Пэгилированный полипептид т1249

Пэгилированный полипептид т1249

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к пэгилированным Т 1249 полипептидным соединениям и к способам получения и применения таких соединений, например, в фармацевтических композициях и терапевтических способах лечения.

Некоторые вирусы, в частности ВИЧ, должны пройти сложный процесс, называемый слиянием, для того чтобы проникнуть в клетку хозяина и репродуцироваться. Во время слияния, наружная мембрана вируса сливается с мембраной клетки хозяина. В случае ВИЧ в ходе репродукции наружная мембрана вируса ВИЧ сливается с мембраной Т-клеток CD4+.

Т1249 является членом нового класса антивирусных средств, которые ингибируют вирус/мембранное слияние. В случае ВИЧ, это приводит к двум ценным эффектам: блокируется репродукция ВИЧ и в результате не происходит гибели Т-клеток CD4+.

Устойчивость вирусов к одобренным современным лекарственным средствам против ВИЧ является существенной проблемой клинической тактики в отношении ВИЧ в настоящее время. У многих больных, начинающих комбинированное антиретровирусное лечение одобренными в настоящее время препаратами, со временем развивается устойчивость к одному или нескольким из этих средств. Однако исследования показывают, что развитие устойчивости к любому из одобренных в настоящее время антиретровирусных классов, возможно, не затрагивает Т1249. (Данные, представленные на 5-ом Международном семинаре по лекарственной устойчивости и стратегии лечения в Скоттсдейле, Аризона, 4-8 июня, 2001 г.)

Анализ действия различных доз Т1249 в клиническом испытании показывает, что суточная доза Т1249, а не предшествующий опыт антиретровирусного лечения, включая мутации, затрагивающие чувствительность ко всем одобренным классам лекарственных препаратов против ВИЧ, является единственной переменной, которая связана со снижением вирусной нагрузки у больных с опытом лечения. Дополнительные исследования показывают, что на активность Т1249 in vitro не влияют мутации, связанные с устойчивостью к ингибиторам обратной транскриптазы и ингибиторам протеазы.

Подобно многим полипептидным терапевтическим средствам Т1249 обычно вводят путем инъекции. Современные протоколы лечения часто включают более одной инъекции в сутки.

Поэтому было бы полезно предусмотреть полипептиды Т1249 и фармацевтические композиции с улучшенными действием и фармакокинетическими характеристиками. Особенно полезно было бы предусмотреть низкие терапевтические дозы Т1249, менее частые введения и/или пролонгированное действие.

Эти и другие задачи настоящего изобретения более детально описываются ниже.

Настоящее изобретение предусматривает соединение формулы

в которой

R₁ обозначает кэп-группу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3, и

NHT1249 представляет собой полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой α-аминогруппе.

В одном из вариантов осуществления изобретения в предлагаемом в нем соединении R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Также предлагается фармацевтическая композиция, включающая в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁, m, n, р и NHT1249 имеют указанные выше значения.

В одном из вариантов осуществления изобретения в соединении предлагаемой фармацевтической композиции R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁, m, n, р и NHT1249 имеют указанные выше значения. Если изобретение относится к «способу ингибирования ВИЧ-инфекции, включающему соединение» подразумевается «применение соединения для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ».

В одном из вариантов осуществления способа ингибирования ВИЧ-инфекции в предлагаемом соединении R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Также предлагается способ получения пэгилированного полипептида Т1249, заключающийся во взаимодействии полипептида Т1249 с альдегидом полиэтиленгликоля формулы

в которой R₁, m, n и р имеют указанные выше значения; с получением соединения формулы (I): в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т1249. Если настоящее изобретение относится к «способу получения», подразумевается «процесс получения».

Фиг.1 показывает сравнение ферментативного гидролиза ПЭГ-модифицированного и немодифицированного Т1249. Показан гидролиз посредством эндопротеиназы Lys-C и последовательное разделение с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой.

Фиг.2 показывает времяпролетную с лазерной десорбцией/ионизацией с матрицы масс-спектрометрию (MALDI TOF) собранной ВЭЖХ фракции ПЭГ-34 (фиг.1). Спектры получены в линейном режиме с транс-3-индолакриловой кислотой в качестве матрицы.

Фиг.3 показывает N-концевое (по Эдману) секвенирование ВЭЖХ фракции ПЭГ-34 (фиг.1).

Фиг.4 показывает профиль концентрация-время мПЭГ_20к-СМАВ-Т1249 у крыс после подкожного введения однократной дозы.

Фиг.5 показывает профиль концентрация-время Т1249 у крыс после подкожного введения однократной дозы.

Фиг.6 показывает влияние различных доз Т1249 и мПЭГ_20к-СМАВ-Т1249 на количество ВИЧ-1 у мышей SCID.

Как указано выше, Т1249 является полипептидом-«ингибитором слияния». Т1249 состоит из 39 аминокислот. Полипептид Т1249 имеет следующую аминокислотную последовательность:

WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF [SEQ.ID.№ 1].

N-концевой (или аминоконцевой) аминокислотой является триптофан (W). С-концевой (или карбоксиконцевой) аминокислотой является фенилаланин (F).

Как описано в табл.1 в патенте US 6348568 (Seq ID №1071), который включается в настоящее изобретение в качестве ссылки, последовательность полипептида Т 1249 можно заблокировать/изменить на одном или обоих из его амино- и карбоксиконцов. Как указано в патенте US 6348568, триптофановый аминоконец можно заблокировать/ изменить путем введения ацильной группы и фенилаланиновый карбоксиконец можно заблокировать/изменить путем введения аминогруппы (последнее приводит к превращению -СООН→-CONH₂).

В контексте настоящего описания под «Т1249» подразумевается пептид [SEQ.ID.№ 1], необязательно заблокированный аминогруппой на фенилаланиновом С-конце. Другими словами, при ссылке на «Т1249» подразумевается, что фенилаланиновый С-конец представляет собой либо -СООН, либо -CONH₂.

Настоящее изобретение предлагает пэгилированные соединения Т 1249 следующей формулы

в которой

R₁ обозначает кэп-группу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3 и

NHT1249 представляет собой полипептид Т 1249, ковалентно связанный по концевой α-аминогруппе.

В контексте настоящего описания термин R₁-«кэп-группа» обозначает любую приемлемую химическую группу, которая в зависимости от того, что предпочтительнее, является обычно нереакционноспособной или обычно способной вступать в реакцию с другими химическими частями. В приведенном выше соединении полиэтиленгликоль ковалентно присоединен к α-аминогруппе полипептида Т 1249. R₁-кэп-группа подбирается так, чтобы разрешить или же предотвратить бифункциональность, например, ковалентное присоединение ко второй представляющей интерес химической части.

В том случае когда кэп-группа является обычно неспособной вступать в реакцию с другими химическими частями, R₁ является относительно инертным и поэтому не будет ковалентно присоединяться к другой химической части. Приемлемые обычно нереакционноспособные кэп-группы R₁ включают: водород, гидроксил, низший алкил, низшую алкоксигруппу, низший циклоалкил, низший алкенил, низший циклоалкенил, арил и гетероарил.

В контексте настоящего описания под термином «низший алкил» подразумевается алкильная группа с прямой или разветвленной цепью, содержащая от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 4, атомов углерода, такая как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, mpem-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и им подобные. «Низший алкил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.

Термин «низшая алкоксигрупа» означает низшую алкильную группу, указанную ранее, которая присоединена посредством атома кислорода; примерами низших алкоксигрупп являются метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа, изопропоксигруппа, н-бутоксигруппа, втор-бутоксигруппа, трет-бутоксигруппа, н-пентоксигруппа и им подобные. «Низшая алкоксигрупа» необязательно замещена одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.

Термин «низший циклоалкил» означает циклоалкильную группу, содержащую от 3 до 7, предпочтительно от 4 до 6 атомов углерода, т.е. циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. «Низший циклоалкил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.

В контексте настоящего описания под термином «низший алкенил» подразумевают алкенильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 5 атомов углерода, например этенил, бутенил, пентенил, гексенил и им подобные. «Низший алкенил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.

Под термином «низший циклоалкенил» подразумевают циклоалкенильную группу, содержащую от 4 до 7 атомов углерода, например циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил и им подобные. «Низший циклоалкенил» необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, низшего алкила, низшей алкоксигруппы, низшего циклоалкила, низшего алкенила, низшего циклоалкенила, арила и гетероарила.

Термин «арил» означает фенильную и нафтильную группу, которая является незамещенной или необязательно моно- или многозамещенной галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, карбоновой кислотой, сложным эфиром карбоновой кислоты, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом, особенно галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом.

Под термином «гетероарил» подразумевают 5- или 6-членную гетероароматическую группу, которая содержит один или несколько гетероатомов, выбранных из N, S и О, и которая может быть сконденсированной с бензольным ядром и/или замещенной тем же способом, как указанный выше «арил».

Предпочтительные обычно нереакционноспособные R₁-кэп-группы включают метоксигруппу, гидроксигруппу или бензилоксигруппу. Особенно предпочтительной R₁-кэп-группой является метоксигруппа. Когда R₁ представляет собой метоксигруппу, пэгилированные полипептидные соединения иногда указываются в настоящем изобретении частично как «мПЭГ-соединения», где «м» обозначает метоксигруппу.

Если R₁-кэп-группа представляет собой группу, обычно вступающую в реакции с другими химическими частями, тогда R₁ является функциональной группой, способной к химическому взаимодействию с некоторыми функциональными группами, такими как амин и/или сульфгидрил в пептиде и/или белке. В таком случае R₁ может быть функциональной группой, которая может легко взаимодействовать с электрофильными или нуклеофильными группами на других молекулах в противоположность тем группам, которым для вступления в реакцию требуются сильные катализаторы или трудновыполнимые условия реакции. Если R₁ является относительно химически активным, альдегид полиэтиленгликоля может ковалентно присоединяться к другой химической части.

Примеры приемлемых обычно химически активных R₁-кэп-групп включают: галоген, эпоксид, имид малеиновой кислоты, ортопиридилдисульфид, тозилат, изоцианат, гидразингидрат, циануровый галид, N-сукцинимидилоксигруппу, сульфо-N-сукцинимидилоксигруппу, 1-бензотриазолилоксигруппу, 1-имидазолилоксигруппу, пара-нитрофенилоксигруппу, и

Термин «галоген» означает фтор, хлор, бром или иод. Предпочтительной обычно химически активной R₁-кэп-группой является . Когда присутствует данная R₁-кэп-группа, следует принимать во внимании, что в соединениях настоящего изобретения первые m, n и/или р могут совпадать или отличаться от вторых m, n и/или р в формуле. Предпочтительнее, однако, когда оба m имеют одно и то же значение, оба n имеют одно и то же значение и оба р имеют одно и то же значение.

В предлагаемом в настоящем изобретении соединении m обозначает число от 1 до 17. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении m обозначает число от 1 до 14. Более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 7, и еще более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 4. Особо предпочтительно, когда m обозначает 1.

В настоящем изобретении в предлагаемом в нем соединении n обозначает число от 10 до 1000. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении n обозначает число от 20 до 1000. Предпочтительно, когда n обозначает число от 50 до 1000, еще более предпочтительно, когда n обозначает число от 75 до 1000. Особо предпочтительно, когда n обозначает число от 100 до 750.

В настоящем изобретении в предлагаемом в нем соединении р обозначает число от 1 до 3. Предпочтительно, когда р обозначает 3.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в предлагаемом в нем соединении р обозначает 3, R₁ представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 2, R₁ представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 1, R₁ представляет собой метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается формула (I), в которой R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750, р обозначает 3 и NHT1249 обозначает полипептит Т1249, ковалентно связанный с концевой α-аминогруппой.

Как отмечалось выше, в пэгилированных соединениях Т1249 настоящего изобретения α-аминогруппа Т1249 ковалентно присоединена к производному полиэтиленгликоля, имеющему особую структуру. Пэгилированные соединения можно получать любым желаемым способом, но обычно их получают путем химического взаимодействия Т1249 с отдельно полученными производными полиэтиленгликоля. Например, полипептид Т 1249 можно пэгилировать, блокируя все остатки лизина и подвергая взаимодействию этот блокированный Т1249 с производным полиэтиленгликоля. Затем блокированные остатки лизина полипептита Т1249 деблокируют, получая пегилированный на конце Т1249.

Полипептид Т1249 можно получать любым приемлемым способом. Например, данные соединения можно синтезировать, применяя традиционные методы твердофазного синтеза Меррифилда, включая твердофазный метод с использованием Вос-аминокислоты (Chem. Soc., 85, 1963, с.2149), с применением ручного или автоматизированного процессов, применяя твердофазный метод с использованием Fmoc-аминокислоты (R.C.Sheppard и др., J.Chem. Soc. Chem. Comm., 1985, сс.165-166), используя Advanced Chemtech, модель 200 фирмы Advanced Chemtech., Луисвилл, США, штат Кентукки, используя Millipore 9050+ фирмы Millipore, Bedford Mass, или другие подходящие приборы.

Т1249 можно получать путем включения кДНК, кодирующей соединения настоящего изобретения, в функционально активные векторы на основе вирусной или кольцевой плазмидной ДНК. Векторы или плазмиды можно использовать для трансфекции или трансформации выбранных микроорганизмов. После трансформации или трансфекции микроорганизмы можно культивировать в условиях, способствующих экспрессии последовательностей трансмиссивной ДНК, и из питательной среды можно осуществлять выделение искомых пептидов (см., например, патент US 5955422, сущность которого включена в настоящее изобретение в качестве ссылки, как если бы цитировали целиком).

Т1249 можно также получать посредством традиционной генной инженерии с использованием хорошо известных в данной области методов. Например, эти методы описаны Sambrook и др. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое издание, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк) или Ausubel и др. в Current Protocols в Molecular Biology, John Wiley и Sons, Нью-Йорк, 1995; обе эти работы включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.

Особый метод получения Т 1249 описан в патенте US 62587872 и в патенте US 6348568, каждый из которых включен в настоящее изобретение в качестве ссылки.

После расщепления и удаления защитной группы можно проводить очистку Т1249 любыми приемлемыми способами. Например, для очистки Т1249 полной длины от его фрагментов можно применять ионообменную, гель-фильтрационную хроматографию и/или колонку с обращенной фазой/систему ВЭЖХ. В том случае когда сначала получают предшественник Т 1249 с блокирующей/защитной группой, присоединенной к N-концу (например, ацильной группой) и/или С-концу (например, аминогруппой), одну или обе из этих групп можно удалить, используя известные приемы.

Последовательность аминокислот в Т 1249 можно подтвердить или идентифицировать, применяя традиционный аминокислотный анализ, а также ручное или автоматизированное расщепление белков по Эдману и определение каждой аминокислоты. Чтобы проконтролировать получение Т 1249 можно также использовать ВЭЖХ-анализ и масс-спектрометрию.

Альдегидные соединения полиэтиленгликоля, которые можно подвергать взаимодействию с Т1249, также можно получать любым желаемым способом. Предпочтительно, однако, когда полиэтиленгликоль получают в соответствии с методами, описанными в заявке на патент US 60/398196, зарегистрированной 24 июля 2002 г., озаглавленной «Альдегиды полиэтиленгликоля», сущность которой включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.

Обычно для пэгилирования Т 1249 применяют альдегид полиэтиленгликоля формулы

в которой R₁, m, n и р имеют указанные выше значения. Альдегид полиэтиленгликоля, применяемый для пэгилирования Т1249, можно получать любыми приемлемыми способами. Один из предпочтительных альдегидов полиэтиленгликоля получают следующим способом

Схема реакции для получения мПЭГ_10к-бутаноальдегида

Варьирующие по размеру альдегиды полиэтиленгликоля (например, различающиеся значениями n) можно получать по следующей вышеуказанной общей схеме реакций.

Пэгилированные соединения Т 1249 настоящего изобретения можно получать любыми приемлемыми способами. Однако более предпочтительным по настоящему изобретению является способ пэгилирования полипептида Т1249, заключающийся в химическом взаимодействии полипептида Т1249, NHT1249, с альдегидом полиэтиленгликоля формулы

в которой R₁, m, n и р имеют указанные выше значения;

с образованием соединения формулы:

в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т1249.

Пэгилированный Т1249 готовят добавлением Т1249 и реагента ПЭГ в диапазоне молярных соотношений от 1:1 до 1:100. Т 1249 имеет свободную α-аминогруппу (удалена одна из ацильных групп) и либо свободную карбоксигруппу, либо амино-защищенную карбоксигруппу, как обсуждалось выше. Реакционную смесь помещают в боратный или фосфатный буфер при комнатной температуре или при температуре 4°С на приблизительно 5-24 ч при диапазоне рН от 5,5 до 7,4. Молярное отношение реагента ПЭГ к пептиду/белкам составляет от 1:1 до 100:1. Концентрация пептида/белков составляет от 1 до 10 мг/мл. Концентрация буфера обычно составляет от 10 до 500 мМ.

Для очистки Т1249 берут реакционную смесь пэгилированных Т1249 и разбавляют ее уравновешивающим буфером (20 мМ Трис, рН 7,5). Затем полученную смесь наносят на колонку с Q-сефарозой. После нанесения смеси на QA-колонку ее промывают уравновешивающим буфером, элюируют 75 мМ NaCl; элюируют 200 мМ NaCl; элюируют 1 M NaCl; и регенерируют 1М НОАС +1М NaCl и 0,5М NaOH.

Используя ВЭЖХ с обращенной фазой, можно без труда отделить и выделить N-концевой монопэгилированный продукт из смеси с другими побочными продуктами. Например, на хроматограмме пэгилированного Т 1249 могут формироваться несколько пиков, каждый с особым временем удерживания. Первый пик может представлять не прореагировавший пептид, 10,7 мин, второй пик может представлять монопэгилированный пептид, 17,6 мин, за которым следует дипэгилированный пептид, 19 мин. Каждый собранный продукт был подтвержден время-пролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией с матрицы (MALDI TOF).

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в предлагаемых в нем пэгилированных полипептидах Т 1249 р обозначает 3, R₁ обозначает метил, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 2, R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750; или р обозначает 1, R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.

В настоящем изобретении также предлагается пэгилированный полипептид Т 1249 следующей формулы

в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т 1249, ковалентно присоединенный к концевой α-аминогруппе. В одном из вариантов осуществления изобретения в формуле предлагаемого соединения n обозначает число, близкое 225, например 227. В другом варианте осуществления изобретения в формуле предлагаемого соединения n обозначает примерно 450.

Этот пэгилированный полипептид Т1249 можно получать любым желаемым способом, предпочтительно его получают способом, описанным в примере 7.

Фармацевтические композиции изобретения включают в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁, m, n, p и NHT1249 имеют указанные выше значения.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения, включающие пэгилированные полипептиды Т1249 или их соли, могут быть приготовлены любым желаемым способом, например путем традиционных процессов смешивания, инкапсулирования, растворения, гранулирования, эмульгирования, улавливания или лиофилизации. Эти фармацевтические препараты могут быть приготовлены в смеси с терапевтически неактивными, неорганическими или органическими эксципиентами или носителями. Приемлемые для инъекции эксципиенты включают воду, спирты, высокомолекулярные спирты, глицерин, растительные масла, фосфолипиды и поверхностно-активные вещества.

Фармацевтические препараты могут также содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, подсластители, красители, вкусовые вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, вещества для покрытия или антиоксиданты. Они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества, включая дополнительные действующие вещества.

Составы, пригодные для введения путем инъекции (включая внутрибрюшинную, внутримышечную, подкожную, внутривенную инъекции, или непрерывное вливание), могут быть традиционно представлены в форме разовой дозы и могут быть приготовлены традиционными фармацевтическими методами. Такие методы включают стадию внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т1249 и фармацевтических носителя (носителей) или эксципиента (эксципиентов). Обычно композиции готовят путем равномерного и однородного внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т 1249 с жидкими носителями. Составы, приемлемые для введения путем инъекции, включают: водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, придающие композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента; водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества и загустители. Составы могут быть представлены в контейнерах, рассчитанных на единственную дозу или на много доз, например, в запаянных ампулах и флаконах, и их можно хранить в лиофилизированном состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием.

Предпочтительными составами с разовыми дозировками являются те, которые содержат суточную дозу, суточную субдозу, недельную дозу, недельную субдозу, как изложено в настоящем описании выше, или адекватную часть дозы, вводимого ингредиента.

Предпочтительно, когда пэгилированный полипептид Т1249 представлен в форме разовой дозы. В контексте настоящего описания под выражением «форма разовой дозировки» подразумевается, что количество, соответствующее разовой дозе пэгилированного полипептида Т1249, представлено в предварительно рассчитанной и расфасованной форме. Этим обеспечивается удобная подготовка пэгилированного полипептида Т1249 для введения, и даже учитывается возможность самовведения препарата больным. Очевидно, что количество разовой дозировки будет зависеть от количества пэгилированного полипептида Т1249, которое необходимо ввести, и частоты введения.

Пэгилированный полипептид Т1249 может быть также предусмотрен в форме лиофилизированного порошка в количестве разовой дозы, пригодного для разбавления фармацевтически приемлемым эксципиентом непосредственно перед введением.

Одна из фармацевтических композиций изобретения включает в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Другая фармацевтическая композиция изобретения является фармацевтической композицией, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 100 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой α-аминогруппе. В одном из вариантов осуществления изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227. В еще одном варианте осуществления изобретения n обозначает число, близкое 450.

Настоящее изобретение также предлагает способы ингибирования ВИЧ инфекции, заключающиеся во введении больному фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁, m, n, p и NHT1249 имеют указанные выше значения.

Пэгилированные полипептиды Т1249 обычно вводят способом, которым в настоящее время вводят (непэгилированные) полипептиды Т1249. Однако допустимы модификации, позволяющие использовать преимущества улучшенных фармакокинетических показателей пэгилированных полипептидов Т1249.

В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить любым приемлемым методом и путем. В предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т1249 вводят в форме инъекционного раствора или суспензии. Предпочтительно, когда инъецируемый раствор или суспензию вводят путем подкожной инъекции или внутривенно.

В другом предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т1249 вводят посредством трансдермальной системы доставки, например трансдермальной аппликации.

В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить в любых приемлемых дозах и режимах. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить в любой форме и любым путем, по желанию. Обычно, однако, пэгилированные полипептиды Т1249 настоящего изобретения вводят парентерально, например в форме инъекционных растворов.

Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетентности специалистов в данной области, и терапевтически эффективное количество или доза пэгилированного полипептида Т1249 в соответствии с настоящим изобретением может варьировать и подбирается на основании индивидуальных потребностей в каждом конкретном случае. В общем в случае введения путем инъекции взрослым людям весом около 70 кг должна быть приемлемой суточная доза от приблизительно 5 мг до приблизительно 300 мг, предпочтительно от приблизительно 50 мг до приблизительно 200 мг, хотя верхний предел по показанию можно превышать. Дозировку можно вводить в качестве однократной дозы, разделенной общей дозы, или непрерывного вливания.

Фармацевтическую композицию можно вводить по любой пригодной схеме дозирования. Предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в сутки, два раза в сутки, однократно через сутки, один раз в неделю или два раза в неделю. Более предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю.

Предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 300 мг до приблизительно 1500 мг. Более предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 400 мг до приблизительно 1000 мг. Особо предпочтительно, когда фармацевтическую композицию вводят один раз в неделю в дозе от приблизительно 100 мг до приблизительно 200 мг.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (I), в которой R₁ обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

В рамках изобретения также рассматривается способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT1249 обозначает полипептид Т1249, ковалентно присоединенный к концевой α-аминогруппе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227. В другом варианте осуществления изобретения n обозначает число, близкое 450.

Для дополнительной иллюстрации соединений, композиций и способов настоящего изобретения предлагаются следующие примеры. Эти примеры служат только в качестве иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения рамок настоящего изобретения.

Пример 1

Приготовление мПЭГ_10к-бутаноальдегида

мПЭГ с молекулярным весом 10000 (30,0 г, 3 ммоль) в 240 мл толуола азеотропно сушат нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч с удалением 120 мл толуола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, затем к раствору ПЭГ добавляют трет-бутоксид калия (0,68 г, 6 ммоль) в 20 мл абсолютного трет-бутанола и 20 мл толуола. Полученную смесь перемешивают в течение двух ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. К реакционной смеси с помощью шприца добавляют трет-бутилбромацетат (1,00 мл, 6,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор конденсируют роторным упариванием. Осаждают добавлением диэтилового простого эфира. Осажденный продукт, мПЭГ_10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир, фильтруют и сушат в вакууме. Выход: 28 г. ЯМР (d₆-ДМСО):1,40 част./млн (t, 9H, -СН₃); 3,21 част./млн (s, -ОСН₃); 3,50 част./млн (s, -О-СН₂СН₂-О-); 3,96 част./млн (s, 2H, -О-CH₂-СОО-).

Затем мПЭГ_10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир (26,5 г) растворяют в 350 мл 1н. гидроксида натрия и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 2,5, добавляя 6н. соляную кислоту, и смесь экстрагируют дихлорметаном. Высушивают органический слой над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ_10к-карбоксиметиловую кислоту собирают фильтрацией и сушат в вакууме. Выход: 24 г. ЯМР (d₆-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН₃); 3,5 част./млн (s, -О-CH₂СН₂-О-); 3,99 част./млн (s, 2H, -O-СН₂-СООН).

После этого мПЭГ_10к-карбоксиметиловую кислоту (6 г, 0,6 ммоль) растворяют в безводном дихлорметане (30 мл) с последующим добавлением диэтилацеталя 4-аминобутиральдегида (140 мл, 0,9 ммоль), 1-гидроксибензотриазола (80 мг, 0,6 ммоль) и дициклогексилкарбодиимида (160 мг, 0,78 ммолей). Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь фильтруют, концентрируют и осаждают смесью 2-пропанола и диэтилового простого эфира (1:1). Продукт мПЭГ_10к-бутаноацеталь сушат в вакууме в течение ночи. Выход:

5,4 г. ЯМР (d₆-ДМСО): 1,07-1,12 част./млн (t, 6H, (-O-СН₂-СН₃)₂); 1,46 част./млн (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 3,08-3,11 част./млн (q, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 3,21 част./млн (s, -ОСН₃); 3,5 част./млн (s, -O-CH₂CH₂-O-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH₂-CO-NH-); 4,44 част./млн (t, 1H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 7,67 част./млн (-NH-).

Затем мПЭГ_10к-бутаноацеталь (2 г, 0,2 ммоль) растворяют в 20 мл 80% CF₃СООН и перемешивают раствор в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 6,0, добавляя 1н. раствор NaOH, добавляют хлорид натрия (10 мас.%) и затем доводят рН раствора до 7,0 добавлением 1н. NaOH. Смесь экстрагируют дихлорметаном. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ_10к-бутаноальдегид собирают фильтрацией и сушат в вакууме. Выход: 1,7 г. ЯМР (d₆-ДМСО): 3,21 част./млн (s, -ОСН₃); 3,5 част./млн (s, -O-СН₂СН₂-O-); 3,85 част./млн (s, 2H, -O-CH₂-CO-NH-); 7,67 част./млн (-NH-); 9,66 част./млн (-СНО-).

Пример 2

Пэгилирование Т 1249 мПЭГ_10к-бутаноальдегидом

Бутаноальдегид ПЭГ 10кДа (мПЭГ_10к-СМАВ), приготовленный в соответствии с примером 1, добавляют к 20 мг Т 1249 (93,7% чистого вещества) в 1,0 мл буфера (50 мМ фосфат калия, рН 6,5) в молярном отношении 5 молекул реагента на одну молекулу Т1249. Полипептид Т1249 деацилируют по α-аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH₂. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) 0,5 М раствора цианоборогидрида натрия в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Пэгилированный Т1249 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA). Для разделения пэгилированного Т 1249 и немодифицированного Т 1249 используют ступенчатый градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 65 мМ до 1 М NaCl в 20 мМ трис, рН 7,5.

Пример 3

Приготовление мПЭГ_20к-бутаноальдегида

м-ПЭГ с молекулярным весом 20000 (60,0 г, 3 ммоль) в 800 мл толуола азеотропно сушат нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч с удалением 200 мл толуола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, затем к раствору ПЭГ добавляют трет-бутоксид калия (0,68 г, 6 ммоль) в 20 мл абсолютного трет-бутанола и 20 мл толуола. Полученную смесь перемешивают в течение двух ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. К реакционной смеси с помощью шприц-пипетки добавляют трет-бутилбром ацетат (1,00 мл, 6,75 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор конденсируют роторным упариванием. Осаждают добавлением диэтилового простого эфира. Осажденный продукт, мПЭГ_20к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир, фильтруют и сушат под вакуумом. Выход: 56 г. ЯМР (d₆-ДМСО): 1,42 част./млн (t, 9H, -СН₃); 3,21 част./млн (s, -ОСН₃); 3,50 част./млн (s, -О-СН₂СН₂-О-); 3,98 част./млн (s, 2H, -O-CH₂-COO-).

Затем мПЭГ_20к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир (28 г) растворяют в 750 мл 1н. гидроксида натрия, и раствор перемешивают в течение ночи при комн