Аналоги соматостатина

Аналоги соматостатина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к пептидным миметикам соматостатина, способу их получения и к содержащим их фармацевтическим композициям.

Более конкретно настоящее изобретение относится к соединению формулы

которое называют также цикло[{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe], обозначенному в настоящем описании как соединение А, а также к его диастереоизомерам и их смесям, в свободной форме, в форме соли или комплекса или в защищенной форме. Phg обозначает -HN-СН(С₆Н₅)-СО-, а Bzl обозначает бензил.

Соединение А в защищенной форме соответствует указанной выше молекуле, в которой по меньшей мере одна из аминогрупп является защищенной и после удаления защитной группы, предпочтительно удаляемой в физиологических условиях, превращается в соединение А. Приемлемыми аминозащитными группами являются группы, описанные, например, в "Protective Groups in Organic Synthesis", Т. W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287, содержание публикации включено в настоящее описание в качестве ссылки. Примером аминозащитной группы является ацетил.

Когда соединение А присутствует в форме комплекса, то оно может представлять собой соединение А, несущее хелатирующую группу на боковой цепи аминогруппы Pro и образующее комплекс с обнаруживаемым или меченным с помощью радиоизотопа терапевтическим элементом (радиотерапевтическим элементом). Соединение А, несущее хелатирующую группу, обозначено в настоящем описании как конъюгированное соединение А.

Примеры хелатирующих групп включают, например, группы, являющиеся производными полиаминополикарбоновых кислот или ангидридов, например, группы, являющиеся производными нециклических лигандов, например диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПК), этиленгликоль-0,0'-бис(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТК), N,N'-бис(гидроксибензил)этилендиамин-N,N'-диуксусной кислоты (ГБЭД) и триэтилентетрамингексауксусной кислоты (ТТГК), группы, являющиеся производными замещенной ДТПК, например пара-изотиоцианатбензил-ДТПК, группы, являющиеся производными макроциклических лигандов, например, 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусной кислоты (ДОТК) и 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусной кислоты (ТЕТК) или 1,4,7,10-тетраазациклотридекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусной кислоты (ТИТРК).

Хелатирующие группы можно присоединять к боковой цепи аминогруппы Pro либо непосредственно, либо через спейсер. Приемлемые спейсеры включают спенсеры, известные в данной области, например, описанные в GB-A-2225579, например двухвалентный остаток аминокарбоновой кислоты, например, β-Ala, или двухвалентный остаток 6-аминокапроновой кислоты.

Предпочтительные хелатирующие группы являются производными ДТПК, ДОТК или ТЕТК. Наиболее предпочтительными являются хелатирующие группы, являющиеся производными ДТПК или ДОТК.

Под обнаруживаемым элементом понимают любой элемент, предпочтительно ион металла, который можно обнаруживать in vivo с помощью диагностических методов, например ион металла, испускающий изучение, которое можно обнаруживать, или ион металла, который может оказывать воздействие на релаксацию ЯМР. Под радиотерапевтическим элементом понимают любой элемент, испускающий излечение, оказывающее положительное воздействие на подлежащее лечению состояние.

Приемлемые элементы включают, например, элементы тяжелых металлов или ионы редкоземельных металлов, например, применяемые для КАТ-сканирования (компьютерная трансаксиальная томография), парамагнитные ионы, например, Gd^3-, Fe³⁺, Mn²⁺ и Cr²⁺, флуоресцентные ионы металлов, например Eu³⁺ и радионуклиды, например радиолантанид, в частности радионуклид, испускающий γ-лучи, радионуклид, испускающий β-лучи, радионуклид, испускающий α-лучи, радионуклид, испускающий Оже-е^--излучение или испускающий позитроны радионуклид, например, ⁶⁸Ga, ¹⁸F или ⁸⁶Y.

Приемлемые испускающие γ-лучи радионуклиды включают радионуклиды, которые можно применять в методах диагностики. Испускающие γ-лучи радионуклиды предпочтительно имеют период полураспада от 1 ч до 40 дней, предпочтительно от 5 ч до 4 дней, более предпочтительно от 12 ч до 3 дней. Примерами радиоизотопов галлия, индия, технеция, иттербия, рения, тербия, лютеция, таллия и самария являются, например ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ^99mTc, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁹Yb, ¹⁸⁶Re или ¹⁷⁷Lu.

Приемлемые испускающие β-лучи радионуклиды включают радионуклиды, которые можно применять в радиотерапии, например, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁶⁹Er, ¹²¹Sn, ¹²⁷Те, ¹⁷⁷Lu, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁰⁹Pd, ¹⁶⁵Dy, ¹⁴²Pr или ¹⁵³Sm.

Приемлемые испускающие α-лучи радионуклиды представляют собой радионуклиды, которые можно применять в терапевтических целях, например ²¹¹At, ²¹²Bi или ²⁰¹Tl.

Соединение А может находится, например, в свободной форме или в форме соли. Соли включают кислотно-аддитивные соли, например неорганических кислот, полимерных кислот или органических кислот, например, соляной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, аспарагиновой кислоты, бензойной кислоты, янтарной кислоты или памовой кислоты. Кислотно-аддитивные соли могут присутствовать в виде одно- или двухвалентных солей, например в зависимости от того, один или два эквивалента кислоты добавляют к соединению А в форме свободного основания. Предпочтительными солями являются лактат, аспартат, бензоат, сукцинат и памоат, включая их одно- и двухвалентные соли, более предпочтительно двукислый аспартат и монокислый памоат.

Конъюгированное соединение А может существовать также в формах солей, получаемых с помощью групп карбоновых кислот, присутствующих в хелатирующей группе, например, солей щелочных металлов, таких как натрий или калий, или замещенных или незамещенных аммонийных солей.

Настоящее изобретение относится также к способу получения соединения А. Его можно получать по аналогии с известными методами, например:

а) путем циклизации линейного пептида в защищенной, связанной с полимером или незащищенной форме, таким образом, чтобы получать соединение А, и затем необязательно удаления защитных(ой) групп(ы),

б) для получения конъюгированного соединения А путем связывания хелатирующей группы и соединения А в защищенной или незащищенной форме и затем необязательного удаления защитной группы и путем выделения полученного таким образом соединения А или конъюгированного соединения А в свободной форме, в форме соли или необязательно в форме комплекса с обнаруживаемым или радиотерапевтическим элементом.

Как правило, выбор аминокислоты, находящейся на С-конце относительно начала пептидной цепи, не имеет решающего значения, поскольку линейный пептид должен быть циклизован, единственным условием является то, что последовательность аминокислот в линейном пептиде должна соответствовать их последовательности в соединении А. Однако известны другие факторы, которые могут обусловливать предпочтение одной стартовой аминокислоты относительно другой. Когда соединение А получают с помощью твердофазного синтеза, то первую аминокислоту предпочтительно связывают со смолой, например, с поступающим в продажу полистиролом, через приемлемый линкер, например линкер, который отщепляется в мягких условиях, сохраняя при этом защиту боковой цепи, например, такой линкер, как SASRIN, или необязательно замещенный содержащий тритил линкер, например, 4-(гидроксидифенилметил)бензойная кислота, в которой одна из фенильных групп необязательно может быть замещена, например Cl. Создание требуемой пептидной цепи можно осуществлять общепринятым методом, например с помощью остатков аминокислот, в которых концевая аминогруппа защищена с помощью Fmoc, боковые цепи аминогрупп, если они присутствуют, должны быть защищены различными аминозащитными группами, например Вос или КБО. Предпочтительно линейный пептид циклизуют таким образом, чтобы получать связь между Tyr(4-Bzl)-OH и Phe, например, Phe-{4-(NHR₁-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp(R₂)-Lys(ε-NHR₃)-Tyr(4-Bzl)-OH или его функционально активное производное, где R₁, R₂ и R₃ каждый обозначает аминозащитную группу. Стадию циклизации а) можно осуществлять с помощью известного метода, например с помощью азида, активного сложного эфира, смешанного ангидрида или карбодиимида. После этого защитные группы удаляют, например, путем расщепления, например с помощью трифторуксусной кислоты или гидрированием.

Циклизацию пептида можно также осуществлять непосредственно на твердой подложке, при этом первая аминокислота защищена на Nα-и С-конце и присоединена через боковую цепь, например, через ε-аминофункцию Lys или путем прикрепления к основе. Затем линейную последовательность синтезируют с помощью стандартного твердофазного синтеза (ТФС). После расщепления С-концевой защитной группы пептид циклизуют, например, согласно описанному выше методу. После чего циклический пептид отщепляют от смолы и удаляют защитные группы.

При необходимости боковую цепь, присутствующую на Pro, можно вводить в аминокислоту до или после циклизации пептида на стадии а). Так, Pro в качестве исходной аминокислоты или исходного линейного или циклического пептида, в которых в каждом случае Pro содержит в качестве заместителя в кольце ОН, можно подвергать взаимодействию с получением соединения А или требуемого содержащего фрагмент Pro пептида или соответствующего линейного пептида соответственно, где Pro замещен NHR₁-C₂H₄-NH-CO-O-.

Комплексообразование конъюгированного соединения А можно осуществлять путем взаимодействия конъюгированного соединения А с соответствующим обнаруживаемым или радиотерапевтическим элементом, получая соединение, например соль металла, предпочтительно водорастворимую соль. Реакцию можно осуществлять аналогично известным методам, описанным, например, у Perrin, Organic Ligand, Chemical Data, серии 22, NY Pergamon Press (1982); у Krejcarit и Tucker, Biophys. Biochem. Res. Corn. 77: 581 (1977) и у Wagner и Welch, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979).

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах. Все температуры даны в градусах Цельсия. Сокращения:

АсОН:	уксусная кислота
Boc:	трет-бутоксикарбонил
Bzl:	бензил
КБО:	карбобензокси
ДИПКИ:	N,N'-диизопропилкарбодиимид
ДИПЭА:	диизопропилэтиламин
ДМФ:	диметилформамид
ДФФА:	дифенилфосфорилазид
Fmoc:	флуоренилметоксикарбонил
ГОБТ:	1-гидроксибензотриазол
OSu:	N-гидроксисукцинимид
ТФК:	трифторуксусная кислота
ТГФ:	тетрагидрофуран

Пример 1: Цикло[{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe]

а) Синтез Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH

Гидрохлорид метилового эфира L-гидроксипролина подвергают взаимодействию с Fmoc-OSu в водном 1,0н. растворе карбонат натри/ТГФ при комнатной температуре. После завершения реакции Fmoc-Pro(4-OH)-OMe выделяют осаждением. Затем Fmoc-Pro(4-OH)-OMe добавляют по каплям к раствору трисфосгена (0,6 экв.) в ТГФ, получая в качестве промежуточного продукта хлоркарбонат. Через 1 ч добавляют диметиламинопиридин (1,0 экв.) и N-Boc-диаминоэтан (6,0 экв.) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре. После завершения реакции растворитель удаляют в вакууме и образовавшийся Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OMe экстрагируют из двухфазной системы этилацетат/0,1 М HCl, получая неочищенный продукт (МН⁺= 554), который очищают кристаллизацией из этилацетата. Затем метиловый эфир расщепляют с получением свободной кислоты обработкой 1н./NaOH в смеси диоксан/вода и продукт, т.е. Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH, очищают на силикагеле, [(M+Na)]⁺=562).

б) H-Phe-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-Phg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-ОН

В качестве исходного продукта используют имеющуюся в продаже Fmoc-Tyr(Bzl)-O-СН₂-Ph(3-ОСН₃)-O-СН₂-полистироловую смолу (SASRIN-смола, 2,4 мМ) и подвергают обработке согласно стандартному протоколу, включающему повторные циклы удаления защитных групп Nα-концов (пиперидин/ДМФ, 2:8), повторные промывки ДМФ и реакцию сочетания (ДИПКИ: 4,8 мМ/ГОБТ: 6 мМ, ДМФ). Для осуществления реакции сочетания используют следующие аминокислотные производные: Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phg-OH, Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH. Реакции сочетания (2 экв. аминокислот) продолжают или повторяют до завершения, т.е. до полного исчезновения остаточных аминогрупп, которые можно обнаруживать с использованием отрицательного "Kaiser"-теста на основе нингидрина. Перед отщеплением полностью собранного защищенного линейного пептида от подложки, представляющей собой смолу, удаляют Nα-Fmoc-защиту последнего остатка.

B)H-Phe-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH-Boc)-Phg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH

После промывки с помощью CH₂Cl₂ комплекс пептид-смола переносят на колонку или при перемешивании на вакуум-фильтр и пептидный фрагмент отщепляют и элюируют кратковременной обработкой 2%-ной ТФК в CH₂Cl₂ в течение 1 ч. Элюат сразу нейтрализуют насыщенным раствором NaHCO₃. Органический раствор отделяют и упаривают и соединение-предшественник с защищенной боковой цепью (MH⁺=1366) подвергают циклизации без дополнительной очистки.

г) Трифторацетат цикло[-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH₂)-Phg-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe-]

Вышеуказанный линейный фрагмент растворяют в ДМФ (4 мМ), охлаждают до -5°С и обрабатывают 2 экв. ДИПЭА, а затем 1,5 экв. ДФФА и перемешивают до завершения реакции (примерно, 20 ч) при 0-4°С. Растворитель практически полностью удаляют в вакууме; концентрат разбавляют этилацетатом, промывают NaHCO₃, водой, сушат и упаривают в вакууме.

Для удаления защитных групп остаток растворяют при 0°С в ТФК/Н₂О, 95:5 (примерно, 50 мМ) и перемешивают на холоде в течение 30 мин. Затем продукт осаждают простым эфиром, содержащим примерно 10 экв. HCl, фильтруют, промывают простым эфиром и сушат. Для полного расщепления оставшейся индол-N-карбаминовой кислоты продукт растворяют в 5%-ной АсОН и лиофилизируют после выдерживания в течение 15 ч примерно при 5°С. Осуществляют препаративную ОФ-ЖХВР с применением колонки С-18, 10 мкм, типа STAGROMA (5-25 см), используя градиент от 0,5% ТФК до 0,5% ТФК в 70%-ном ацетонитриле. Фракции, содержащие чистое указанное в заголовке соединение, объединяют, разбавляют водой и лиофилизируют. Лиофилизат растворяют в воде, а затем осаждают 10%-ным Na₂CO₃ в воде. Твердое свободное основание фильтруют, промывают водой и сушат в вакууме при комнатной температуре. Образовавшийся порошок белого цвета используют непосредственно для получения различных солей.

Пример 2: Цикло[{4-NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe] в форме соли

а. Ацетат

Превращение в ацетат осуществляют с помощью ионообменной смолы (например, типа AG 3-X4). МС (ESI): m/z 524,5 [М+2Н]²⁺ [α]D²⁰=-42°, с=0,26 в 95% АсОН

б. Аспартат

Превращение в моно- или диаспартата осуществляют путем взаимодействия 1 эквивалента соединения из примера 1 с 1 или 2 эквивалентами аспарагиновой кислоты в смеси ацетонил/вода, 1:3. Образовавшуюся смесь замораживают и лиофилизируют.

Диаспартат можно получать также путем растворения соединения из примера 1 в смеси вода/ацетонитрил, 4:1, фильтрации, введения в ионобменную смолу, например, используя колонку типа BioRad AG4X4, и элюирования с помощью смеси вода/ацетонитрил, 4:1. Элюат концентрируют, замораживают и лиофилизируют. [α]D²⁰=-47.5°, с=2,5 мг/мл в метаноле.

в. Бензоат

Превращение в бензоат можно осуществлять путем растворения соединения из примера 1 с 2 эквивалентами бензойной кислоты в смеси ацетонитрил/вода, 1:2. Образовавшуюся смесь замораживают и лиофилизируют.

г. Памоат

1 эквивалент соединения из примера 1 растворяют с 1 эквивалентом эмбоновой кислоты в смеси ацетонитрил/ТГФ/вода, 2:2:1. Образовавшуюся смесь замораживают и лиофилизируют.

Пример 3: Цикло-[{4-(ДОТК-NH-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe

а) Трифторацетат цикло[-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH₂)-Phg-DTrp-Lys(КБО)-Tyr(Bzl)-Phe-]

Соединение синтезируют аналогично трифторацетату цикло[-Pro(4-ОСО-NH-CH₂-CH₂-NH₂)-Phg-DTrp-Lys(KEO)-Tyr(Bzl)-Phe], используя Fmoc-Lys(КБО)-OH вместо Fmoc-Lys(Boc)-OH.

б) 400 мг поступающего в продажу ДОТК × 2Н₂O (фирма SYMAFEX, Франция) растворяют в 20 мл воды. После добавления 20 мл ДМФ добавляют 170 мг цикло[-Pro(4-OCO-NH-CH₂-CH₂-NH₂)-Phg-DTrp-Lys(КБО)-Tyr(Bzl)-Phe-] вместе с 190 мг ДЦКИ и 60 мг N-гидроксисукцинимида. Образовавшуюся суспензию выдерживают при комнатной температуре в течение 72 ч. После фильтрации растворитель удаляют при пониженном давлении и оставшийся неочищенный продукт очищают на силикагеле (ДХМ/МеОН/НОАс_50% 8/2/0,25 → 7/3/1 в качестве подвижной фазы).

в) Для удаления защитных групп описанный выше ДОТК - конъюгат обрабатывают 5 мл смеси трифторуксусная кислота/тиоанизол (9/1 )в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем раствор сливают на смесь, содержащую 100 мл диэтилового эфира +5 мл 3н. HCl/диэтиловый эфир, и образовавшийся осадок осаждают фильтрацией. Очистку осуществляют на силикагеле, используя ДХМ/МеОН/НОАс_50% 7/4/2 → 7/5/4 в качестве подвижной фазы. Аналитически чистый конечный продукт получают после стадии обессоливания, используя градиент от 0,1% ТФК до 0,1% ТФК в 90% CH₃CN и колонку ОФ18-ЖХВР (типа Spherisorb, 250×4,6 мм). МН⁺: 1434,7

Соединение А в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемых солей и комплексов обладает ценными фармакологическими свойствами, что продемонстрировано с помощью опытов in vitro и in vivo, благодаря чему их можно применять в терапии.

Более конкретно, для соединения А характерен интересный профиль связывания с человеческими рецепторами соматостатина (hsst), прежде всего с рецепторами hsst1, hsst2, hsst3 и hsst5. Ранее были клонированы и охарактеризованы пять подтипов рецептора соматостатина, а именно sst1, sst2, sst3, sst4 и sst5. Подтипы hssti, hsst2 и hsst3 и их последовательности описаны у Y.Yamada и др. в: Proc. Nat. Acad. Sci., 89, 251-255 (1992). hsst4 и его последовательность описаны у L. Rohrer и др. в: Proc. Acad. Sci., 90, 4196-4200 (1993). hsst5 и его последовательность описаны у R. Panetta и др. в: Mol. Pharmacol. 45, 417-427, (1993).

Анализы связывания можно осуществлять согласно описанному ниже методу с использованием мембран, полученных из клеточных линий, которые избирательно и стабильно экспрессируют hsst1, hsst2, hsst3, hsst4 или hsst5, например, СНО- или COS-клеток.

Мембраны получают согласно известным методам, например описанным у С. Bruns и др. в: Biochem. J., 65. 39-44 (1990). Мембраны, полученные из hsst-селективных линий клеток, например, СНО- или COS-клеток, которые стабильно экспрессируют hsst1 или hsst2, или hsst3, или hsst4, или hsst5, инкубируют в трех повторностях в общем объеме 300 мкл при 22°С в течение 30 мин с возрастающими концентрациями [¹²⁵I-Tyr¹¹]-SRIF-14 в Hepes-буфере с концентрацией 10 ммолей/л (рН 7,6), содержащем 0,5% БСА. Инкубацию прекращают путем быстрой фильтрации и подсчитывают радиоактивность фильтратов. Специфическое связывание рассчитывают как общее связывание минус неспецифическое связывание в присутствии 1 мкмоля/л соматостатина-14. Эксперименты осуществляют в трех повторностях. Аффинную константу (К_D) и количество сайтов связывания рассчитывают с помощью соответствующих статистических и графических программ.

С помощью вышеописанных анализов связывания с hsst1, hsst2, hsst3 и/или hsst5 установлено, что значения IC₅₀ для соединения А находятся в наномолярном диапазоне, предпочтительно значение IC₅₀ составляет от 0.1 до 10 нМ (IC₅₀ представляет собой концентрацию, при которой ингибирование при анализе конкурентного связывания с использованием [¹²⁵I-Tyr¹¹]-SRIF-14 в качестве специфического для hsst1-5 радиолиганда составляет половину от максимального).

Соединение А связывается также с рецепторами стимулятора секреции гормона роста. Такие рецепторы описаны у G. Muccioli и др., J. Endocrinol., 157, 99-106 (1998), H. Ong и др., в: Endocrinology, 139, 432-435 (19998) и R.G. Smith и др., Horm. Res. 3), 1-8 (1999). Анализ связывания с этими рецепторами можно осуществлять согласно методу, описанному в: J. Endocrinol. Invest. 24: RC1-RC3 (2001). При осуществлении указанного анализа соединение А замещает ¹²⁵I-Tyr-Ala-гексарелин. Таким образом, соединение А можно применять для модуляции активности рецепторов стимулятора секреции гормона роста, например, с учетом их возможной роли в прибавлении веса тела и регуляции метаболизма.

Кроме того, соединение А проявляет ингибирующую активность в отношении секреции РГ (гормон роста, соматотропин), что установлено по ингибированию секреции РГ in vitro из культивируемых гипофизных клеток. Например, передние доли гипофиза взрослых самцов крыс нарезают на мелкие кусочки и диспергируют с помощью 0,1%-ного раствора трипсина в 20 мМ HEPES-буфере. Диспергированные клетки культивируют в течение 4 дней в среде MEM (фирма Gibco), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1 мМ NaHCO₃, 2,5 нМ дексаметазоном, 2,5 мг/мл инсулина и 20 ед./мл Pen/Strep. В день эксперимента прикрепившиеся клетки дважды промывают средой Кребса-Рингера, забуференной 20 мМ HEPES и дополненной 5 мМ глюкозой и 0,2 % БСА. Затем клетки инкубируют в течение 3 ч с соединением А в присутствии 3×10^-10 М рилизинг-фактора гормона роста. Количество высвободившегося в среду гормона роста оценивают с помощью РИА. В этом опыте установлено, что значение IC₅₀ соединения А составляет 0,4 нМ.

Соединение А ингибирует высвобождение гормона роста (РГ) у крыс. Соединение А вводят подкожно (s.c.) крысам после анестезии. Образцы крови собирают после декапитации, которую осуществляют через 1 ч после введения соединения. Продолжительность действия оценивают на основе данных о ингибировании основного уровня секреции РГ через 6 ч после введения лекарственного средства. Концентрации гормона оценивают с помощью РИА через 1 и 6 ч после обработки. Значение ID₅₀ для ингибирования секреции гормона для каждого эксперимента оценивают графически (log-пробит) и усредняют логарифмы полученных значений. С помощью этой модели in vivo установлено, что соединение А в значительной степени ингибирует высвобождение гормона роста и обладает продолжительным действием (среднее основное значение ID₅₀=5,5 мкг/кг, s.c., 6 ч). С помощью аналогичного опыта оценивают воздействие на высвобождение инсулина, установлено, что соединение А ингибирует секрецию инсулина.

Уровень и эффективность ингибирования РН также была подтверждена в опытах на обезьянах. Оценка метаболизма у страдающих диабетом обезьян позволила установить наличие у соединения А выраженного антидиабетического/повышающего чувствительность к инсулину действия.

Кроме того, соединение А ингибирует уровни в плазме IGF-1 in vivo, что установлено с помощью стандартных тестов с использованием самцов крыс. В целом, тест состоит в следующем: соединение А вводят с помощью осмотического насоса, имплантированного подкожно самцам крыс линии Lewis. Собирают образцы крови из расположенного позади глазного яблока (ретробульбарного) сплетения после непродолжительной анестезии, например изофлураном. С помощью этого анализа установлено, что соединение А в значительной степени понижает уровни IGF-1 в плазме и отличается длительным остаточным действием: например, уровень ингибирования, превышающий 60%, наблюдают через 14 дней после обработки 10 мкг/кг/ч соединения А. Еще более четко отсутствие клиренса было обнаружено в опытах по длительной обработке крыс-реципиентов с аллотрансплантатами аорты или почки, которым непрерывно в течение периода времени до 126 дней вводили путем инфузии соединение А в дозе 10 мкг/кг/ч, что индуцирует значительное и сохраняющееся в течение продолжительного времени понижение уровней IGF-1 в плазме.

Таким образом, соединение А можно применять для предупреждения или лечения патологий, этиология которых включает или связана с избыточной секрецией РГ и/или избыточным уровнем IGF-1, например, для лечения акромегалии, а также для лечения сахарного диабета типа I или типа II, прежде всего связанных с ними осложнений, например, ангиопатии, диабетической пролиферативной ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, нефропатии, нейропатии и синдрома Дауна, и других метаболических патологий, связанных с секрецией инсулина или глюкагона, например ожирения, например, ожирения, препятствующего нормальному функционированию организма, или ожирения, связанного с гипоталамусом или гиперинсулинемией. Соединение А можно также применять для лечения проникающего через кожу и проникающего через оболочку поджелудочной железы свища, синдрома раздраженной толстой кишки, воспалительных заболеваний, например, болезни Грейвса, воспалительного заболевания кишечника, псориаза или ревматоидного артрита, поликистозного заболевания почки, демпинг-синдрома, синдрома водянистого стула, связанной со СПИДом диареи, вызванной химиотерапией диареи, острого и хронического панкреатита и опухолей, секретирующих желудочно-кишечный гормон (например, GEP-опухолей, например, випом, глюкагоном, инсулином, карциноидов и т.п.), злокачественных связанных с лимфоцитами заболеваний, например лимфом или лейкозов, печеночно-клеточного рака, а также желулочно-кишечного кровотечения, например, кровотечения из варикозно расширенных вен пищевода.

Соединение А можно также применять для лечения опухолей, которые являются позитивными в отношении рецепторов соматостатина, например, опухолей, несущих hsst1, hsst2, hsst3 и/или hsst5, что установлено с помощью экспериментов по оценке пролиферации с использованием различных линий раковых клеток, несущих указанные рецепторы соматостатина.

Линию опухолевых клеток поджелудочной железы крысы AR42J получают из вызванной азасерином экзокринной опухоли поджелудочной железы (Jessop и Hay, 1980). Не содержащие микоплазматических клеток культуры размножают в среде DMEM, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) в атмосфере 5% СО₂. Клетки выращивают без антибиотиков или противогрибковых агентов. Находящиеся на субконфлюэнтной стадии клетки линии AR42J обрабатывают трипсином, разбавляют DMEM+2,5% ФТС и высевают в несенсибилизированные 96-луночные планшеты. После 48-часового периода инкубации (день 0) количество клеток в различных контрольных планшетах определяют как подсчетом количества клеток с помощью счетчика Коултера (Coulter), так и помощью SRB-колориметрического анализа. Далее клетки обрабатывают различными концентрациями соединения А в течение 2-5 дней и затем подсчитывают. В этих условиях установлено, что соединение А ингибирует пролиферацию опухолевых клеток в концентрациях от 10^-12 до 10^-6 М.

Оценка роста опухолей in vivo

Самок бестимусных мышей весом 19-22 г содержат группами по 5 животных в каждой в условиях, когда они имеют свободный доступ к воде для питья и не содержащему патогенов корму для грызунов. С помощью культивируемых клеток линии AR42J инициируют развитие подкожных опухолей. Обработку начинают через 2-4 дня после инокуляции опухолевых клеток, причем соединение А вводят путем непрерывной инфузии, например, с скоростью от 10 до 50 мкг/кг/ч. Размеры опухолей определяют с помощью циркуля. Для статистического анализа применяют t-критерий Стьюдента. С помощью указанного анализа установлено, что к 11 дню соединение А ингибирует рост опухолей на 51% по сравнению с контролем, в котором для обработки используют физиологический раствор.

Таким образом, соединение А можно применять для лечения пролиферативных болезней, связанных со злокачественным ростом клеток, например раковых опухолей, прежде всего опухолей, несущих рецепторы соматостатина таких типов, с которыми оно связывается с достаточной аффинностью, например, как это описано ниже для входящего в состав комплекса конъюгированного соединения А.

Соединение А также оказывает ингибирующее действие в отношении ангиогенеза, что доказано с помощью стандартных тестов, например, с использованием бестимусных мышей. В целом, тест состоит в следующем: опухолевые клетки (от 0,1 до 10×10⁶ в 0,1 мл) (клетки линии SiHa и клетки линии MDA МВ-231, полученные согласно методам, описанным в: Angiogenesis, R. Steiner, Р.В. Weisz и R. Langer (ред.), 1992, Швейцария), инокулируют внутрикожно. Как правило, мышам вводят по две инъекции в середину брюшного отдела в области, локализованные далеко от основных брюшных кожных сосудов, для того чтобы количество исходных сосудов было низким. Мышам контрольной группы вводят по 0,1 мл 0,02%-ного трипанового синего в ЗФР. Через 10 дней после инъекции мышей после анестезии умерщвляют аспирацией СО₂. Кожу монтируют на пластиковое кольцо (диаметром 40 мм) для оценки с помощью инвертированного микроскопа (типа Zeiss IM) при 12,5-и 25-кратном увеличении. Для оценки ангиогенеза сосуды фотографируют и подсчитывают количество сосудов, непосредственно связанных с опухолью. У контрольных животных подсчитывают количество сосудов, непосредственно связанных с определенной областью вокруг мест инъекции. Эта область соответствует средней площади кожных опухолей. Последнюю определяют позднее с помощью циркуля из уравнения 3,14×r². Соединение А вводят s.c. либо в день инокуляции опухоли, либо через 3 дня. Контрольных животных обрабатывают носителем. В этом опыте установлено, что соединение А ингибирует образование кровеносных сосудов при введении в дозе, например, от 0,01 до 1000 мкг/кг s.c.

Таким образом, соединение А можно применять для предупреждения или лечения ангиогеназа, указанных выше воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания глаз, отек желтого пятна, например, кистозный отек желтого пятна, идиопатический кистозный отек желтого пятна, эксудативную связанную с возрастом дегенерацию желтого пятна, болезни, связанные с неоваскуляризацией сосудистой оболочки глаза, и пролиферативную ретинопатию.

Соединение А может также оказывать ингибирующее действие в отношении пролиферации и миграции клеток гладких мышц, что установлено с помощью описанных ниже тестов.

Хроническое отторжение аллотрансплантата

Почку самца крыс линии DA (RT1^a) ортотопически трансплантируют реципиенту - самцу крыс линии Lewis (RT1¹). Всего для трансплантации используют 24 животных. Всем животным вводят циклоспорин А в дозе 7,5 мг/кг/день перорально (per os) в течение 14 дней, начиная со дня трансплантации, предупреждая тем самым острое клеточное отторжение. Контралатеральную нефрэктомию не проводят. Каждая экспериментальная группа, которую обрабатывают конкретной дозой соединения А или плацебо, состоит из 6 животных. Начиная с 14 дня после трансплантации животных-реципиентов обрабатывают вплоть до 112 дня путем инфузии соединения А, или им вводят плацебо. Через 14 дней после трансплантации перфузию органа оценивают с помощью ЯМР-томографии. Эту процедуру повторяют через 53-64 дня после трансплантации и в конце эксперимента. Затем проводят аутопсию животных. Установлено, что введение соединения А в дозе 10 мкг/кг/ч при использовании указанной модели аллотрансплантата почки улучшает перфузию органа, а также снижает степень хронического отторжения, связанного с сосудистой реконструкцией и инфильтрацией трансплантата (клеточное отторжение). Выявлено также значительное и сохраняющееся в течение длительного времени снижение уровней IGF-1. Эти результаты подтверждены во второй серии экспериментов, основанных на использовании в качестве модели гетеротопической аллотрансплантации сердца мыши, в которых продемонстрированы полезные воздействия на сосудистую реконструкцию, а также на инфильтрацию трансплантата.

Соединение А также изучено при применении в качестве модели трансплантации петли сонной артерии с использованием мышей линии В 10. А(2R) (H-2h²) в качестве донора и мышей линии B10.BR (Н-2^k) в качестве реципиента. В целом опыт состоит в следующем: сонную артерию донора трансплантируют паратопически в виде петли в сонную артерию реципиента путем анастомоза "конец в бок". Мини-насос вводят s.c. сразу же после трансплантации для введения соединения А в дозе 50 мкг/кг/ч. Трансплантаты сонной артерии удаляют через 30 дней после трансплантации для анализа сосудистой реконструкции, например, с помощью морфометрического анализа парафиновых срезов, окрашенных эластином Верхоффа (Verhoeff), с использованием компьютеризированной системы. С помощью этой модели установлено, что соединение А ингибирует образование новой интимы по сравнению с необработанными животными, у которых происходит образование массивной новой интимы.

Ангиопластика (реконструкция сосудов)

Изучение ангиопластики осуществляют с использованием в качестве модели сосудов крыс, поврежденных с помощью катетера-баллона. Катетеризацию с помощью баллона осуществляют в день 0, в целом, согласно методу, описанному у Powell и др. (1989). Анестизированным с помощью изофлуорана животным в левую общую сонную артерию вводят катетер-баллон Фогарти 2F, при этом происходит однородное удаление эндотелия. Затем катетер удаляют, накладывают лигатуру вокруг наружной сонной артерии для предупреждения кровотечения и животным дают отойти от наркоза. Для опыта используют 2 группы по 12 крыс линии RoRo (вес 400 г, возраст примерно 24 недели): одну контрольную группу и одну группу, которую обрабатывают соединением А, крыс по группам распределяют совершенно случайным образом. Соединение А вводят с помощью непрерывной инфузии с использованием мини-наносов со скоростью 10 мкг/кг/ч, начиная обработку за 2 дня до катетеризации баллоном (день - 3) и проводя ее вплоть до окончания эксперимента, т.е. через 14 дней после повреждения баллоном. Затем крыс анестезируют изофлуораном и подвергают перфузии с помощью 0,1 М забуференного фосфатом физиологического раствора (ЗФР, рН 7,4) и далее в течение 15 мин с помощью 2,5%-ного глутарового альдегида в фосфатном буфере (рН 7,4). Затем сонные артерии вырезают, отделяют от окружающей ткани и погружают в 0,1М какодилатный буфер (рН 7,4), содержащий 7% сахарозы, и инкубируют в течение ночи при 4°С. На следующий день сонные артерии погружают в Technovit 7100, следуя рекомендации производителя. Площадь поперечных сечений средней оболочки кровеносных сосудов (медия), новой интимы и полости оценивают морфометрически с помощью системы для анализа изображения (фирма MCID, Торонто, Канада). С помощью этого анализа установлено, что соединение А в значительной степени ингибирует толщину новой интимы.

Таким образом, соединение А можно применять также для предупреждения или лечения заболеваний сосудистого трансплантата, например, сосудистых патологий алло- или ксенотрансплантатов, например, атеросклероза сосудистого трансплантата, например при трансплантации органа, например, трансплантатов сердца, легкого, объединенного трансплантата сердце-легкое, печени, почки или поджелудочной железы, или для предупреждения или лечения стеноза трансплантатов вен, рестеноза и/или сосудистой окклюзии после повреждения сосудов, например, вызванного процедурами катетеризации или процедурами кюретажа сосудов, такими как чрескожная внутриполостная ангиопластика, лазерного лечения или другими инвазивными процедурами, при которых нарушается целостность сосудистой интимы или эндотелия.

Соединение А обладает достаточно продолжительным временем полужизни в плазме. Период его полувыведения составляет 15-30 ч.

Для всех указанных выше показаний требуемая доза, естественно, должна варьироваться в зависимости, например, от хозяина, пути введения и серьезности подлежащего лечению состояния. Однако, как правило, удовлетворительные результаты получают при введении примерно от 1 мкг до 0,7 мг/кг/день соединения А. Рекомендуемая суточная доза для пациентов составляет от примерно 2 мкг до примерно 50 мг, предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 40 мг, например, от примерно 0,01 до примерно 3 мг s.c. соединения, которое целесообразно вводить в виде разделенных доз до 3 раз в день в виде стандартной дозируемой формы, содержащей, например, от примерно 0,5 мкг до примерно 25 мг, например, примерно от 2 мкг до 20 мг, например, от 2 мкг до 1,5 мг соединения А.

Соединение А можно вводить в свободной форме или форме фармацевтически приемлемой соли или комплексов. Такие соли и комплексы можно получать общепринятыми методами, и они обладают активностью, соответствующей активности свободного соединения. Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит соединение А в форме свободного основания или в форме фармацевтически приемлемой соли или в фо