Производные 2-аминоникотинамида и их применение в качестве ингибиторов vegf-рецептора тирозинкиназы

Производные 2-аминоникотинамида и их применение в качестве ингибиторов vegf-рецептора тирозинкиназы

Реферат

Изобретение относится к применению производных 2-аминоникотинамида, отдельно или в сочетании с одним или более других фармацевтически активных соединений, для получения фармацевтической композиции для использования в терапии заболевания, чувствительного к ингибированию активности VEGF-рецепторной тирозинкиназы, прежде всего опухолевого заболевания, ретинопатии или возрастной дегенерации желтого пятна; к способу лечения такого заболевания у млекопитающих, прежде всего человека; к новым производным 2-аминоникотинамида и способам их получения.

Известен ряд заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза, например заболевания, вызванные неоваскуляризацией глаз, такие как ретинопатии (включая диабетическую ретинопатию), возрастная дегенерация желтого пятна, псориаз, гемангиобластома, гемангиома, эндометриоз и, прежде всего, опухолевые заболевания, например так называемые солидные опухоли и жидкие опухоли (такие, как лейкоз).

Согласно последним данным центральное место в системе регуляции роста и дифференциации сосудистой системы и ее компонентов во время эмбрионального развития и нормального роста при разнообразных патологических аномалиях и заболеваниях занимает ангиогенный фактор, известный, как «эндотелиальный фактор роста сосудов» (VGEF, первоначально называвшийся «фактор проницаемости сосудов», VPF), вместе с его клеточными рецепторами (см. обзор Breier G. и др.. Trends in Cell Biology, 6, 454-456 (1996), и другие документы, цитированные в описании заявки).

VEGF является димерным, связанным дисульфидными связями гликопротеином с ММ 46 кДа, продуцируемым линиями нормальных и опухолевых клеток. Он является специфичным митогеном эндотелиальных клеток, обладает ангиогенной активностью в системах тестирования in vivo (например, на роговице кролика), обладает хемотаксическими свойствами в отношении эндотелиальных клеток и моноцитов и индуцирует образование эндотелиальными клетками активаторов плазминогена, которые затем принимают участие в протеолитической деградации межклеточного матрикса при образовании капилляров. Известен ряд изоформ VEGF, которые обладают аналогичной биологической активностью, но отличаются по типу секретирующих их клеток и гепарин-связывающей активностью. Кроме того, известны другие члены семейства VEGF, такие как "плацентарный фактор роста" (PLGF) и VEGF-С.

Рецепторы VEGF являются трансмембранными рецепторными тирозинкиназами. Они характеризуются наличием внеклеточного домена, содержащего семь иммуноглобулин подобных доменов, и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью. Известны различные типы рецептора VEGF, например VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3.

Для многих видов опухолей человека, прежде всего глиом и карцином, характерен высокий уровень экспрессии VEGF и его рецепторов. Это привело к предположению, что VEGF, высвобождаемый опухолевыми клетками, может стимулировать рост кровеносных капилляров и пролиферацию опухолевого эндотелия по механизму паракринной регуляции и, таким образом, за счет улучшенного притока крови, ускорять рост опухоли. Усиление экспрессии VEGF может объяснить появление отека мозга у пациентов с глиомой. Прямое доказательство роли VEGF как фактора опухолевого ангиогенеза in vivo получено в работах по ингибированию экспрессии или активности VEGF. Это достигается благодаря использованию антител, ингибирующих активность VEGF, мутантов, доминантно-негативных по VEGFR-2, которые ингибируют передачу сигнала, или антисмысловых VEGF-PHK. Все подходы приводят к уменьшению роста клеточных линий глиомы или других линий опухолевых клеток в экспериментах in vivo в результате подавления опухолевого ангиогенеза.

Ангиогенез считается безусловной предпосылкой таких опухолей, которые в росте превышают максимальный диаметр, равный приблизительно 1-2 мм, поскольку до этого предельного размера кислород и питательные вещества могут поступать в опухолевые клетки за счет диффузии. Таким образом, каждая опухоль, независимо от ее происхождения и причины, после достижения определенных размеров зависит от ангиогенеза, необходимого для ее дальнейшего роста.

При воздействии ингибиторов ангиогенеза на опухоли большое значение имеют три основных механизма: 1) ингибирование роста сосудов, прежде всего капилляров, в направлении бессосудистых покоящихся опухолей, что предотвращает общий рост опухоли благодаря равновесию между апоптозом и пролиферацией, 2) предотвращение миграции опухолевых клеток благодаря отсутствию кровотока в направлении опухоли и обратно, и 3) ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток и, таким образом, исключение паракринного ростстимулирующего действия на окружающую ткань эндотелиальных клеток, обычно прилегающих к сосудам.

Неожиданно было установлено, что производные никотинамида формулы I, описанной ниже, являются новым классом соединений, которые обладают полезными фармакологическими свойствами и ингибируют, например, активность VEGF-рецепторной тирозинкиназы, рост опухолей и VEGF-зависимую клеточную пролиферацию, а также прочие выше- и нижеописанные заболевания.

Соединения формулы I обеспечивают неожиданный новый терапевтический подход, например, прежде всего, к лечению заболеваний, при терапии которых, а также при профилактике которых, ингибирование ангиогенеза и/или VEGF-рецепторной тирозинкиназы оказывает лечебное действие.

Изобретение относится к применению соединения формулы I

где

n равно от 1 до 6 включительно;

W означает О или S;

R₁ и R₃ независимо друг от друга каждый означает водород, (низш.)алкил или (низш.)ацил;

R₂ означает группу циклоалкил, группу арил или моно- или бициклическую группу гетероарил, содержащую один или более атомов азота в цикле и 0, 1 или 2 гетероатома, независимо друг от друга выбранные из группы, включающей кислород и серу, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

R и R' независимо друг от друга каждый означает водород или (низш.)алкил;

Х означает группу арил или моно- или бициклическую группу гетероарил, содержащую один или более атомов азота в цикле и 0, 1 или 2 гетероатома, независимо друг от друга выбранные из группы, включающей кислород и серу, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

и его N-оксида или возможного таутомера,

или фармацевтически приемлемой соли такого соединения для получения фармацевтической композиции для применения в терапии заболевания, которое является чувствительным к ингибированию активности VEGF-рецепторной тирозинкиназы.

Если не указано иное, общие термины, используемые выше и ниже по тексту, предпочтительно имеют следующие значения.

Приставка «низш.» означает радикал, содержащий от 1 до максимум 7 включительно, прежде всего до максимум 4 включительно, атомов углерода, причем упомянутые радикалы являются линейными или разветвленными с одним или несколькими разветвлениями.

Если для обозначения соединений, солей и т.п. используется множественное число, следует полагать, что оно также означает одно соединение, соль и т.п.

Любые асимметричные атомы углерода (например, в соединении формулы I, где R или R' означает (низш.)алкил) могут быть представлены в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации. Таким образом, соединения могут быть представлены в виде смесей изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно в виде диастереомеров, не содержащих энантиомеров.

Кроме того, изобретение относится к возможным таутомерам соединений формулы I.

Х предпочтительно означает пиридил или фенил, наиболее предпочтительно 3- или 4-пиридил.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения Х является замещенным группой (низш.)алкокси.

В другом преимущественно предпочтительном варианте изобретения Х означает подструктуру X'

где

Rx означает водород или (низш.)алкил.

R₂ предпочтительно означает фенил, моно- или дизамещенный группой ряда (низш.)алкил, (низш.)алкинил, галоген, предпочтительно фтор и трифторметил; или циклоалкил, предпочтительно циклогексил, замещенный (низш.)алкилом, предпочтительно трет-бутилом.

R₃ предпочтительно означает водород.

W предпочтительно означает О.

Целое число n предпочтительно означает 1 или 2, более предпочтительно 1.

(Низш.)алкил предпочтительно означает алкил, содержащий от включительно 1 до включительно 7, предпочтительно от включительно 1 до включительно 5, атомов углерода и который является линейным или разветвленным; предпочтительно (низш.)алкил означает пентил, такой как н-пентил, бутил, такой как н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пропил, такой как н-пропил или изопропил, этил или метил. Предпочтительно (низш.)алкил означает метил, пропил или трет-бутил.

(Низш.)ацил предпочтительно означает формил или ацетил.

"Арил" означает ароматический радикал, связанный с молекулой химической связью через углеродный атом ароматического кольца. В предпочтительном варианте осуществления изобретения арил означает ароматический радикал, содержащий от 6 до 14 атомов углерода, прежде всего фенил, нафтил, тетрагидронафтил, флуоренил или фенантренил, причем указанный радикал является незамещенным или замещенным одним или более, предпочтительно вплоть до трех, прежде всего одним или двумя заместителями, прежде всего, выбранными из ряда амино, моно- или дизамещенный амино, галоген, (низш.)алкил, замещенный алкил, (низш.)алкенил, (низш.)алкинил, (низш.)алканоил, гидрокси, простой или сложный эфир гидроксигруппы, нитро, циано, карбокси, этерифицированный карбокси, алканоил, бензоил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амидино, гуанидино, уреидо, меркапто, сульфо, (низш.)алкилтио, фенил, фенокси, фенилтио, фенил(низш.)алкилтио, алкилфенилтио, (низш.)алкилсульфинил, фенилсульфинил, фенил(низш.)алкилсульфинил, алкилфенилсульфинил, (низш.)алкансульфонил, фенилсульфонил, фенил(низш.)алкилсульфонил, алкилфенилсульфонил, галоген(низш.)алкилмеркапто, галоген(низш.)алкилсульфонил, такой как, прежде всего, трифторметансульфонил, дигидроксибора(-В(ОН)₂), гетероциклил и (низш.)алкилендиокси, связанный с соседними атомами углерода в цикле, такой как метилендиокси. Более предпочтительно арил означает фенил или нафтил, который в каждом случае является незамещенным или независимо замещенным одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей галоген, прежде всего фтор, хлор или бром; гидрокси; гидрокси, этерифицированный (низш.)алкилом, например метилом, или галоген(низш.)алкилом, например трифторметилом; (низш.)алкил, например метил или пропил; (низш.)алкенил, такой как 1-пропинил; этерифицированная карбоксигруппа, прежде всего (низш.)алкоксикарбонил, например метоксикарбонил, н-пропоксикарбонил или изопропоксикарбонил; N-монозамещенный карбамоил, например карбамоил, монозамещенный (низш.)алкилом, например метилом, н-пропилом или изопропилом; замещенный алкил, прежде всего (низш.)алкил, например метил или этил, замещенный (низш.)алкоксикарбонилом, например метоксикарбонилом или этоксикарбонилом; и галоген(низш.)алкил, наиболее предпочтительно трифторметил.

В качестве арила в форме фенила, который является замещенным группой (низш.)алкилендиокси, связанной с двумя соседними атомами углерода, такой как метилендиокси, предпочтителен 3,4-метилендиоксифенил.

Группа циклоалкил предпочтительно означает циклопентил, циклогексил или циклогептил, причем группа циклоалкил может быть незамещенной или замещенной одним или более, прежде всего, одним или двумя заместителями, выбранными из группы, указанной выше, как заместители арила, наиболее предпочтительно (низш.)алкилом, таким как метил, (низш.)алкокси, таким как метокси или этокси, или группой гидрокси.

Замещенный алкил означает алкил, имеющий значения, указанные в предыдущем абзаце, прежде всего (низш.)алкил, предпочтительно метил; и который может содержать один или более, прежде всего вплоть до 3, заместителей, главным образом, из группы, выбранной из ряда галоген, прежде всего фтор, амино, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, N-(низш.)алканоиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил и фенил(низш.)алкоксикарбонил. Прежде всего, предпочтителен трифторметил.

Моно- или дизамещенный амино означает, прежде всего, аминогруппу, замещенную одним или двумя радикалами, независимо друг от друга выбранными из ряда (низш.)алкил, такой как метил; гидрокси(низш.)алкил, такой как 2-гидроксиэтил; фенил(низш.)алкил; (низш.)алканоил, такой как ацетил; бензоил; замещенный бензоил, в котором радикал фенил, прежде всего, является замещенным одним или более, предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из ряда нитро, амино, галоген, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил и карбамоил; и фенил(низш.)алкоксикарбонил, в котором фенильный радикал является незамещенным или, прежде всего, замещенным одним или более, предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из ряда нитро, амино, галоген, N-(низш.)алкиламино N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил и карбамоил; и предпочтительно означает N-(низш.)алкиламино, такой как N-метиламино, гидрокси(низш.)алкиламино, такой как 2-гидроксиэтиламино, фенил(низш.)алкиламино, такой как бензиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, N-фенил(низш.)алкил-N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкилфениламино, (низш.)алканоиламино, такой как ацетиламино, или заместитель, выбранный из группы, включающей бензоиламино и фенил(низш.)алкоксикарбониламино, в котором фенильный радикал в каждом случае является незамещенным или, прежде всего, замещенным, группой нитро или амино, или, кроме того, группой галоген, амино, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, карбамоил или аминокарбониламино.

Галоген означает, прежде всего, фтор, хлор, бром или иод, прежде всего фтор, хлор или бром.

Этерифицированный гидрокси (сложноэфирная группа) означает, прежде всего, С₈-С₂₀ алкилокси, такой, как н-децилокси, (низш.)алкокси (предпочтительно), такой как метокси, этокси, изопропилокси или н-пентилокси, фенил(низш.)алкокси, такой как бензилокси, или, кроме того, фенилокси, или в другом варианте, или в дополнение к указанной выше группе С₈-С₂₀ алкилокси, такой как н-децилокси, галоген(низш.)алкокси, такой как трифторметилокси или 1,1,2,2-тетрафторэтокси.

Этерифицированный гидрокси (группа простого эфира) означает, прежде всего, (низш.)алканоилокси, бензоилокси, (низш.)алкоксикарбонилокси, такой как трет-бутоксикарбонилокси, или фенил(низш)алкоксикарбонилокси, такой как бензилоксикарбонилокси.

Этерифицированный карбокси означает, прежде всего, (низш.)алкоксикарбонил, такой как трет-бутоксикарбонил, изопропоксикарбонил, метоксикарбонил или этоксикарбонил, фенил(низш.)алкоксикарбонил или фенилоксикарбонил.

Алканоил главным образом означает алкилкарбонил, прежде всего (низш.)алканоил, например ацетил.

N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил означает, прежде всего, концевой атом азота, замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из ряда (низш.)алкил, фенил(низш.)алкил и гидрокси(низш.)алкил.

Алкилфенилтио означает, прежде всего, (низш.)алкилфенилтио.

Алкилфенилсульфонил означает, прежде всего, (низш.)алкилфенилсульфонил.

Алкилфенилсульфинил означает, прежде всего, (низш.)алкилфенилсульфинил.

Моно- или бициклическая гетероарильная группа, содержащая один или более атомов азота в цикле и 0, 1 или 2 гетероатома, независимо друг от друга выбранные из группы, включающей кислород и серу, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными, означает гетероциклический остаток, который является ненасыщенным в цикле, связывающем гетероарильный радикал с остатком молекулы формулы I, и предпочтительно означает цикл, где по меньшей мере в связывающем цикле, и кроме того, необязательно в любом конденсированном цикле, один или более, предпочтительно от 1 до 4, наиболее предпочтительно 1 или 2, атома углерода, каждый заменен гетероатомом, выбранным из группы, включающей азот, кислород и серу; где связывающий цикл предпочтительно содержит от 5 до 12, более предпочтительно от 5 до 7, атомов в цикле; и может быть незамещенной или замещенной одним или более, предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, указанной выше в качестве заместителей у группы арил, наиболее предпочтительно (низш.)алкилом, таким как метил, (низш.)алкокси, таким как метокси или этокси, или гидрокси; предпочтительно моно- или бициклическую гетероарильную группу выбирают из ряда 2Н-пирролил, пирролил, имидазолил, бензимидазолил, пиразолил, индазолил, пуринил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, 4Н-хинолизинил, изохинолил, хинолил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалил, хиназолинил, хинолинил, птеридинил, индолизинил, 2Н-индолил, индолил, изоиндолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, фуразанил и бенз[d]пиразол. Более предпочтительно моно- или бициклическую гетероарильную группу выбирают из группы, включающей пирролил, бензимидазолил, такой как 1-бензимидазолил, индазолил, прежде всего 5-индазолил, пиридил, прежде всего 2-, 3- или 4-пиридил, изохинолинил, прежде всего 3-изохинолинил, хинолинил, прежде всего 4-хинолинил, индолил, прежде всего 3-индолил, тиазолил или бенз[d] пиразол. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения радикал пиридил является замещенным группой гидрокси в орто положении к атому азота и, следовательно, существует по меньшей мере частично в форме соответствующего таутомера, который означает пиридин-(1Н)-2-он.

Гетероциклил предпочтительно означает пяти- или шестичленную гетероциклическую систему с 1 или 2 гетроатомами, выбранными из группы, включающей азот, кислород и серу, причем система может быть ненасыщенной или полностью или частично насыщенной и является незамещенной или замещенной, прежде всего, (низш.)алкилом, таким как метил; предпочтителен радикал, выбранный из ряда 2-метилпиримидин-4-ил, оксазол-5-ил, 2-метил-1,3-диоксолан-2-ил, 1H-пиразол-3-ил и 1-метилпиразол-3-ил.

Соли, прежде всего, означают фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I.

Такие соли образуются, например, в виде кислотно-аддитивных солей, предпочтительно, при взаимодействии соединений формулы I, имеющих основной атом азота, с органическими или неорганическими кислотами, прежде всего, в виде фармацевтически приемлемых солей. Соответствующими неорганическими кислотами являются, например, галогенсодержащие кислоты, такие как, хлористоводородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Приемлемые органические кислоты включают, например, карбоновые, фосфоновые, сульфоновые или сульфаминовые кислоты, например уксусную кислоту, пропионовую кислоту, октановую кислоту, декановую кислоту, додекановую кислоту, гликолевую кислоту, молочную кислоту, фумаровую кислоту, янтарную кислоту, адипиновую кислоту, пимелиновую кислоту, пробковую кислоту, азелаиновую кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, аминокислоты, такие как глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, малеиновую кислоту, гидроксималеиновую кислоту, метилмалеиновую кислоту, циклогексанкарбоновую кислоту, адамантанкарбоновую кислоту, бензойную кислоту, салициловую кислоту, 4-аминосалициловую кислоту, фталевую кислоту, фенилуксусную кислоту, миндальную кислоту, коричную кислоту, метан- или этансульфоновую кислоту, 2-гидроксиэтансульфоновую кислоту, этан-1,2-дисульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, 1,5-нафталиндисульфоновую кислоту, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновую кислоту, метилсерную кислоту, этилсерную кислоту, додецилсерную кислоту, N-циклогексилсульфаминовую кислоту, N-метил-, N-этил или N-пропилсульфаминовую кислоту, или другие органически протонные кислоты, такие как аскорбиновую кислоту.

При наличии в молекуле отрицательно заряженных групп, таких как карбокси или сульфо, соединения могут образовывать соли с основаниями, например соли металлов или аммониевые соли, такие как соли щелочных или щелочноземельных металлов, например соли натрия, калия, магния или кальция, или аммониевые соли с аммиаком или соответствующими органическими аминами, такими как четвертичные моноамины, например триэтиламином или три(2-гидроксиэтил)амином, или гетероциклическими основаниями, например N-этилпиперидином или N,N'-диметилпиперазином.

Если в молекуле присутствуют основная и кислотная группа, то соединение формулы I может также образовывать внутренние соли.

С целью выделения или очистки возможно также использование фармацевтически неприемлемых солей, например пикратов или перхлоратов. Для терапевтического применения используются только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (которые применимы в форме лекарственных препаратов), и, следовательно, эти соли и соединения являются предпочтительными.

Ввиду близкого сходства между новыми соединениями в свободной форме и в форме их солей, включая те соли, которые могут быть использованы в качестве промежуточных соединений, например, при очистке или идентификации новых соединений, любые ссылки на свободные соединения выше и далее по тексту следует воспринимать как относящиеся также к соответствующим солям, как соответствующие и целесообразные.

Соединения формулы I и их N-оксиды обладают ценными фармакологическими свойствами, как описано выше и далее по тексту.

Эффективность соединений по изобретению в качестве ингибиторов активности VEGF-рецепторной тирозинкиназы может быть продемонстрирована следующим образом.

Определение ингибирующей активности соединений в отношении VEGF-рецепторной тирозинкиназы. Анализ проводят с использованием VEGF-рецепторной тирозинкиназы Flt-1. Ниже дается подробное описание методики. 30 мкл раствора киназы (10 нг домена киназы Flt-1, см. статью Shibuya и др., Oncogen, 5, 519-524 (1990)) в буферном растворе, содержащем 20 мМ трис•HCl, рН 7,5, 3 мМ дихлорид марганца (MnCl₂), 3 мМ хлорид магния (MgCl₂), 10 мкМ ванадат натрия, 0,25 мг/мл полиэтиленгликоль (PEG) 20000, 1 мМ дитиотреит и 3 мкг/мкл поли(глу, тир) 4:1 (фирма Sigma, Buchs, Швейцария), 8 мкМ [³³P]АТФ (0,2 мкКи), 1% диметилсульфоксид, и от 0 до 100 мкМ анализируемого соединения, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего реакцию останавливают добавлением 10 мкл 0,25 М раствора этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) с рН 7. Затем многоканальной пипеткой-дозатором (фирма Lab Systems, США) отбирают аликвотные части объемом 20 мкл, которые через микротитрационный фильтр Gibco-BRL наносят на поливинилдифторидную мембрану Immobilon P (фирма Millipor, США) и подключают к вакуумной линии. После полного удаления жидкости мембрану четырежды последовательно промывают в бане, содержащей 0,5% раствор фосфорной кислоты (Н₃PO₄), и однократно промывают этанолом, инкубируя в каждом случае при встряхивании в течение 10 мин, а затем помещают в счетчик импульсов TopCount Manifold (фирма Hewlett Packard) и после добавления 10 мкл сцинтилляционной жидкости Microscint (для счета β-импульсов) измеряют радиоактивность. Значения IC₅₀ рассчитывают с использованием линейного регрессионного анализа в виде процента ингибирования каждым соединением при трех концентрациях (как правило, 0,01, 0,1 и 1 мкмоль). IC₅₀ соединений формулы I имеют значения в диапазоне от 1 до 1000 нМ, предпочтительно в диапазоне от 1 до 100 нМ.

Противоопухолевое действие соединений по изобретению может быть продемонстрировано in vivo по следующей методике.

Активность in vivo на модели голых ксенотрансплантантных мышей. Самок голых мышей линии BALB/c (8-12 недель, фирма Novartis Animal Farm, Sisseln, Швейцария) содержат в стерильных условиях при обеспечении водой и кормом по потребности. Опухоли индуцируют либо подкожной инъекцией мышам опухолевых клеток (например, клеточной линии DU 145 карциномы простаты (АТСС № НТВ 81; см. Cancer Res., 37, 4049-4058 (1978)) или имплантацией фрагментов опухоли (приблизительно 25 мг) подкожно в левый бок мыши с использованием игл троакаров №13 при анестезии препаратом Forene (фирма Abbott, Швейцария). Анализируемое соединение начинают вводить в тот момент, когда опухоль достигает в среднем объема 100 мм³. Рост опухоли измеряют два или три раза в неделю и через 24 ч после последней обработки, определяя размер вдоль двух перпендикулярных осей. Объемы опухолей рассчитывают, как описано в литературе (см. статью Evans и др., Brit. J. Cancer, 45, 466-468 (1982)). Эффективность противоопухолевого действия определяют как частное от деления среднего увеличения объема опухоли у животных, получавших анализируемое соединение, на среднее увеличение объема опухоли в контрольной группе животных (не получавших анализируемое соединение) и после умножения на 100 представляют как Т/С%. Регрессию опухоли (в %) представляют как частное от деления минимального среднего объема опухоли на средний объем опухоли в начале обработки препаратом. Анализируемое соединение вводят ежедневно желудочным зондом.

В другом варианте аналогичным образом могут быть также использованы другие клеточные линии, например:

клеточная линия MCF-7 аденокарциномы молочной железы (АТСС №НТВ 22; см. также J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 51, 1409-1416 (1973));

клеточная линия MDA-МВ 468 аденокарциномы молочной железы MCF-7 (АТСС №НТВ 132; см. также In Vitro, 14, 911-915 (1978));

клеточная линия MDA-МВ 231 аденокарциномы молочной железы (АТСС №НТВ 26; см. также J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 53, 661-674 (1974));

клеточная линия Colo 205 карциномы толстой кишки (АТСС № CCL 222; см. также Cancer Res., 38, 1345-1355 (1978));

клеточная линия НСТ 116 карциномы толстой кишки (АТСС № CCL 247; см. также Cancer Res., 41, 1751-1756 (1981));

клеточная линия DU 145 карциномы простаты (АТСС № НТВ 81; см. также Cancer Res., 37, 4049-4058 (1978)); и

клеточная линия PC-3 карциномы простаты (АТСС № CRL 1435; см. также Cancer Res., 40, 524-534 (1980)).

Ингибирование аутофосфорилирования KDR-рецептора, индуцированное VEGF, может быть подтверждено еще одним экспериментом на клетках in vitro. Трансфектные клетки СНО, постоянно экспрессирующие рецептор VEGF человека (KDR), в полной культуральной среде (содержащей 10% ФБС) вносят в 6-луночные планшеты и инкубируют при 37°С в присутствии 5% CO₂ до достижения 80% конфлюентности. Затем анализируемые соединения растворяют в культуральной среде (не содержащей ФБС, но содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина, БСА) и добавляют к клеткам. Контроль включает среду, не содержащую анализируемых соединений. Затем инкубируют при 37°С в течение 2 ч и добавляют рекомбинантный VEGF, причем конечная концентрация VEGF составляет 20 нг/мл. Инкубируют при 37°С в течение еще пяти мин, после чего клетки дважды промывают охлажденным на ледяной бане фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и сразу лизируют, добавляя в лунки по 100 мкл лизирующего буферного раствора. Затем лизаты центрифугируют, удаляя клеточные ядра, и определяют концентрацию белка в супернатантах с использованием набора реактивов для определения белка фирмы BioRad. Лизаты могут быть использованы непосредственно после приготовления или при необходимости их можно хранить при -20°С.

Измерение фосфорилирования KDR-рецептора проводят с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) по следующей методике. Моноклональные антитела к KDR (например, Mab 14985.12.14, полученные H.Towbin) иммобилизуют на черных планшетах для проведения ИФА (OptiPlate™ HTRF-96, фирма Packard). Затем планшеты промывают и свободные связывающие белки участки насыщают 1% раствором БСА в ФБС. Затем в этих планшетах инкубируют клеточные лизаты (20 мкг белка в лунку) при 4°С в течение ночи в смеси с антителами к фосфотирозину, коньюгированными с щелочной фосфатазой (PY20:AP, производства Transduction Laboratories). Планшеты снова промывают, а затем связывание антифосфотирозиновых антител с иммобилизованным фосфорилированным рецептором определяют визуально с использованием люминесцентного АР субстрата (CDP-Star, готового к применению, в смеси с Emerald II; фирма Tropix). Люминесценцию измеряют в сцинтиляционном счетчике для микропланшетов (Packard Top Count). Разность между сигналом положительного контроля (стимулированного VEGF) и сигналом отрицательного контроля (не стимулированного VEGF) соответствует фосфорилированию (=100%) KDR-рецептора, индуцированному VEGF. Активность анализируемых соединений рассчитывают как процент ингибирования фосфорилирования KDR-рецептора, индуцированного VEGF, при этом концентрацию соединения, при которой наблюдается ингибирование, равное половине от максимума, определяют как ED50 (эффективная доза, вызывающая 50%-ное ингибирование). Соединения формулы I предпочтительно имеют значения ED50 в диапазоне от 0,25 нМ до 1000 нМ, предпочтительно от 0,25 нМ до 250 нМ.

Соединение формулы I или его N-оксид в различной степени также ингибируют другие тирозинкиназы, принимающие участие в передаче сигнала, которые опосредованы трофическими факторами, например, Abl киназы, киназы из семейства Src, прежде всего c-Src киназы, Lck и Fyn; кроме того, киназы семейства EGF, например с-еrbВ2 киназы (HER-2), с-еrbВ3 киназы, с-еrbВ4 киназы; рецепторную киназу инсулин-подобного ростового фактора (IGF-1 киназа), прежде всего членов семейства PDGF-рецепторной тирозинкиназы, таких как PDGF-рецепторная киназа, CSF-1-рецепторную киназа, Kit-рецепторная киназа и VEGF- рецепторная киназа; а также серин/треонин киназы, каждая из которых принимает участие в регуляции роста и трансформации клеток млекопитающих, включая клетки человека.

Ингибирование с-еrbВ2 тирозинкиназы (HER-2) может быть определено, например, аналогично тому, как измеряют ингибирование EGF-R протеинкиназы (см. статью House и др., Europ. J. Biochem., 140, 363-367 (1984)). еrbВ2 Киназа может быть выделена, а ее активность может быть определена с использованием известных методов (см. статью Т.Akiyama и др. Science, 232, 1644 (1986)).

По результатам этих испытаний соединение формулы I по настоящему изобретению оказывает лечебное действие, прежде всего, при нарушениях, зависимых от протеинкиназы, прежде всего, при пролиферативных заболеваниях.

Аналгетическая активность соединений формулы I может быть показана на следующей модели восприятия боли. В этой модели, гипералгезию, вызванную интрапланарной инъекцией дрожжей, измеряют при воздействии механического давления на конечность до тех пор, пока животное не подаст голос или не извлечет лапу из прижимной колодки. Эта модель чувствительна к ингибиторам СОХ, причем в качестве положительного контроля используют диклофенак в дозе 3 мг/кг. Методика проведения испытаний приведена ниже.

За два ч до инъекции определяют рабочее давление, необходимое для того, чтобы заставить самцов крыс Sprague Dawley (весом приблизительно 180 г, поставляемых фирмой Iffa Credo, Франция) подать голос или извлечь лапу, затем проводят интрапланарную инъекцию 100 мкл 20%-ной суспензии дрожжей в воде в заднюю лапу. Через 2 ч (время отсчета 0 ч) крысам дают анализируемое соединение перорально (в дозе 3, 10 или 30 мг/кг), диклофенак (3 мг/кг) или носитель (физиологический раствор) и испытание давлением повторяют через 1 и 2 ч после дозировки. При этом определяют давление, необходимое для подачи голоса или извлечения лапы с использованием стандартного прибора фирмы Ugo Basile (Италия), и сравнивают с результатами, полученными на животных, получавших носитель.

По результатам этих испытаний соединение формулы I неожиданно оказалось пригодными для снижения боли. Соединения формулы I или их N-оксиды по изобретению также оказывают лечебное действие, прежде всего, при нарушениях, зависимых от протеинкиназы, прежде всего, при пролиферативных заболеваниях.

Благодаря ингибирующей активности в отношении VEGF-рецепторной тирозинкиназы соединения формулы I, прежде всего, ингибируют рост кровеносных сосудов и, таким образом, например, эффективны против ряда заболеваний, связанных с нарушением ангиогенеза, прежде всего, заболеваний, вызванных неоваскуляризацией глаз, прежде всего ретинопатий, таких как диабетическая ретинопатия или возрастная дегенерация желтого пятна, псориаз, гемангиобластома, такая как гемангиома, пролиферативные нарушения мезангиальных клеток, такие как хронические и острые заболевания почек, например диабетическая нефропатия, злокачественный нефросклероз, синдромы тромботической микроангиопатии или отторжение трансплантата, или, прежде всего, воспалительного заболевания почек, такого как гломерулонефрит, прежде всего мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром, диабетическая нефропатия, гипертенсивный нефросклероз, атерома (атеросклеротическая бляшка), артериальный рестеноз, аутоиммунные заболевания, диабеты, эндометриозы, хроническая астма, и, прежде всего, опухолевые заболевания (солидные опухоли, а также лейкозы и другие, так называемые «жидкие опухоли», прежде всего, связанные с экспрессией c-kit, KDR, flt-1 или Flt-3), такие как, прежде всего, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких (прежде всего, мелкоклеточный рак легких), рак простаты или саркома Капоши. Соединение формулы I (или его N-окид) ингибирует рост опухолей и, прежде всего, пригодно для профилактики метастазирования опухолей и роста микрометастаз.

Соединение формулы I можно вводить отдельно или в сочетании с одним или более других терапевтических агентов, возможна сочетанная терапия, т.е. введение фиксированных комбинаций, или введение соединения по изобретению и одного или более других терапевтических агентов попеременно или независимо друг от друга, или одновременное введение фиксированных комбинаций и одного или более других терапевтических агентов. Соединение формулы I можно вводить отдельно или дополнительно, прежде всего, при терапии опухолей в сочетании с химиотерапией, радиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или при сочетании указанных подходов. Долговременная терапия в равной степени возможна в виде адьювантной терапии в сочетании с другими вышеописанными стратегиями лечения. Другими возможными видами лечения являются поддержание статуса пациента после регрессии опухоли или даже химиопрофилактической терапии, например, в случае пациентов с повышенным риском.

Терапевтические агенты для возможной комбинации представляют собой, прежде всего, одно или более соединений, обладающих цитостатическим или токсическим действием, например, это может быть химиотерапевтический агент или несколько агентов, выбранных из группы, включающей ингибитор биосинтеза полиамина, ингибитор протеинкиназы, прежде всего серин/треонин протеинкиназы, такой как протеинкиназа С, или тирозинпротеинкиназы, такой как рецепторная протеинкиназа эпидермального фактора роста, цитокин, отрицательный регулятор роста, такой как TGF-β или IFN-β, ингибитор ароматазы, классический цитостатик, и ингибитор взаимодействия SH2 домена с фосфорилированным белком.

Соединение по изобретению предназначено не только для оказания помощи человеку (профилактики или лечения), но и для лечения других теплокровных животных, например коммерческих животных, например грызунов, таких как мыши, кролики или крысы, или морские свинки. Такое соединение может быть также использовано в качестве стандартного образца в вышеописанных аналитических системах для сравнения с другими соединениями.

В общем случае изобретение относится также к применению соединения формулы I или его N-оксида для ингибирования активности VEGF-рецепторной тирозинкиназы, in vitro или in vivo.

Соединение формулы I или его N-оксид могут быть также использованы для диагностических целей, например для изучения опухолей, которые были получены от «хозяина» в виде теплокровного животного, прежде всего человека, и были имплантированы в организм мыши для анализа на увеличение роста после введения такого соединения с целью изучения чувствительности опухоли к упомянутому соединению и, таким образом, для поиска и разработки возможных методов лечения опухолевых заболеваний в организме хозяина.

Что касается групп предпочтительных соединений формулы I и их N-оксидов, упомянутых в данном описании, то в них для замены более общих значений на более специфические или, прежде всего, на значения, определенные как предпочтительные, целесообразно использовать значения заместителей и