Способ получения ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба

Способ получения ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных и высокоактивных препаратов ингибиторов ферментов, которые могут быть использованы в медицине, косметологии, ветеринарии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.

Коллагеназы камчатского краба успешно используются в медицине для лечения ожогов, гнойно-трофических язв, послеоперационных рубцов. Механизм процесса заживления ран при применении препарата протеолитического/коллагенолитического действия заключается в лизисе некротических тканей, что приводит к очищению раны. Следующей стадией является процесс заживления раны, восстановление новых клеток тканей и кожи. Если концентрация коллагеназ и коллагенолитических ферментов в препарате очень большая, то процессы восстановления могут замедлиться за счет гидролиза этими ферментами коллагена здоровых тканей, поэтому необходимо блокировать ферментативное действие. Особенно это важно при лечении глазных заболеваний. Наиболее физиологичный способ - применение соответствующих ингибиторов, однако как коллагеназы, так и коллагенолитические ферменты устойчивы к действию известных ингибиторов трипсина и химотрипсина. Коллагеназы вызывают деградацию коллагена, что связано с преждевременным старением кожи. Поэтому ингибитор коллагеназ можно ввести в различные косметические средства (кремы, лосьоны, гели, мази) для предотвращения образования морщин или лечения атрофии кожи.

Известен способ получения ингибитора протеиназ (но не коллагеназ) из органов крупного рогатого скота, который заключается в том, что сырье измельчают, проводят экстракцию в кислой среде, обрабатывают экстракт, после удаления осадка целевой продукт выделяют хроматографией на адсорбенте силикатного типа и осаждают из элюата органическими растворителями. По указанному способу удается выделить продукт с активностью 500-1500 КИЕ/мг, однако указанный продукт не отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам ингибитора протеиназ.

Патент Германии №1492114, А 61 К 17/00, 1972.

Известен способ получения ингибитора коллагеназы из акульих хрящей. Экстракты хрящей акулы обладают антиангиогенной, непосредственной противоопухолевопролиферирующей, антивоспалительной и антиколлагенолитической активностями. Способ включает стадии получения гомогената хряща в водном растворе, центрифугирования этого гомогената и дальнейшего его фракционирования до получения полного экстракта, содержащего молекулы до 500 кДа. Дополнительное фракционирование экстракта с помощью ультрафильтрации на мембранных фильтрах и гель-фильтрации на Суперозе S-12 и гидрофобной хроматографии на колонке с СДС-S-гексил в режиме FPLC (жидкостной хроматографии высокого давления) позволило выделить одну из фракций экстракта (до 10 кДа), обладающую антиколлагенолитической активностью. Ингибиторное действие на коллагеназу 1 типа (ММТ1) определяли по флюорогенному субстрату и с помощью электрофореза в SDS-PAGE.

Способ очень сложен в исполнении, т.к. на стадии фракционирования включает множество трудоемких сложных операций, осуществимых только в хорошо оборудованных лабораториях. Кроме того, источник ингибитора - акулий хрящ практически не содержит протеолитические ферменты, и ингибитор, полученный по вышеуказанному способу, относится к ингибиторам металлопротеиназ.

Патент РФ №2157695, А 61 К 35/60, 20.10.2000.

Ближайшим техническим решением является способ получения основного ингибитора протеиназ (но не коллагеназ), из органов крупного рогатого скота, заключающийся в том, что органы крупного рогатого скота, содержащие ингибитор (легкие, поджелудочная железа, слюнные железы, измельчают (гомогенизируют), проводят экстракцию в кислой среде, отделяют жмых, удаляют липиды и белки, центрифугируют, основной экстракт-ингибитор протеиназ хроматографируют на сульфокатионите, элюат обрабатывают соляной кислотой до рН 1-3, удаляют осадок балластных белков, полученный супернатант обрабатывают трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5-7,0%, повторно удаляют примесные белки, из надосадочной жидкости высаливают основной ингибитор протеиназ, который потом очищают хроматографией на сефадексе, а затем выделяют препарат осаждением ацетоном или лиофильной сушкой. Получают апирогенный препарат, активность которого не менее 5000 КИЕ/мг.

Недостатками способа является многостадийность процесса, использование большого количества легко воспламеняющихся дорогих органических растворителей (спирт, ацетон) и высоких концентраций трихлоруксусной кислоты (50%), соляной кислоты и едкого натра, которые требуют при использовании особых условий, также отрицательно влияют на экологические условия, требуя разработки специальных способов утилизации отходов производства. Существенным недостатком является применение на стадии обессоливания препарата колонки с дорогостоящим сефадексом импортного производства. По существу этот многостадийный лабораторный метод получения ингибитора не поддается масштабированию.

Патент РФ №2067868, А 61 К 35/39, 20.10.1996.

Задачей изобретения является создание способа выделения неизвестного ранее эндогенного ингибитора коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба экономичным способом.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения ингибитора коллагеназы, включающем гомогенизацию сырья, содержащего протеолитические ферменты, способ характеризуется проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат затем центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70% насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы дистиллированной водой, с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием и лиофильным высушиванием.

Обычно супернатант промывают дистиллированной водой не менее 3-х раз, а прогревание супернатанта ведут преимущественно при 80-85°С в течение 25-40 мин.

Гепатопанкреас крабов, особенно камчатского краба, является источником протеолитических ферментов, в том числе и коллагеназ, способных образовывать комплексы с эндогенным ингибитором, коллагенолитические ферменты гепатопанкреаса краба относятся к особому семейству ферментов - брахиуринам. Это сериновые протеиназы, совмещающие в себе свойства трипсина и химотрипсина, поэтому ингибиторы металлопротеиназ на них не действуют. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов, поэтому выделение неизвестного ранее эндогенного ингибитора коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба является основной задачей настоящего изобретения.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника ингибитора коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1-мМ ацетат кальция. Экстракт отделяют центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения, осадок, содержащий комплекс коллагеназ и коллагенолитических ферментов с ингибитором, отделяют центрифугированием, растворяют в воде с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Концентрирование, обессоливание, очистку проводят следующим образом. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Супернатант, содержащий целевой продукт, промывают дистиллированной водой 3 раза, прогреванют до 60-100°С, преимущественно при 80-85°С, в течение 25-40 мин для инактивации протеолитических ферментов, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а супернатант, содержащий ингибитор, лиофильно высушивают. Получают препарат ингибитора в количестве 56 г.

Пример 1.

20 кг гепатопанкреаса гомогенизируют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,3 мМ ацетата кальция, затем осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют. Полученный осадок (сульфат-паста) растворяют в 15 л дистиллированной с добавлением 0,1 мМ ацетата кальция воды до получения истинного раствора, объем доводят до 100 л и тщательно перемешивают. Концентрирование раствора проводят на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Концентрат объемом 10 л доводят дистиллированной водой до 50 л и снова концентрируют до 10 л. Эту процедуру проводят еще два раза. Супернатант, содержащий целевой продукт, прогревают при 80°С в течение 25 мин, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а раствор высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия. Выход препарата ингибитора составляет 56 г.

Пример 2.

500 г препарата коллагеназы производства фирмы «Биопрогресс» растворяют в 15 л дистиллированной воды с добавлением 0,2 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Объем полученного раствора доводят до 50 л, тщательно перемешивают. Раствор далее подвергают очистке на мембранном аппарате для микрофильтрации PELLICON, "Millipore" с размером пор 100 кДа. Целевой продукт содержится в супернатанте. Супернатант затем концентрируют до 10 л, три раза промывают дистиллированной водой, прогревают до 90°С в течение 40 мин, удаляют образовавшийся осадок центрифугированием (12000g, 7 мин), а раствор, содержащий ингибитор, высушивают на сублимационной сушке TG-50, Германия. Выход препарата ингибитора составляет 45 г.

Полученный в соответствии с предлагаемым способом ингибитор представляет собой порошок светло-коричневого оттенка, хорошо растворимый в водных буферных растворах.

При исследовании ингибирующего действия полученного препарата с применением хромогенного субстрата коллагенолитической сериновой протеиназы PC Glp-Ala-Ala-Leu-pNA было показано, что ингибирующая активность является дозозависимой. Результаты исследований приведены в таблице.

Таблица
Концентрация «Морикразы», мкг	Концентрация препарата ингибитора, мкг	% ингибирования по хромогенному субстрату
0,5	160	50
0,5	400	78
0,5	800	93

Ингибирование коллагеназной активности препарата «Морикраза» было подтверждено электрофорезом гидролизата коллагена типа I.

На чертеже показана электрофоретическая характеристика ингибитора и его ингибирующего действия коллагенолитической активности препарата «Морикраза». 12% ПААГ, инкубация проводилась при комнатной температуре. Дорожка 1 - препарат «Морикраза», дорожка 2 - препарат ингибитора, дорожка 3 - исходный препарат коллагена типа I, дорожка 4 - препарат коллагена + препарат «Морикраза» в соотношении 30:1, время инкубации 1 час, + препарат ингибитора без инкубации с ним; дорожки 5-8: время инкубации с ингибитором 2 часа, соотношение фермент: ингибитор = 1:100 - дорожки 5 (время инкубации коллагена с «Морикразой» 1 час) и дорожка 6 (время инкубации коллагена с «Морикразой»24 часа); соотношение фермент: ингибитор = 1:50 - дорожка 7 (время инкубации коллагена с «Морикразой» 1 час) и дорожка 8 (инкубации коллагена с «Морикразой» время 24 часа). Стрелкой отмечено положение полосы, соответствующей неразрушенному коллагену.

Коллагеназное действие препарата блокируется при наличии эндогенного ингибитора в соотношении фермент: ингибитор не менее чем 1:100.

Как видно из чертежа, только при соотношении препарат «Морикраза»: ингибитор = 100:1 наблюдается полное ингибирование истинной коллагеназной активности (см. дорожки 5 и 6). Чистоту ингибитора демонстрирует дорожка 2, где видны только две интенсивные белковые полосы. Возможно это изоформы одного и того же ингибитора.

Предлагаемый способ позволяет получить неизвестный ранее эндогенный ингибитор коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса камчатского краба достаточно экономичным способом благодаря использованию метода микрофильтрации на специально подобранных мембранах. Это позволяет значительно сократить время проведения процесса и удешевить производство ингибитора. Проведение микрофильтрации на мембране с размером пор 100 кДа позволяет удалять низкомолекулярные примеси и коллагенолитические ферменты, полностью сохраняя ингибитор, осуществить обессоливание и концентрирование препарата на том же аппарате, что приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых значительно сокращается. Высаливание белков дешевым сульфатом аммония при слабокислом и нейтральном рН способствует сохранению активности ингибиторов и удешевлению процесса. Кроме того, применение ацетата и сульфата аммония для экстракции и высаливания ингибитора вместо спирта, ацетона, трихлоруксусной кислоты, применяемых по прототипу, более удачно с точки зрения экологической безопасности процесса, т.к. растворы солей аммония при разбавлении могут быть использованы для удобрения растений.

1. Способ получения ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба, характеризующийся проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при рН 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой супернатанта, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием и лиофильным высушиванием.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что супернатант промывают дистиллированной водой не менее 3 раз.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что прогревание супернатанта ведут преимущественно при 80-85°С в течение 25-40 мин.