Способ получения l-глутаминовой кислоты

Способ получения l-глутаминовой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки изобретения

Данное изобретение относится к способу получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации. L-глутаминовая кислота широко используется в качестве сырья для приправ и так далее.

L-глутаминовую кислоту главным образом получают ферментацией с использованием так называемых коринеформных бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, относящихся к роду Brevibacterium, Corynebacterium или Microbacterium, или их мутантных штаммов (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pp.195-215, 1986). В качестве способов получения L-глутаминовой кислоты ферментацией с использованием других бактериальных штаммов известен способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Bacillus, Streptomyces, Peniclllium или ему подобному (патент США No.3220929), способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida или ему подобному (патент США No.3563857), способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (в настоящее время называемому Enterobacter aeroqenes) или ему подобному (Японская патентная публикация (Kokoku) No.32-9393), способ с использованием мутантного штамма Escherichia coli (выложенная заявка на патент Японии (Kokai) No.5-244970) и так далее. Кроме того, авторы данного изобретения предложили способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма, относящегося к роду Klebsiella, Erwinia или Pantoea (выложенная заявка на патент Японии No.2000-106869).

Кроме того, обнаружены различные приемы повышения способности продуцировать L-глутаминовую кислоту путем усиления активностей ферментов биосинтеза L-глутаминовой кислоты с помощью использования технологии рекомбинантной ДНК. Например, сообщалось, что введение гена, кодирующего цитратсинтазу, происходящего из Escherichia coli или Corynebacterium glutarnicum, является эффективным для усиления способности продуцировать L-глутаминовую кислоту бактериями Corynebacterium или Brevibacterium (Японская патентная публикация (Kokoku.) No.7-121228). Кроме того, в выложенной заявке на патент Японии No.61-268185 сообщается о клетке, несущей рекомбинантную ДНК, содержащую ген глутаматдегидрогеназы, происходящий из бактерий Corynebacterium. Кроме того, в выложенной заявке на патент Японии No.63-214189 раскрывается способ повышения способности продуцировать L-глутаминовую кислоту амплификацией гена глутаматдегидрогеназы, гена изоцитратдегидрогеназы, гена аконитатгидратазы и гена цитратсинтазы.

Хотя продуктивность по L-глутаминовой кислоте значительно увеличивается с помощью указанной выше селекции микроорганизмов или усовершенствования способов получения, требуется разработка способов более эффективного получения L-глутаминовой кислоты при более низкой стоимости, чтобы удовлетворить дальнейший рост потребности в будущем.

Известен способ, при котором по мере того, как проводят ферментацию, кристаллизуют L-аминокислоту, накопленную в культуре (выложенная заявка на патент Японии No.62-288). В данном способе концентрацию L-аминокислоты в культуре поддерживают ниже определенного уровня путем осаждения накопленной в культуре L-аминокислоты. В частности, L-триптофан, L-тирозин или L-лейцин осаждают во время ферментации путем регулирования температуры и рН культуры, или добавлением к среде поверхностно-активного вещества.

Хотя, как описано выше, известен способ осуществления ферментации, сопровождаемой осаждением L-аминокислоты, подходящими для данного способа аминокислотами являются аминокислоты, проявляющие относительно низкую растворимость в воде, и не известно никаких примеров применения способа для высокорастворимых в воде аминокислот, таких как L-глутаминовая кислота. Кроме того, для осаждения L-глутаминовой кислоты среда должна иметь низкое значение рН. Однако бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту, такие как, упомянутые выше, не могут расти в кислых условиях, и поэтому ферментацию L-глутаминовой кислоты выполняют в нейтральных условиях (патенты США No.3220929 и 3032474; К.С. Chao and J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, стр.715-725 (1959)). Таким образом, получение L-глутаминовой кислоты ферментацией, сопровождаемой осаждением, не известно. Более того, известно, что рост большинства ацидофильных бактерий ингибируется органическими кислотами, такими как уксусная кислота, молочная кислота и янтарная кислота (Yasuro Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism Handbook", стр.231, Science Forum; R.M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, стр.597-599 (1967) и др.). Поэтому считается, что многие микроорганизмы в кислых условиях чувствительны к L-глутаминовой кислоте, которая также является органической кислотой, и не было сообщений о попытках поиска микроорганизмов, проявляющих способность продуцировать L-глутаминовую кислоту в кислых условиях.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который дает возможность эффективного получения L-глутаминовой кислоты даже в том случае, когда в качестве источника сахара используют материал, содержащий органическую кислоту, которая ингибирует рост микроорганизма при низком значении рН.

Авторы данного изобретения обнаружили, что при нейтральном значении рН бактерия, продуцирующая L-глутаминовую кислоту, потребляет органическую кислоту, которая ингибирует рост бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, при низком значении рН, и что на основе данного свойства можно эффективно получать L-глутаминовую кислоту, используя в качестве источника сахара материал, содержащий органическую кислоту, которая ингибирует рост микроорганизма при низком рН. Таким образом, авторы осуществили данное изобретение.

Настоящее изобретение предоставляет следующее:

(1) Способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту в среде, имеющей рН 5,0 или менее, в которой общее содержание органической кислоты, которая ингибирует рост микроорганизма при данном рН, является таким, при котором рост микроорганизма не ингибируется.

(2) Способ по п.(1), в котором L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается в среде с сопутствующим осаждением L-глутаминовой кислоты в течение культивирования в среде.

(3) Способ по п.(1) или (2), в котором общее содержание органической кислоты составляет 0,4 г/л или менее.

(4) Способ по любому из п.п. с (1) по (3), в котором органической кислотой является органическая кислота, имеющая число атомов углерода от 1 до 3.

(5) Способ по любому из п.п. с (1) по (4), в котором микроорганизм относится к роду Enterobacter.

(6) Способ по п.(5), в котором микроорганизмом является Enterobacter agglomerans.

(7) Способ по любому из п.п. с (1) по (6), в котором микроорганизм может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту при концентрации насыщения и источник углерода, при определенном значении рН, и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при данном рН.

(8) Способ по п.(7), в котором значение рН составляет 5,0 или менее.

(9) Способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту при первом значении рН, при котором рост микроорганизма не ингибируется органической кислотой в среде, и затем культивирование микроорганизма при втором значении рН, которое является подходящим для продуцирования микроорганизмом L-глутаминовой кислоты и является более низким, чем первое значение рН.

(10) Способ по п.(9), в котором органической кислотой является органическая кислота, имеющая количество атомов углерода от 1 до 3.

(11) Способ по п.(9) или (10), в котором второе значение рН составляет от 3,0 до 5,0.

(12) Способ по любому из п.п. с (9) по (11), в котором культивирование при первом значении рН выполняют, поддерживая рН среды на уровне первого значения рН добавлением к среде подщелачивающего вещества.

(13) Способ по п.(12), который включает снижение рН среды путем регулирования добавляемого количества подщелачивающего вещества после культивирования при первом рН.

(14) Способ по любому из п.п. с (9) по (13), в котором культивирование при первом рН продолжают до тех пор, пока не истощится органическая кислота в среде.

(15) Способ по любому из п.п. с (9) по (14), в котором микроорганизм относится к роду Enterobacter.

(16) Способ по п.(15), в котором микроорганизмом является Enterobacter agglormerans.

(17) Способ по любому из п.п. с (9) по (16), в котором микроорганизм может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту при концентрации насыщения и источник углерода при определенном значении рН, и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при данном рН.

(18) Способ по п.(17), в котором значение рН составляет 5,0 или менее.

(19) Способ по п.(17) или (18), в котором значением рН, подходящим для продуцирования L-глутаминовой кислоты, является значение, при котором L-глутаминовая кислота, продуцируемая микроорганизмом, выпадает в осадок в среде, и L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается при сопутствующем осаждении L-глутаминовой кислоты во время культивирования в среде при данном значении рН.

Согласно способам настоящего изобретения, L-глутаминовую кислоту можно эффективно получать даже, когда в качестве источника сахара используют материал, содержащий органическую кислоту, которая ингибирует рост микроорганизма, такой как меласса.

КРАТКОЕ ПОЯСНЕНИЕ К ЧЕРТЕЖАМ

Фиг.1 представляет собой рестрикционную карту фрагмента ДНК, полученного из Enterobacter agglomerans, в pTWVEK101.

На фиг.2 показано сравнение аминокислотной последовательности, выведенной на основе нуклеотидной последовательности гена sucA, полученного из Enterobacter agglomerans, и гена sucA, полученного из Escherichia coli (наверху строка:

Enterobacter agglomerans, в графе Escherichia coli, то же самое применимо к последующим фигурам).

На фиг.3 показано сравнение аминокислотной последовательности, выведенной на основе нуклеотидной последовательности гена sucB, полученного из Enterobacter agglomerans, и гена sucB, полученного из Escherichia coli.

На фиг.4 показано сравнение аминокислотной последовательности, выведенной на основе нуклеотидной последовательности гена sucC, полученного из Enterobacter agglomerans, и гена sucC, полученного из Escherichia coli.

На фиг.5 показано сравнение аминокислотной последовательности, выведенной на основе нуклеотидной последовательности гена sdhB, полученного из Enterobacter agglomerans, и гена sdhB, полученного из Escherichia coli.

На фиг.6 показана конструкция плазмиды pMWCPG, содержащей ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фиг.7 показана конструкция плазмиды RSF-Tet, содержащей начало репликации плазмиды RSF1010 широкого круга хозяев и ген устойчивости к тетрациклину.

На фиг.8 показана конструкция плазмиды RSFCPG, содержащей начало репликации плазмиды RSF1010 широкого круга хозяев, ген устойчивости к тетрациклину, ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фиг.9 показана конструкция плазмиды pSTVCB, содержащей ген glta.

На фиг.10 показано ингибирующее рост действие различных органических кислот при кислом рН (рН 4,5).

На фиг.11 показаны результаты исследования рН, при котором вызывается ингибирование роста, с использованием муравьиной кислоты.

На фиг.12 показаны результаты исследования концентрации муравьиной кислоты, которая вызывает ингибирование роста в условиях рН 4,5.

На фиг.13 показан временной ход роста клеток во время культивирования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже будет дано подробное объяснение изобретения.

Способ получения согласно первому варианту данного изобретения (далее называемый также "первым способом получения согласно данному изобретению") представляет способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту (далее называемого также "бактерией, продуцирующей L-глутаминовую кислоту") в среде, имеющей значение рН 5,0 или менее, в которой общее содержание органической кислоты, которая ингибирует рост микроорганизма при данном рН, равно содержанию, при котором рост микроорганизма не ингибируется.

В первом способе получения согласно данному изобретению предпочтительно, чтобы L-глутаминовая кислота продуцировалась и накапливалась при культивировании в среде с сопутствующим осаждением L-глутаминовой кислоты. Этого можно достичь доведением рН среды до значения рН, при котором продуцируемая L-глутаминовая кислота выпадает в осадок. Такое значение рН обычно составляет от 3,0 до 5,0. Считается, что при получении L-глутаминовой кислоты ферментацией снижение продуктивности L-глутаминовой кислотой, накапливаемой в среде в высокой концентрации, создает препятствие для повышения продуктивности. Например, клетка микроорганизма обладает системой выделения и системой поглощения L-глутаминовой кислоты, и если L-глутаминовая кислота, однажды выделенная в среду, снова поглощается клеткой, не только снижается эффективность продуцирования, но это также приводит к ингибированию реакций биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Путем проведения культивирования при рН, при котором продуцируемая L-глутаминовая кислота выпадает в осадок, можно устранить такое снижение продуктивности вследствие накопления L-глутаминовой кислоты в высокой концентрации.

Величина рН среды предпочтительно составляет 4,5 или менее, более предпочтительно 4,0 или меньше.

В данном варианте воплощения под органической кислотой, которая ингибирует рост микроорганизма при некотором рН среды, подразумевают органическую кислоту, которая оказывает ингибирующее действие на ингибирование роста микроорганизма, когда она присутствует при определенной концентрации (обычно 0,5 г/л или более) в среде при данном рН, и обычно ею является органическая кислота, имеющая число атомов углерода от 1 до 3, т.е., муравьиная кислота, уксусная кислота или пропионовая кислота.

Общее содержание органической кислоты предпочтительно составляет 0,4 г/л или менее, более предпочтительно 0,3 г/л или менее, более предпочтительно 0,2 г/л или менее.

Способ получения согласно второму варианту данного изобретения (далее называемый также "вторым способом получения согласно данному изобретению") представляет собой способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту при первом значении рН, при котором рост микроорганизма не ингибируется органической кислотой в среде, и затем культивирование микроорганизма при втором значении рН, которое является подходящим для продуцирования L-глутаминовой кислоты микроорганизмом и более низким, чем первое значение рН.

Обнаружено, что бактерия, продуцирующая L-глутаминовую кислоту, обычно претерпевает ингибирование роста органической кислотой в кислых условиях, тогда как она могла бы потреблять органическую кислоту в нейтральных условиях. На основе данного свойства, осуществляя выращивание клеток при нейтральном рН и затем, изменяя рН на кислое значение рН, чтобы продуцировать L-глутаминовую кислоту, становится возможным получение более высокой продуктивности, а также становится возможным применение в качестве источника сахара различных материалов.

В данном варианте под органической кислотой подразумевают органическую кислоту, которая обладает ингибирующим действием на рост микроорганизма, когда она присутствует в определенной концентрации (обычно 0,5 г/л или более) в среде при втором значении рН, и обычно ею является органическая кислота, имеющая количество атомов углерода от 1 до 3, т.е., муравьиная кислота, уксусная кислота или пропионовая кислота.

Первое значение рН и второе значение рН выбирают так, чтобы они соответствовали свойствам используемой бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту. Специалисты в данной области легко могут измерить указанные значения рН. Например, значение рН, при котором органическая кислота в среде не вызывает ингибирования роста микроорганизма, можно определить культивированием бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, в средах, содержащих органическую кислоту, рН которых доведено до разных значений, измерением количества клеток на основе поглощения или тому подобным образом и сравнением количества клеток с количеством клеток бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, культивируемой в таких же условиях, за исключением того, что при этом среды не содержат органической кислоты. К рН, подходящему для продуцирования L-глутаминовой кислоты, относится значение рН, при котором L-глутаминовая кислота накапливается в среде, определяемое при культивировании бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, в средах с различными значениями рН. В частности, значение можно определить путем измерения количества L-глутаминовой кислоты, накапливаемой в средах при разных значениях рН и их сравнения.

Первое значение рН особо не ограничивается, при условии, что органическая кислота не ингибирует рост микроорганизма в среде, но обычно составляет от 5,0 до 8,0.

Вторым значением рН предпочтительно является рН, при котором продуцируемая L-глутаминовая кислота выпадает в осадок, и такое значение рН обычно составляет от 3,0 до 5,0. Как объяснялось для первого способа получения согласно данному изобретению, снижения продуктивности при накоплении L-глутаминовой кислоты в высокой концентрации можно избежать, проводя культивирование при рН, при котором продуцируемая L-глутаминовая кислота выпадает в осадок.

Первое значение рН и второе значение рН могут не быть строго постоянными в ходе культивирования, при условии, что могут быть достигнуты преимущества данного изобретения, и значения могут колебаться.

Бактерия, продуцирующая L-глутаминовую кислоту, продуцирует L-глутаминовую кислоту даже при первом рН, и поэтому рН понижается продуцируемой L-глутаминовой кислотой. Поэтому культивирование при первом рН предпочтительно осуществляют при поддержании рН среды на уровне первого значения рН добавлением в среду подщелачивающего вещества.

Хотя подщелачивающее вещество особым образом не ограничивается, при условии, что оно не оказывает неблагоприятного воздействия на рост бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту или на продуцирование L-глутаминовой кислоты, предпочтителен газообразный аммиак.

рН среды можно понизить от первого рН до второго рН добавлением кислого вещества. Однако рН в ходе культивирования понижается L-глутаминовой кислотой, продуцируемой бактерией, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, как описано выше. Поэтому предпочтительно снижать рН среды от первого значения рН до второго значения рН посредством регулирования добавляемого количества подщелачивающего вещества, так как добавление кислого вещества можно исключить.

Культивирование при первом рН можно продолжать до тех пор, пока не истощится органическая кислота в среде. Истощение означает, что количество органической кислоты снижается до уровня, при котором рост бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, не ингибируется в ходе культивирования при втором рН. Специалисты в данной области легко могут измерить такой уровень органической кислоты. Например, уровень можно определить посредством культивирования бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, в средах, содержащих органическую кислоту в разных концентрациях, при втором значении рН, измерением количеств клеток бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, и сравнения количеств клеток с количествами клеток бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, культивируемой при таких условиях, за исключением того, что при этом среды не содержат органической кислоты. Как правило, по мере того как второе значение рН становится ниже, уровень органической кислоты также понижается.

Бактерия, продуцирующая L-глутаминовую кислоту, используемая в первом способе получения согласно данному изобретению и во втором способе получения согласно данному изобретению, представляет собой микроорганизм, который накапливает значительное количество L-глутаминовой кислоты в среде при его культивировании в среде. Примеры такой бактерии включают микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter. Предпочтительной является Enterobacter agglomerans.

Кроме того, бактерией, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, используемой в первом и втором способах получения согласно изобретению, предпочтительно является микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при определенном рН, и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при вышеупомянутом значении рН (далее называемый также "микроорганизмом, накапливающим L-глутаминовую кислоту"). Вышеуказанное определенное значение рН предпочтительно равно рН, при котором L-глутаминовая кислота выпадает в среде в осадок, и такое значение рН обычно составляет 5,0 или менее.

Под "концентрацией насыщения" подразумевается концентрация L-глутаминовой кислоты, растворенной в жидкой среде, когда жидкая среда насыщена L-глутаминовой кислотой.

В случае использования микроорганизма, накапливающего L-глутаминовую кислоту, значение рН, подходящее для продуцирования L-глутаминовой кислоты, предпочтительно равно рН, при котором L-глутаминовая кислота выпадает в среде в осадок. При осуществлении культивирования при данном рН L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается в среде при сопутствующем выпадении L-глутаминовой кислоты в осадок.

Микроорганизм, накапливающий L-глутаминовую кислоту, можно получить следующим образом. Образец, содержащий микроорганизмы, инокулируют в жидкую среду, содержащую L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при определенном значении рН, и отбирают штамм, который метаболизирует источник углерода. Хотя определенное значение рН особым образом не ограничивается, обычно оно составляет примерно 5,0 или меньше, предпочтительно примерно 4,5 или меньше, более предпочтительно примерно 4,3 или меньше. Микроорганизм, накапливающий L-глутаминовую кислоту, используют для получения L-глутаминовой кислоты ферментацией с сопутствующим выпадением L-глутаминовой кислоты в осадок. Если значение pH является слишком высоким, становится трудно обеспечить возможность для того, чтобы микроорганизм продуцировал L-глутаминовую кислоту в количестве, достаточном для осаждения. Поэтому рН предпочтительно находится в указанных выше пределах.

Если рН водного раствора, содержащего L-глутаминовую кислоту, понижают, растворимость L-глутаминовой кислоты в значительной степени снижается около рКа γ-карбоксильной группы (4,25, 25°С). Растворимость становится наименьшей в изоэлектрической точке (рН 3,2), и L-глутаминовая кислота, превышающая количество, соответствующее концентрации насыщения, выпадает в осадок. Хотя это зависит от состава среды, L-глутаминовую кислоту растворяют в количестве 10-20 г/л при рН 3,2, 30-40 г/л при рН 4,0 и 50-60 г/л при рН 4,7, примерно при 30°С. Обычно не требуется делать рН 3,0 или ниже, поскольку преципитирующее действие на L-глутаминовую кислоту достигает своего верхнего предела, когда рН становится ниже определенного значения. Однако рН может быть 3,0 или меньше.

Кроме того, выражение, что микроорганизм "может метаболизировать источник углерода" означает, что он может пролиферировать или может потреблять источник углерода, даже хотя он не может пролиферировать, то есть, выражение указывает, что микроорганизм катаболизирует источник углерода, такой как сахара или органические кислоты. В частности, например, если микроорганизм пролиферирует при его культивировании в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения при рН от 5,0 до 4,0, предпочтительно при рН от 4,5 до 4,0, более предпочтительно при рН от 4,3 до 4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0 при соответствующей температуре, например, 28°С, 37°С или 50°С в течение от 2 до 4 дней, указанный микроорганизм может метаболизировать источник углерода в среде. Кроме того, например, если микроорганизм потребляет источник углерода даже несмотря на то, что микроорганизм не пролиферирует при культивировании в синтетической жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения при рН от 5,0 до 4,0, предпочтительно при рН от 4,5 до 4,0, более предпочтительно при рН от 4,3 до 4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0 при соответствующей температуре, например, 28°С, 37°С или 50°С в течение от 2 до 4 дней, указанным микроорганизмом является микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода в среде.

Микроорганизмом, который может метаболизировать источник углерода, является микроорганизм, который может расти в вышеуказанной жидкой среде.

Кроме того, выражение, что микроорганизм "может расти", означает, что он может пролиферировать или может продуцировать L-глутаминовую кислоту даже несмотря на то, что он не может пролиферировать. В частности, например, если микроорганизм пролиферирует при культивировании в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения при рН от 5,0 до 4,0, предпочтительно при рН от 4,5 до 4,0, более предпочтительно при рН от 4,3 до 4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0 при соответствующей температуре, например, 28°С, 37°С или 150°С в течение от 2 до 4 дней, указанный микроорганизм может расти в среде. Кроме того, например, если микроорганизм увеличивает количество L-глутаминовой кислоты в синтетической жидкой среде даже, несмотря на то, что микроорганизм не пролиферирует при культивировании микроорганизма в синтетической жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения при рН от 5,0 до 4,0, предпочтительно при рН от 4,5 до 4,0, более предпочтительно при рН от 4,3 до 4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0 при соответствующей температуре, например, 28°С, 37°С или 50°С в течение от 2 до 4 дней, указанным микроорганизмом является микроорганизм, который может расти в среде.

Отбор, описанный выше, можно повторить два или несколько раз при таких же условиях или с изменением рН или концентрации L-глутаминовой кислоты. Отбор на ранней стадии можно осуществлять в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации более низкой, чем концентрация насыщения, и после этого последующий отбор можно проводить в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения. Далее можно отобрать штаммы с предпочтительными свойствами, такими как самая высокая скорость пролиферации.

Микроорганизм, накапливающий L-глутаминовую кислоту, представляет собой микроорганизм, который в дополнение к описанным выше свойствам обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем количество, соответствующее концентрации насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде. Значение рН вышеупомянутой жидкой среды предпочтительно такое же или близко к значению рН среды, используемой для скрининга микроорганизма, обладающего вышеуказанными свойствами. Обычно микроорганизм становится чувствительным к L-глутаминовой кислоте при высокой концентрации по мере того, как рН снижается. Поэтому предпочтительно, чтобы рН не было низким с точки зрения устойчивости к L-глутаминовой кислоте, но низкое значение рН предпочтительно с точки зрения продукции L-глутаминовой кислоты с сопутствующим выпадением этой кислоты в осадок. Чтобы соответствовать указанным условиям, рН может быть в пределах от 3 до 5, предпочтительно от 4 до 5, более предпочтительно от 4 до 4,7, еще более предпочтительно от 4 до 4,5, особенно предпочтительно от 4,0 до 4,3.

В качестве микроорганизма, накапливающего L-глутаминовую кислоту, из материалов, полученных при селекции, или материалов селекции данного микроорганизма можно указать, например, микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces и тому подобные. Из них предпочтительными являются микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter. Далее объяснения по поводу микроорганизма согласно данному изобретению будут даны главным образом для микроорганизмов, относящихся к роду Enterobacter. Однако микроорганизм не ограничен организмами, относящимися к роду Enterobacter, и сходным образом можно использовать микроорганизмы, относящиеся к другим родам.

В качестве микроорганизма, относящегося к Enterobacter, в частности можно указать Enterobacter agglomerans, предпочтительно штамм AJ13355 Enterobacter agglomerans. Указанный штамм выделяли из почвы в Iwata-shi, Shizuoka, Japan в качестве штамма, который может пролиферировать в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту и источник углерода, при низком рН.

Физиологические свойства AJ13355 показаны ниже:

(1) Окраска по Граму: отрицательная.

(2) Поведение в отношении кислорода: факультативный анаэроб.

(3) Каталаза: положительный.

(4) Оксидаза: отрицательный.

(5) Способность восстанавливать нитраты: отрицательный.

(6) Тест Voges-Proskauer: положительный.

(7) Тест с метиловым красным: отрицательный.

(8) Уреаза: отрицательный.

(9) Продукция индола: положительный.

(10) Подвижность: подвижный.

(11) Продукция H₂S в среде TSI: слабо активен.

(12) В-Галактозидаза: положительный.

(13) Способность к ассимиляции сахаридов:

Арабиноза: положительный.

Сахароза: положительный.

Лактоза: положительный.

Ксилоза: положительный.

Сорбит: положительный.

Инозит: положительный.

Трегалоза: положительный.

Мальтоза: положительный.

Глюкоза: положительный

Адонит: отрицательный.

Раффиноза: положительный.

Салицин: отрицательный.

Мелибиоза: положительный

(14) Способность ассимилировать глицерозу: положительный.

(15) Способность ассимилировать органические кислоты:

Лимонная кислота: положительный.

Винная кислота: отрицательный.

Глюконовая кислота: положительный.

Уксусная кислота: положительный.

Малоновая кислота: отрицательный.

(16) Аргининдегидратаза: отрицательный.

(17) Орнитиндекарбоксилаза: отрицательный.

(18) Лизиндекарбоксилаза: отрицательный.

(19) Фенилаланиндезаминаза: отрицательный.

(20) Образование пигмента: желтый.

(21) Способность разжижать желатин: положительный.

(22) рН роста: рост возможен при рН 4, хорошо растет при рН от 4,5 до 7.

(23) Температура роста: хороший рост при 25°С, хороший рост при 30°С, хороший рост при 37°С, рост возможен при 42°С, рост невозможен при 45°С.

На основании указанных бактериологических свойств AJ13355 определили как Enterobacter agglomerans.

Штамм AJ13355 Enterobacter agglomerans был депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (в настоящее время International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) 19 февраля 1998 г. и получил инвентарный номер FERM Р-16644. Затем он был перенесен для международного депонирования по условиям Будапештского договора 11 января 1999 г. и получил инвентарный номер FERM BP-6614.

Микроорганизмом, накапливающим L-глутаминовую кислоту, может быть микроорганизм, исходно обладающий способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, или микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, которая была ему придана или усилена при селекции благодаря использованию мутагенной обработки, технологии рекомбинантной ДНК или тому подобного.

Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту можно придать или усилить, например, посредством увеличения активности фермента, который катализирует реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту также можно усилить посредством снижения или исключения активности фермента, который катализирует реакцию, которая является ответвлением пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты и создает соединение, отличное от L-глутаминовой кислоты.

В качестве примеров фермента, который катализирует реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты, можно указать глутаматдегидрогеназу (далее называемую "GDH"), глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу (далее также называемую "CS"), фосфоенолпируваткарбоксилазу (далее также называемую "РЕРС"), пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу, глюкозофосфатизомеразу и так далее. Среди этих ферментов предпочтительны один, два или три фермента CS, РЕРС и GDH. Кроме того, предпочтительно, чтобы активности всех трех ферментов CS, РЕРС и GDH были усилены у микроорганизма, накапливающего L-глутаминовую кислоту. В частности, предпочтительна CS Brevibacterium lactofermentum, поскольку она не подвержена ингибированию α-кетоглутаровой кислотой, L-глутаминовой кислотой и NADH.

Например, для того, чтобы усилить активность CS, РЕРС или GDH, ген, кодирующий CS, РЕРС или GDH можно клонировать в соответствующей плазмиде и полученной плазмидой можно трансформировать микроорганизм-хозяин. Количество копий гена, кодирующего CS, РЕРС или GDH (далее называемых сокращенно "ген gltA", "ген ррс" и "ген gdhA" соответственно) в трансформированных клетках штамма увеличивается, приводя в результате к увеличению активности CS, РЕРС или GDH.

Клонированные гены gltA, ррс и gdhA вводят в вышеуказанный исходный родительский штамм отдельно или в произвольной комбинации двух или трех их видов. В том случае, когда вводят два или три вида указанных генов, два или три вида генов можно клонировать в плазмиде одного вида и ввести в хозяина, или отдельно клонировать в двух или трех видах плазмид, которые могут существовать совместно, и ввести в хозяина.

Два или несколько видов генов, кодирующих фермент одного вида, но полученных из разных микроорганизмов, можно ввести в одного и того же хозяина.

Описанные выше плазмиды особым образом не ограничиваются, при условии, что они автономно реплицируются в клетке микроорганизма, относящегося, например, к роду Enterobacter или ему подобному. Однако можно указать, например, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 и так далее. Кроме указанного можно также использовать векторы фаговой ДНК.

Трансформацию можно проводить, например, способом D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), способом, при котором проницаемость для ДНК бактериальных клеток-реципиентов увеличивают обработкой клеток хлоридом кальция (Mandel M and Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), электропорацией (Miller J. H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) и тому подобное.

Активность CS, РЕРС или GDH также можно увеличить, обеспечивая возможность для присутствия многочисленных копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомной ДНК вышеуказанного исходного родительского штамма, который будет хозяином. Для того чтобы ввести множественные копии гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомную ДНК микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter или ему подобного, можно использовать последовательность, множественные копии которой присутствуют в хромосомной ДНК, такую как повторяющаяся ДНК и инвертированные повторы, присутствующие на концах транспозируемого элемента. В альтернативном случае множественные копии генов можно вводить в хромосомную ДНК, используя перенос транспозона, содержащего ген gltA, ген ррс или ген gdhA. В результате увеличивается количество копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в трансформированной линии клеток, и поэтому увеличивается активность CS, РЕРС или GDH.

В качестве организмов, используемых в качестве источника гена gltA, гена ррс или гена gdhA, количество копий которых требуется увеличить, можно использовать любой организм, при условии, что он обладает активностью CS, РЕРС или GDH. В числе других предпочтительны бактерии, которые являются прокариотами, например, бактерии, относящиеся к роду Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium или Bacillus. В качестве конкретных примеров можно указать Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum и так далее. Ген gltA, ген ррс или ген gdhA можно получить из хромосомной ДНК описанных выше микроорганизмов.

Ген gltA, ген ррс и ген gdhA можно получить с использованием мутантного штамма, который дефицитен по активности CS, РЕРС или GDH, чтобы выделить фрагмент ДНК, который комплементирует