Ген streptomyces avermitilis и его применение для изменения соотношения авермектинов b2:b1

Ген streptomyces avermitilis и его применение для изменения соотношения авермектинов b2:b1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

1. Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим авермектины, и способам эффективного получения авермектинов, таких как "дорамектин", которые находят широкое применение в ветеринарии. В частности, настоящее изобретение относится к молекулам полинуклеотидов, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие продукт гена AveC, который можно использовать для модуляции отношения авермектинов класса 2:1, полученных ферментацией культур Streptomyces avermitilis. Настоящее изобретение далее относится к векторам, трансформированным клеткам-хозяевам и новым мутантным штаммам S. avermitilis, в которых ген aveC мутирован с возможностью модуляции соотношения продуцируемых авермектинов класса 2:1.

2. Предпосылки изобретения

2.1. Авермектины

Виды из рода Streptomyces продуцируют целый ряд вторичных метаболитов, в том числе авермектины, которые образуют серию из восьми родственных шестнадцатичленных макроциклических лактонов, обладающих сильной антигельминтной и инсектицидной активностью. Восемь разных, но близко родственных соединений обозначены как А1а, А1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a и B2b. Серия "а" указанных соединений включает природный авермектин, в котором заместитель в положении С25 является (S)-втор-бутилом, и серия "b" включает такие соединения, в которых заместитель в положении С25 является изопропилом. Символы "А" и "В" служат для обозначения авермектинов, в которых заместитель в положении С5 является соответственно метоксильной и гидроксильной группой. Цифрой "1" обозначены авермектины, у которых в положении С22,23 находится двойная связь, и цифрой "2" обозначены авермектины, содержащие атом водорода в положении С22 и гидроксильную группу в положении С23. Считается, что среди родственных авермектинов особенно сильной противопаразитарной и пестицидной активностью обладает авермектин типа В1, такой как дорамектин, который является наиболее привлекательным в коммерческом отношении.

Авермектины и способы их получения методом аэробной ферментации штаммов S. avermitilis описаны в патентах США №№ 4310519 и 4429042. Считается, что биосинтез природных авермектинов инициируется эндогенно СоА-аналогами сложного тиоэфира изомасляной кислоты и S-(+)-2-метилмасляной кислоты.

Улучшение штамма в результате неспецифического мутагенеза и использование экзогенно вводимых жирных кислот сделало возможным эффективное продуцирование аналогов авермектина. Мутанты S. avermitilis, в которых отсутствует 3-кетокислота-дегидрогеназа с разветвленной цепью (мутанты с отсутствием bkd), могут продуцировать авермектины только в процессе ферментации с введением жирных кислот. Скрининг и выделение мутантов, не обладающих активностью дегидрогеназы с разветвленной цепью (например, S. avermitilis, АТСС 53567), описаны в европейском патенте (ЕР) № 276103. Ферментация таких мутантов в присутствии экзогенно вводимых жирных кислот позволяет получить только четыре авермектина, соответствующих используемым жирным кислотам. Так, в результате ферментации S. avermitilis (АТСС 53567) с введением S-(+)-2-метилмасляной кислоты образуются природные авермектины А1а, А2а, В1а и В2а; в результате ферментации с введением изомасляной кислоты образуются природные авермектины A1b, A2b, B1b и B2b; и в результате ферментации с введением циклопентанкарбоновой кислоты образуются четыре новых циклопентилавермектина А1, А2, В1 и В2.

При введении других жирных кислот образуются новые авермектины. В результате скрининга более 800 предполагаемых предшественников было идентифицировано более 60 новых авермектинов. (См., например, Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44:357-365; and Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Кроме того, мутанты S. avermitilis, не обладающие активностью 5-О-метилтрансферазы, продуцируют в основном только аналоги авермектинов В. Следовательно, мутанты S. avermitilis, у которых отсутствует как 2-кетокислота-дегидрогеназа с разветвленной цепью, так и 5-О-метилтрансфераза, продуцируют только авермектины В, соответствующие жирной кислоте, используемой в процессе ферментации. Таким образом, при добавлении к таким двойным мутантам S-(+)-2-метилмасляной кислоты образуются только природные авермектины В1а и В2а, в то время как при добавлении изомасляной кислоты или циклопентанкарбоновой кислоты образуются соответственно природные авермектины B1b и B2b или новые циклопентилавермектины В1 и В2. Добавление к штамму с двумя мутациями циклогексанкарбоновой кислоты является предпочтительным способом получения коммерчески важного нового авермектина, такого как циклогексилавермектин В1 (дорамектин). Способы выделения и характеристики таких двойных мутантов, например S. avermitilis (АТСС 53692), описаны в европейском патенте № 276103.

2.2. Гены, участвующие в биосинтезе авермектина

Обнаружено, что во многих случаях гены, участвующие в продуцировании вторичных метаболитов, и гены, кодирующие определенный антибиотик, образуют в хромосоме совместные кластеры. Именно таким кластером является кластер генов поликетидсинтезы Streptomyces (PKS) (см. Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Таким образом, одним методом клонирования генов в процессе биосинтеза является выделение гена лекарственной устойчивости и исследование смежных областей хромосомы с целью обнаружения других генов, имеющих отношение к биосинтезу данного антибиотика. Другим методом клонирования генов, участвующих в биосинтезе важных метаболитов, является комплементация мутантов. Например, части библиотеки ДНК из организма, способного продуцировать определенный метаболит, вводят в мутант, не продуцирующий такой метаболит, и ведут поиск трансформантов, продуцирующих данный метаболит. Кроме того, для идентификации и клонирования генов в процессе биосинтеза используют гибридизацию библиотеки при помощи зондов, выделенных из других видов из рода Strepromyces.

Установлено, что гены, участвующие в биосинтезе авермектина (гены ave), подобно генам, необходимым для биосинтеза других вторичных метаболитов Strepromyces (например, PKS), образуют кластеры в хромосоме. Был успешно клонирован ряд генов ave с использованием векторов для комплементации мутантов S. avermitilis, блокируемых в процессе биосинтеза авермектина. Клонирование таких генов описано в патенте США № 5252474. Кроме того, Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, описали локализацию области хромосомы, имеющей непосредственное отношение к дегидратации в положениях С22,23 (aveC) фрагмента BamHI длиной 4,82 т.п.о. S. avermitilis, а также к мутациям гена aveC, в результате чего образуется однокомпонентный продуцент В2а. Так как ивермектин, сильнодействующее антигельминтное соединение, можно получить химическим путем из авермектина В2а, то однокомпонентный продуцент авермектина В2а считается особенно пригодным для коммерческого получения ивермектина.

В патенте США № 6248579, выданном Stutzman-Engwall 19 июня 2001 г., описаны некоторые мутации гена aveC Streptomyces avermitilis, позволяющие уменьшить соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 примерно до 0,75:1.

В заявке РСТ WO 01/12821 компании Pfizer Products Inc., опубликованной 22 февраля 2001 г., описаны некоторые дополнительные мутации гена AveCa Streptomyces avermitilis, вызывающие дальнейшее уменьшение соотношения авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 до 0,40:1.

Идентификация дополнительных мутаций или комбинаций мутаций в гене AveC, позволяющих значительно упростить продуцирование авермектина, таких как, например, мутации, уменьшающие соотношение авермектинов В2 : В1, дожна облегчить получение и очистку коммерчески важных авермектинов.

3. Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к молекуле полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична аллелю aveC Streptomyces avermitilis, последовательности плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ORF) aveC S. avermitilis, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), или их вырожденному варианту, но при этом имеет мутации, кодирующие комбинацию замен аминокислот в положении аминокислотных остатков, соответствующих положениям аминокислот SEQ ID No.2, благодаря чему клетки штамма S. avermitilis АТСС 53692, в которых инактивирован аллель aveC дикого типа и которые экспрессируют молекулу полинуклеотида, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность, способны продуцировать авермектины класса 2:1 с меньшим соотношением по сравнению с соотношением, продуцируемым клетками штамма S. avermitilis АТСС 53692, экспрессирующими только аллель aveC дикого типа, причем, когда авермектины класса 2:1 являются авермектинами циклогексил В2:циклогексил В1, соотношение авермектинов класса 2:1 составляет 0,35:1 или меньше. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,30:1 или меньше. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,25:1 или меньше. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,20:1 или меньше.

В конкретном варианте осуществления изобретения комбинация замен аминокислот включает комбинацию, выбираемую из нижеследующего списка:

Настоящее изобретение далее относится к молекуле полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична аллелю aveC Strepromyces avermitilis, последовательности плазмиды pSЕ186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания aveC S. avermitilis, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), или их вырожденному варианту, но при этом имеет мутации, кодирующие комбинацию замен аминокислот в положении аминокислотных остатков, соответствующих положениям аминокислот SEQ ID No.2, благодаря чему клетки штамма S. avermitilis АТСС 53692, в которых инактивирован аллель aveC дикого типа и которые экспрессируют молекулу полинуклеотида, содержащую мутированную нуклеотидную последовательность, способны продуцировать авермектины класса 2:1 с меньшим соотношением по сравнению с соотношением, продуцируемым клетками штамма S. avermitilis АТСС 53692, экспрессирующими только аллель aveC дикого типа, причем, когда авермектины класса 2:1 являются авермектинами циклогексил В2: циклогексил В1, соотношение авермектинов класса 2:1 уменьшается примерно до 0,40:1 или меньше, и комбинация замен аминокислот включает комбинацию, выбираемую из нижеследующей группы:

(bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; и

(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.

Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантному вектору, содержащему молекулу полинуклеотида по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение далее относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу полинуклеотида или рекомбинантный вектор по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин является клеткой Streptomyces. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин является клеткой Streptomyces avermitilis.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения нового штамма Streptomyces avermitilis, который включает (i) мутирование аллеля aveC в клетке штамма S. avermitilis, вызывающее комбинацию замен аминокислот в продукте гена AveC, или (ii) введение в клетку штамма S. avermitilis мутированного аллеля aveC или его вырожденного варианта, кодирующего продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из пунктов (а)-(be) приведенного выше списка.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения нового штамма Strepromyces avermitilis, который включает (i) мутирование аллеля aveC в клетке штамма S. avermitilis, вызывающее комбинацию замен аминокислот в продукте гена AveC, или (ii) введение в клетку штамма S. avermitilis мутированного аллеля aveC или его вырожденного варианта, кодирующего продукт гена AveC, включающий комбинацию замен аминокислот, благодаря чему клетки, содержащие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, способны продуцировать авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении 0,35:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант кодирует продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (а)-(be) приведенного выше списка.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,30:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант кодирует продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (f)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,25:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант кодирует продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (w)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,20:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант кодирует продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (ао)-(be) приведенного выше списка.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения нового штамма Streptomyces avermitilis, который включает (i) мутирование аллеля aveC в клетке штамма S. avermitilis, вызывающее комбинацию замен аминокислот в продукте гена AveC, или (ii) введение в клетку штамма S. avermitilis мутированного аллеля aveC или его вырожденного варианта, кодирующего продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (bf) и (bg) приведенного выше списка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки S. avermilitis, содержащие такой мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, способны продуцировать авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении около 0,40:1 или меньше.

Настоящее изобретение далее относится к клетке вида из рода Streptomyces, которая содержит мутированный аллель aveC S. avermitilis или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (а)-(be) приведенного выше списка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вид из рода Streptomyces является видом из рода S. avermitilis.

Настоящее изобретение далее относится к клетке Streptomyces avermitilis, способной продуцировать авермектины циклогексил В2: циклогексил В1 в соотношении 0,35:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения указанная клетка содержит мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (а)-(be) приведенного выше списка.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2:циклогексил В1 составляет примерно 0,30:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения указанные клетки содержат мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (f)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,25:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения указанные клетки содержат мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (w)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение авермектинов циклогексил В2:циклогексил В1 составляет примерно 0,20:1 или меньше. В неограничивающем варианте осуществления изобретения указанные клетки содержат мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (ао)-(be) приведенного выше списка.

Настоящее изобретение далее относится к клетке вида из рода Streptomyces, которая содержит мутированный аллель aveC S. avermitilis или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (bf) и (bg) приведенного выше списка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вид из рода Streptomyces является видом из рода S. avermitilis. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная клетка является клеткой S. avermitilis, способной продуцировать авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении около 0,40:1 или меньше.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения авермектинов, который включает культивирование штамма клеток Streptomyces avermitilis по настоящему изобретению в культуральной среде в условиях, стимулирующих или индуцирующих продуцирование авермектинов, и выделение указанных авермектинов из культуры.

Настоящее изобретение далее относится к композиции авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1, продуцируемой клетками Streptomyces avermitilis в культуральной среде, используемой для культивирования клеток, в которой соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет 0,35:1 или меньше, предпочтительно около 0,30:1 или меньше, более предпочтительно около 0,25:1 или меньше и наиболее предпочтительно около 0,20:1 или меньше. В конкретном варианте осуществления изобретения композицию авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 продуцируют клетки штамма S. avermitilis, экспрессирующие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий генный продукт, благодаря чему уменьшается соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 класса 2:1, продуцированных указанными клетками, по сравнению с клетками такого же штамма S. avermitilis, которые экспрессируют только аллель aveC дикого типа и не экспрессируют мутированный аллель aveC.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором указанная композиция включает авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении 0,35:1 или меньше, данную композицию продуцируют клетки, содержащие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (а)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором указанная композиция включает авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении около 0,30:1 или меньше, данную композицию продуцируют клетки, содержащие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (f) и (be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором указанная композиция включает авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении около 0,25:1 или меньше, данную композицию продуцируют клетки, содержащие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (w)-(be) приведенного выше списка.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, в котором указанная композиция включает авермектины циклогексил В2 : циклогексил В1 в соотношении около 0,20:1 или меньше, данную композицию продуцируют клетки, содержащие мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (ао)-(be) приведенного выше списка.

Настоящее изобретение далее относится к композиции авермектинов циклогексил В2 :циклогексил В1, продуцированной клетками Streptomyces avermitilis в культуральной среде, используемой для культивирования указанных клеток, в которой соотношение авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1 составляет примерно 0,40:1 или меньше, а также клетками, содержащими мутированный аллель aveC или его вырожденный вариант, кодирующий продукт гена AveC, содержащий комбинацию замен аминокислот, выбираемую из группы, включающей пункты (bf) и (bg) приведенного выше списка.

4. Краткое описание чертежей

Фигура 1. Последовательность ДНК (SEQ ID No.1), содержащая открытую рамку считывания aveC S. avermitilis и выделенную аминокислотную последовательность (SEQ ID No.2).

Фигура 2. Плазмидный вектор pSE186 (АТСС 209604), содержащий полную открытую рамку считывания гена aveC S. avermitilis.

Фигура 3. Вектор замещения гена pSE180 (АТСС 209605), содержащий ген ermE Sacc. erythraea, встроенный в открытую рамку считывания aveC S. avermitilis.

Фигура 4. Рестрикционная карта BamHI кластера генов поликетидсинтазы авермектина в S. avermitilis с пятью идентифицированными перекрывающимися космидными клонами (то есть pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Указана также взаимосвязь между pSE118 и pSE119.

Фигура 5. Анализ методом ВЭЖХ продуктов ферментации, продуцированных штаммами S. avermitilis. Количественное определение пиков выполнено путем сравнения со стандартными количествами циклогексилавермектина В1. Время удерживания циклогексилавермектина В2 равно 7,4-7,7 мин; время удерживания циклогексилавермектина В1 равно 11,9-12,3 мин. Фиг. 5А. Штамм SE180-11 S. avermitilis с открытой рамкой считывания инактивированного аллеля aveC. Фиг. 5В. Штамм SE180-11 S. avermitilis, трансформированный плазмидой pSE186 (АТСС 209604). Фиг. 5С. Штамм SE180-11 S. avermitilis, трансформированный плазмидой pSE187. Фиг. 5D. Штамм SE180-11 S. avermitilis, трансформированный плазмидой pSE188.

Фигура 6А-М. Компилированный список комбинаций замен аминокислот, кодированных мутациями в аллеле aveC, определенный во втором цикле "перестановки генов", и их влияние на соотношение продуцируемых авермектинов циклогексил В2 : циклогексил В1. Для каждой плазмиды в верхней блоке колонки, озаглавленной "Мутации", указаны замены аминокислот и в нижнем блоке перечислены замены нуклеотидных оснований, приводящие к замене указанных аминокислот. Замены нуклеотидных оснований, указанные в скобках, являются молчащими заменами, то есть они не вызывают изменений аминокислотной последовательности.

5. Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к идентификации и исследованию молекул полинуклеотидов, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие продукт гена AveC, продуцированного Streptomyces avermitilis, к созданию новых штаммов S. avermitilis, которые можно использовать для скрининга мутированных продуктов гена AveC с целью определения их влияния на продуцирование авермектина, и к открытию того, что некоторые мутированные продукты гена AveC могут уменьшать соотношение авермектинов В2:В1, продуцированных S. avermitilis. В качестве примера в нижеследующих разделах данного изобретения описана молекула полинуклеотида, содержащая нуклеотидную последовательность, которая аналогична последовательности плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, или нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), и молекулы полинуклеотидов, содержащие мутированные нуклеотидные последовательности и их вырожденные варианты. Однако принципы, изложенные в настоящем изобретении, в равной степени применимы к другим молекулам полинуклеотидов, включающим наряду с прочими гомологичные гены aveC, продуцируемые другими видами из рода Streptomyces, например, S. hygroscopicus и D. griseochromogenes.

5.1. Молекулы полинуклеотидов, кодирующие продукт гена AveC S. avermitilis

Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле полинуклеотида, содержащей полную открытую рамку считывания aveC S. avermitilis или ее значительную часть, причем в указанной молекуле полинуклеотида отсутствует следующая полная открытая рамка считывания, расположенная внизу от открытой рамки считывания aveC in situ в хромосоме S. avermitilis.

Выделенная молекула полинуклеотида по настоящему изобретению предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, которая аналогична последовательности плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), или ее значительной части. В используемом здесь значении термин "значительная часть" выделенной молекулы полинуклеотида, содержащей нулеотидную последовательность, кодирующую продукт гена AveC S. avermitilis, означает выделенную молекулу полинуклеотида, которая содержит по крайней мере около 70% последовательности полной открытой рамки считывания aveC, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), и кодирует функционально эквивалентный продукт гена AveC. Таким образом, "фукнционально эквивалентный" продукт гена AveC определяется как генный продукт, который при экспрессии в штамме S. avermitilis АТСС 53692, в котором инактивирован нативный аллель aveC, вызывает продуцирование авермектинов по существу в таком же соотношении и количестве, что и при продуцировании штаммом S. avermitilis АТСС 53692, экспрессирующим только функциональный аллель aveC дикого типа, который является нативным для штамма S. avermitilis АТСС 53692.

Помимо нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания aveC выделенная молекула полинуклеотида по настоящему изобретению может далее содержать нуклеотидные последовательности, которые фланкируют ген aveC in situ в S. avermitilis, в частности последовательности, фланкирующие нуклеотидные последовательности, показанные на фигуре 1 (SEQ ID No.1).

Настоящее изобретение далее относится к выделенной молекуле полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID No.1 или ее вырожденный вариант на основе известной вырожденности генетического кода.

В используемом здесь значении термины "молекула полинуклеотида", "полинуклеотидная последовательность", "кодирующая последовательность", "открытая рамка считывания" и "ORF" означают молекулы ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут быть транскрибированы и транслированы (ДНК) или транслированы (РНК) в продукт гена AveC или полипептид, гомологичный продукту гена AveC, в соответствующей экспрессирующей системе клетки-хозяина под контролем соответствующих регуляторных элементов. Кодирующая последовательность может включать, не ограничиваясь ими, прокариотические последовательности, последовательности кДНК, последовательности геномной ДНК и последовательности химически синтезированных ДНК и РНК.

Нуклеотидная последовательность, показанная на фигуре 1 (SEQ ID No.1), содержит четыре разных кодона GTG в положениях пар оснований 42, 174, 177 и 180. Как ранее было описано в патенте США № 6248579, несколько делеций в 5'-концевой области открытой рамки считывания aveC (фигура 1; SEQ ID No.1) были созданы для определения того, какие из указанных кодонов могут функционировать в открытой рамке считывания aveC в качестве сайтов инициации экспрессии белка. Делеция первого сайта GTG в положении пары оснований 42 не устраняла активность гена AveC. Дополнительная делеция всех кодонов GTG в положениях пар оснований 174, 177 и 180 подавляла активность гена AveC, что указывало на необходимость данной области для экспрессии белка. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят открытые рамки считывания aveC переменной длины.

Настоящее изобретение далее относится к молекуле полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, или нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания aveC, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), или ее значительной части. Термин "гомологичный" применительно к молекуле полинуклеотида, которая гомологична последовательности, кодирующей продукт гена AveC S. avermitilis, означает молекулу полинуклеотида, содержащую нуклеотидную последовательность, которая (а) кодирует такой же продукт гена AveC, что и последовательность плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующая продукт гена AveC S. avermitilis, или кодирует такой же продукт гена AveC, что и нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания aveC, показанная на фигуре 1 (SEQ ID No.1), но включает одну или несколько молчащих замен в нуклеотидной последовательности в соответствии с вырожденностью генетического кода (то есть вырожденный вариант); или (b) гибридизирует с комплементом молекулы полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, кодированную последовательностью плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC, и кодирует аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID No.2), в умеренно строгих условиях, то есть при осуществлении гибридизации с фильтрсвязанной ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% додецилсульфата натрия (SDS), 1 мМ EDTA при 65°С и выполнении промывки в 0,2×SSC/0,1% SDS при 42°С (см. Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3), и кодирует вышеуказанный функционально эквивалентный продукт гена AveC. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гомологичная молекула полинуклеотида гибридизирует с комплементом нуклеотидной последовательности плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC, или с комплементом нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания aveC, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.1), или ее значительной части в очень строгих условиях, то есть при осуществлении гибридизации с фильтрсвязанной ДНК в 0,5 М NaHPO₄, 7% SDS, 1 мМ EDTA при 65°С и выполнении промывки в 0,1×SSC/0,1% SDS при 68°С (Ausubel et al., 1989, см. выше), и кодирует вышеуказанный фукционально эквивалентный продукт гена AveC.

Активность продукта гена AveC и его потенциальных функциональных эквивалентов можно определить при помощи анализа методом ВЭЖХ продуктов ферментации, как это описано в нижеследующих примерах. Молекулы полинуклеотидов, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют функциональные эквиваленты продукта гена AveC S. avermitilis, могут включать естественные гены AveC, присутствующие в других штаммах S. avermitilis, гомологичные гены AveC, присутствующие в других видах из рода Streptomyces, и мутированные аллели aveC, которые являются естественными или созданными методами рекомбинантных ДНК.

Настоящее изобретение далее относится к молекуле полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, гомологичную аминокислотной последовательности, кодированной последовательностью плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC, или аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.2), или ее значительной части. В используемом здесь значении термин "значительная часть" аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.2), означает полипептид, содержащий по крайней мере около 70% аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.2), и представляющий собой вышеуказанный функционально эквивалентный продукт гена AveC.

В используемом здесь значении применительно к аминокислотным последовательностям, гомологичным аминокислотной последовательности продукта гена AveC, продуцированного штаммом S. avermitilis, термин "гомологичный" относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, показанную на фигуре 1 (SEQ ID No.2), в которой один или несколько аминокислотных остатков консервативно заменены другим аминокислотным остатком, при этом указанная аминокислотная последовательность по крайней мере примерно на 70%, более предпочтительно по крайней мере примерно на 80% и наиболее предпочтительно по крайней мере примерно на 90% идентична полипептиду, кодированному последовательностью плазмиды pSE186 (АТСС 209604), кодирующей продукт гена AveC, или аминокислотной последовательности, показанной на фигуре 1 (SEQ ID No.2), при определении с помощью стандартного алгорифма идентичности аминокислотных последовательностей, такого как алгорифм BLASTP (GENBANK, NCBI), и, кроме того, такая консервативная замена позволяет получить вышеуказанный функционально эквивалентный генный продукт. Консервативные замены аминокислот хорошо известны в данной области. Правила выполнения таких замен описаны наряду с другими научными работами в публикации Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3. В частности, консервативные замены аминокислот представляют собой такие замены, которые обычно происходят в семействе аминокислот, родственных в отношении кислотности или полярности. Генетически кодированные аминокислоты обычно делят на четыре группы: (1) кислые = аспартат, глутамат; (2) основные = лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин классифицированы также как ароматические аминокислоты. Одна или несколько замен в любой из указанных групп, например замена лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или любого другого аминокислотного остатка структурно родственным аминокислотным остатком, например аминокислотным остатком с одинаковой кислотностью или полярностью либо сходной комбинацией свойств, обычно оказывает незначительное воздействие на функцию полипептида.

Методы получения и обработки молекул полинуклеотидов по данному изобретению известны в данной области и могут быть выполнены методами рекомбинантных ДНК, описанными, например, в публикациях Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, которые включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Клоны полинуклеотидов, кодирующие продукты гена AveC или продукты гомологичного гена AveC, можно идентифицировать любыми методами, известными в данной области, которые включают, не ограничиваясь ими, методы, рассмотренные в нижеследующем разделе 7. Библиотеки геномных ДНК можно исследовать с целью обнаружения последовательностей, кодирующих aveC и гомолог aveC, при помощи методов, описанных в публикации Benton and Davis, 1977, Science 196:180 для скрининга библиотек бактериофагов, и в публикации Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965 для скрининга плазмидных библиотек. Молекулы полинуклеотидов, содержащие нуклеотидные последовательности, которые, как известно, включают открытую рамку считывания aveC, имеющуюся, например, в плазмиде pSE186 (АТСС 209604) или в плазмиде pSE119 (описанные в нижеследующем разделе 7), можно использовать в качестве зондов в указанных экспериментах по скринингу. Альтернативно, можно синтезировать олигонуклеотидные зонды, которые соответствуют нуклеотидным последовательностям, выделенным из неполных или полных аминокислотных последовательностей очищенного продукта гомологичного гена AveC.

5.2. Рекомбинантные системы

5.2.1. Клонирующие и экспрессирующие векторы

Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантным клонирующим векторам и экспрессирующим векторам, предназначенным для клонирования или экспрессии молекул полинуклеотидов по настоящему изобретению, которые включают, например, открытую рамку считывания aveC S. avermitilis или открытые рамки считывания любых гомологов aveC. В соответствии с неограничивающим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к плазмиде pSE186 (АТСС 209604), которая содержит полную открытую рамку считывания гена aveC S. avermitilis.

Все нижеследующее описание открытой рамки считывания aveC из S. avermitilis, молекулы полинуклеотида, содержащей открытую рамку считывания aveC из S. avermitilis или ее часть, или продукта гена AveC S. avermitilis относится также к мутированным аллелям aveC, рассматриваемым ниже, за исключением четко оговоренных случаев или случаев, следующих из контекста.

Для конкретного использования в штамме Streptomyces создан целый ряд разных векторов, включающих фаг, мультикопийные плазмиды, ма