного оксазольного кольца, замещенного или незамещенного тиазольного кольца, замещенного или незамещенного пиразольного кольца, замещенного или незамещенного изоксазольного кольца, замещенного или незамещенного изотиазольного кольца, замещенного или незамещенного кольца циклогексана и замещенного или незамещенного кольца циклопентана, за исключением случаев, когда оба R^1a и R^2a обозначают атомы водорода].

- Указанное выше противогрибковое средство, содержащее в качестве активного ингредиента соединение (Ia) формулы

- Соединение, представленное общей формулой (II), его соль или гидрат, где в формуле (II)

[Ar означает заместитель, выбранный из группы, состоящей из формул (IIIa)-(IIIf)

(где К означает атом серы, атом кислорода или группу, представленную формулой -NH-;

R^1b и R^2b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, группу, представленную формулой

(где X³ означает прямую связь, карбонильную группу или группу, представленную формулой -S(O)₂-;

R^5c и R^6c идентичны или отличаются друг от друга и означают атом водорода или замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу), или группу, представленную формулой -X⁴-R^8a (где X⁴ означает прямую связь, атом кислорода или атом серы; R^8a означает C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, C_3-8циклоалкильную группу или C_3-8циклоалкенильную группу). Альтернативно, R^1b и R^2b вместе могут образовывать метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу);

R^3b и R^4b идентичны или отличаются друг от друга и каждый в отдельности означает атом водорода, атом галогена, гидроксильную группу, нитрогруппу, цианогруппу, карбоксильную группу, формильную группу, гидроксииминогруппу, трифторметильную группу, трифторметоксигруппу, C_1-6алкильную группу, C_1-6алкоксигруппу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу или группу, представленную формулой

-z^1b-z^2b

(где Z^1b означает прямую связь, виниленовую группу или этиниленовую группу;

Z^2b означает прямую связь или C_1-6алкильную группу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями);

за исключением случаев, когда (1) Ar означает указанную выше формулу (IIId), где R^1b и R^2b оба являются атомами водорода, (2) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, метоксигруппой, гидроксильной группой, метильной группой, бензилоксигруппой или атомом галогена, и Ar означает вышеуказанную формулу (IIIc), где оба R^1b и R^2b означают атомы водорода или метоксигруппы, (3) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, гидроксильной группой, метоксигруппой или бензилоксигруппой, и Ar означает вышеуказанную формулу (IIIc), где оба R^1b и R^2b означают гидроксильные группы или бензилоксигруппы, или (4) Ar означает вышеуказанную формулу (IIId), где R^1b является атомом водорода, a R^2b является формильной группой, гидроксиметильной группой или метоксикарбонильной группой].

- Указанное выше соединение или его соль или гидрат, где Ar имеет формулу

(где R^1c означает атом водорода, замещенную или незамещенную C_1-6алкильную группу или бензильную группу), и за исключением случая, когда R^3b означает атом водорода.

- Соединение, представленное общей формулой (IIIc2), или его соль или гидрат, где в формуле (IIIc2)

[R^1b и R^2b имеют такое же значение, как указано выше, за исключением случаев, когда (1) R^1b означает группу, представленную формулой R^1c-O- (где R^1c имеет такое же значение, как указано выше), R^2b является атомом водорода и R^3b означает атом водорода, (2) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, метоксигруппой, гидроксильной группой, метильной группой, бензилоксигруппой или атомом галогена, и оба R^1b и R^2b означают атомы водорода или метоксигруппы, или (3) по меньшей мере один из R^3b или R^4b означает атом водорода, а другой является атомом водорода, гидроксильной группой, метоксигруппой или бензилоксигруппой, и оба R^1b и R^2b означают гидроксильные группы или бензилоксигруппы].

- Противогрибковое средство, где по меньшей мере один из R^3a и R^4a означает группу, представленную формулой -C(O)NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), формулой -CO₂R^7a (где R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S(O)_nR^7a (где n означает целое число 0-2 и R^7a имеет такое же значение, как указано выше), формулой -S (O)₂NR^7aR^7b (где R^7a и R^7b имеют такое же значение, как указано выше), формулой

(где X², R^5b и R^6b имеют такие же значения, как определено выше), или C_1-6алкоксигруппу, замещенную или незамещенную 0-4 заместителями, или R^3a и R^4a вместе означают метилендиоксигруппу или 1,2-этилендиоксигруппу.

- Указанное выше противогрибковое средство, где соединение, обладающее противогрибковым действием, представляет собой

(1) 1-бензилизохинолин,

(2) 1-(4-бромбензил)изохинолин,

(3) 1-(4-хлорбензил)изохинолин,

(4) 1-(4-фторбензил)изохинолин,

(5) 1-(4-иодбензил)изохинолин,

(6) 1-(3-метилбензил)изохинолин,

(7) 1-(4-метилбензил)изохинолин,

(8) 1-(3,4-диметилбензил)изохинолин,

(9) 1-(3-метоксибензил)изохинолин,

(10) 1-(4-метоксибензил)изохинолин,

(11) 1-(3,4-метилендиоксибензил)изохинолин,

(12) 1-(4-бензилоксибензил)изохинолин,

(13) 1-(4-цианобензил)изохинолин,

(14) 1-(4-нитробензил)изохинолин,

(15) 1-(4-аминобензил)изохинолин,

(16) 1-(4-метоксибензил)-6,7-дихлоризохинолин,

(17) 1-(4-метокси-2-нитробензил)изохинолин,

(18) 1-(4-метоксибензил)-6,7-метилендиоксиизохинолин,

(19) 1-(2-амино-4-метоксибензил)изохинолин,

(20) 1-(4-метоксибензил)-7-гидрокси-6-метоксиизохинолин,

(21) 1-(4-бензилоксибензил)-6,7-диметоксиизохинолин,

(22) 1-(4-метоксибензил)-6,7-диметоксиизохинолин,

(23) 1-(4-метокси-2-нитробензил)изохинолин,

(24) 3-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]пропилцианид,

(25) 1-[4-(2,2,3,3-тетрафторпропокси)бензил]изохинолин,

(26) 1-[4-(2-пиперидиноэтокси)бензил]изохинолин,

(27) 4-(1-изохинолилметил)фенил(2-морфолиноэтиловый)эфир,

(28) 1-[4-(2-метоксиэтокси)бензил]изохинолин,

(29) N-{2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]этил}-N,N-диметиламин,

(30) 1-[4-(фенетилокси)бензил]изохинолин,

(31) 1-{4-[(2-метилаллил)окси]бензил}изохинолин,

(32) 1-(4-изобутоксибензил)изохинолин,

(33) 1-[4-(2-феноксиэтокси)бензил]изохинолин,

(34) метил-2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]ацетат,

(35) 2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-этанол,

(36) трет-бутил-N-{2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]этил}карбамат,

(37) 1-{4-[3-(тетрагидро-2Н-2-пиранилокси)пропокси]бензил}изохинолин,

(38) 2-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-этанамин,

(39) 1-[4-(3-пиперидинопропокси)бензил]изохинолин,

(40) 3-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]-1-пропанол,

(41) 1-[4-(2-этилбутокси)бензил]изохинолин,

(42) 4-[4-(1-изохинолилметил)фенокси]бутановая кислота,

(43) 1-(4-{3-[(4-бензилпиперазино)сульфонил]пропокси}бензил)изохинолин,

(44) 1-(4-{3-[4-(4-хлорфенил)пиперазино]пропокси}бензил)изохинолин,

(45) 4-(1-изохинолилметил)анилин,

(46) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]бутанамид,

(47) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]пропанамид,

(48) N- [4-(1-изохинолилметил)фенил]-1-этансульфонамид,

(49) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метилэтансульфонамид,

(50) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метиламин,

(51) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-пропиламин или

(52) N-[4-(1-изохинолилметил)фенил]-N-метил-N-пропиламин;

- Способ лечения грибковой инфекции, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективной дозы указанных выше противогрибковых средств.

Далее данное изобретение будет описано подробно посредством объяснения значения терминов, символов и тому подобного, приведенных в данном описании.

В данном описании для удобства структурная формула соединений может представлять определенный изомер, однако данное изобретение включает все геометрические изомеры, оптические изомеры, основанные на асимметричном атоме углерода, стереоизомеры и таутомеры, которые возникают, исходя из структуры соединений, и смеси изомеров, и это не следует толковать как ограничение представлением в виде формулы, сделанным для удобства, и это может быть любое одно соединение или смесь изомеров. Следовательно, может существовать оптически активное вещество и рацемическое вещество, имеющее асимметричный атом углерода, но в данном изобретении нет конкретных ограничений и может быть включено любое из них. Кроме того, может существовать полиморфизм кристаллов, но ограничений также нет, и кристаллическая форма может быть любой одной формой или может быть смесью и может быть либо в виде ангидрида, либо гидрата.

Кроме того, соединения согласно данному изобретению включают соединения, проявляющие противогрибковое действие после того, как они подвергаются метаболизму, а именно после окисления, восстановления, гидролиза или ковалентного связывания in vivo. Кроме того, данное изобретение включает соединения, которые определяют выход соединения согласно данному изобретению после того, как подвергаются метаболизму, а именно после окисления, восстановления и гидролиза in vivo.

"C_1-6алкильная группа" в данном описании означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 1 до 6, и конкретные примеры включают метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, изобутильную группу, трет-бутильную группу, н-пентильную группу, изопентильную группу, неопентильную группу, н-гексильную группу, 1-метилпропильную группу, 1,2-диметилпропильную группу, 2-этилпропильную группу, 1-метил-2-этилпропильную группу, 1-этил-2-метилпропильную группу, 1,1,2-триметилпропильную группу, 1-метилбутильную группу, 2-метилбутильную группу, 1,1-диметилбутильную группу, 2,2-диметилбутильную группу, 2-этилбутильную группу, 1,3-диметилбутильную группу, 2-метилпентильную группу, 3-метилпентильную группу и так далее.

"C_2-6алкенильная группа" в данном описании означает алкенильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 2 до 6, и конкретные примеры включают винильную группу, аллильную группу, 1-пропенильную группу, изопропенильную группу, 1-бутен-1-ильную группу, 1-бутен-2-ильную группу, 1-бутен-3-ильную группу, 2-бутен-1-ильную группу, 2-бутен-2-ильную группу и так далее.

"C_2-6алкинильная группа" в данном описании означает алкинильную группу с прямой или разветвленной цепью, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 2 до 6, и конкретные примеры включают этинильную группу, 1-пропинильную группу, 2-пропинильную группу, бутинильную группу, пентинильную группу, гексинильную группу и так далее.

"C_1-6алкоксигруппа" в данном описании означает оксигруппу, с которой связана "C_1-6алкильная группа", определенная выше, и конкретные примеры включают метоксигруппу, этоксигруппу, н-пропоксигруппу, изопропоксигруппу, н-бутоксигруппу, изобутоксигруппу, втор-бутоксигруппу, трет-бутоксигруппу, н-пентилоксигруппу, изопентилоксигруппу, втор-пентилоксигруппу, трет-пентилоксигруппу, неопентилоксигруппу, 1-метилбутоксигруппу, 2-метилбутоксигруппу, 1,1-диметилпропоксигруппу, 1,2-диметилпропоксигруппу, н-гексилоксигруппу, изогексилоксигруппу, 1-метилпентилоксигруппу, 2-метилпентилоксигруппу, 3-метилпентилоксигруппу, 1,1-диметилбутоксигруппу, 1,2-диметилбутоксигруппу, 2,2-диметилбутоксигруппу, 1,3-диметилбутоксигруппу, 2,3-диметилбутоксигруппу, 3,3-диметилбутоксигруппу, 1-этилбутоксигруппу, 2-этилбутоксигруппу, 1,1,2-триметилпропоксигруппу, 1,2,2-триметилпропоксигруппу, 1-этил-1-метилпропоксигруппу, 1-этил-2-метилпропоксигруппу и так далее.

"C_6-14арильная группа" в данном описании относится к ароматической кольцевой группе, в которой количество атомов углерода находится в пределах от 6 до 14, и конкретные примеры включают фенильную группу, 1-нафтильную группу, 2-нафтильную группу, as-индаценильную группу, s-индаценильную группу, аценафтиленильную группу и так далее.

"Атом галогена" в данном описании означает атом фтора, атом хлора, атом брома и атом иода.

"Замещенный или незамещенный" в данном описании означает, что "замещаемый сайт может иметь произвольную комбинацию одного или более заместителей" и, в частности, заместители представляют собой, например, атом водорода, галоген, нитрогруппу, цианогруппу, гидроксильную группу, меркаптогруппу, гидроксиалкильную группу, карбоксильную группу, C_1-6алкоксикарбонильную группу, C_2-7ациламиногруппу, C_1-6алкиламиногруппу, пиридильную группу, C_1-6алкилсульфинильную группу, C_1-6алкилсульфонильную группу, C_1-6алкилсульфамоильную группу, C_1-6алкилсульфинамоильную группу, C_1-6алкилсульфенамоильную группу, тетрагидропиранильную группу, C_1-6алкилкарбамоильную группу или группу формулы -X⁴-R^8a (где X⁴ обозначает прямую связь, атом кислорода или атом серы; R^8a обозначает C_1-6алкильную группу, C_2-6алкенильную группу, C_2-6алкинильную группу, C_6-14арильную группу, C_3-8циклоалкильную группу или C_3-8циклоалкенильную группу) и так далее.

"Может быть замещен 0-4 заместителями" имеет такое же значение, как "замещаемый сайт может иметь произвольную комбинацию 1-4 заместителей", и заместители имеют такое же значение, как определено выше.

"Соль" в данном изобретении относится к фармацевтически приемлемой соли, и нет конкретных ограничений, при условии, что соль образована в виде аддитивной соли с соединением согласно изобретению, и предпочтительным примером является соль галогенводородной кислоты, такая как гидрофторид, гидрохлорид, гидробромид и гидроиодид; соль неорганической кислоты, такая как сульфат, нитрат, перхлорат, фосфат, карбонат и бикарбонат; органический карбоксилат, такой как ацетат, оксалат, малеат, тартрат и фумарат; органический сульфонат, такой как метансульфонат, трифторметансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, толуолсульфонат и камфорсульфонат; соль аминокислоты, такая как аспартат и глутамат; соли с аминами, такими как триметиламин, триэтиламин, прокаин, пиридин и фенетилбензиламин; соли щелочных металлов, таких как натрий и калий; соли щелочноземельных металлов, таких как магний и кальций, и так далее.

Далее будет раскрыто следующее. 1. Способ получения ДНК, кодирующих белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки. 2. Способ определения того, влияет или нет тестируемый образец на процесс, при котором GPI-заякоренные белки транспортируются к клеточной стенке. 3. Способ получения вышеуказанного соединения (Ia) согласно данному изобретению.

1. Способ получения ДНК, кодирующих белки, принимающие участие в синтезе клеточной стенки грибков.

В дальнейшем будет описан (1) способ получения ДНК, кодирующей белок для придания резистентности к вышеуказанному соединению (Ia) при сверхэкспрессии у грибков; (2) способ получения ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с ДНК SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5; (3) способ получения ДНК, кодирующей белок, который принимает участие в синтезе клеточной стенки грибка, на основании поиска гомологии, и (4) способ получения грибка, в котором сверхэкспрессируется или отсутствует белок для придания резистентности к указанному выше соединению (Ia).

(1) Способ получения ДНК, кодирующей белок для придания резистентности к указанному выше соединению (Ia) при сверхэкспрессии ДНК у грибка.

В данном описании "грибок" означает грибок, относящийся к типу Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota и Deuteromycota. Предпочтительно, гриб является патогенным грибком (Mucor, Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Malassezia, Aspergillus, Trichophyton, Microsporum, Sporothrix, Blastmyces, Coccidioides, Paracoccidioides, Penicillinium или Fusarium) и более предпочтительно представляет собой C. albicans, C. glabrata, C. neoformans или A. fumigatus. Предпочтительными штаммами также являются S. cerevisiae и S. pombe, для которых легко проводить генетический анализ.

Плазмидную библиотеку генов грибка вводят в грибок. Плазмидную библиотеку S. cerevisiae и S. pombe можно получить из ATCC (регистрационный номер ATCC: 37323) и плазмидную библиотеку C. albicans можно получить способом согласно Navaro-Garcia, F. et al, Mol. Cell. Biol., 15: 2197-2206, 1995. Полученную плазмидную библиотеку вводят в грибки способом согласно Gietz, D. et al, Nucl. Acids Res. 20: 1425, 1992. Альтернативно, можно использовать набор, такой как система трансформации дрожжей YEASTMAKER^TM (Clontech).

Грибок, в который вводят плазмидную библиотеку, культивируют в присутствии вышеуказанного соединения (Ia). В частности, на агаровой среде, содержащей вышеуказанное соединение (Ia) в концентрации от 1,56 до 25 мкг/мл, предпочтительно от 1,56 до 6,25 мкг/мл и более предпочтительно 3,125 мкг/мл, инокулируют грибок, в который была введена плазмидная библиотека, культивируют в течение соответствующего периода времени при температуре 30°С-42°С в течение от 2 до 5 дней или предпочтительно при 37°С в течение 3 дней. Образованную после пролиферации колонию далее культивируют в среде, содержащей вышеуказанное соединение (Ia), и из пролиферирующих клеток грибков очищают плазмиду. Очистку плазмиды можно осуществить, например, способом согласно Methods in Enzymology, Vol. 194: 169-182 (1991).

Предпочтительно нуклеотидную последовательность полученной плазмиды определяют сразу, но при необходимости, для того чтобы определить нуклеотидную последовательность, проводят клонирование в соответствующем векторе, например pBluescript II и pUC19, подходящем для определения нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность, например, можно определить способом согласно руководству, прилагаемому к системе ABI377 (PE applied Biosystems).

В примерах данного изобретения все 27 независимо полученных колоний S. cerevisiae и 28 колоний из 30 колоний C. albicans содержали ДНК согласно данному изобретению. В указанных грибках с