Улучшенный способ получения ликопена путем ферментации выбранных штаммов blakeslea trispora, композиции и применения полученного ликопена

Улучшенный способ получения ликопена путем ферментации выбранных штаммов blakeslea trispora, композиции и применения полученного ликопена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Способ ферментации выбранных штаммов B. trispora, описанный в настоящем изобретении, дает возможность для достижения более высоких уровней продукции ликопена, чем описанные в настоящее время. Способы выделения, очистки и получения композиций (препаратов) применимы к любому природному источнику ликопена и особенно к глубинным культурам плесневых грибов родов Blakeslea, Choanephora, Phycomyces и Mucor. Способ экстракции предоставляет упрощение процесса получения и увеличение чистоты продукта по сравнению с ранее описанными способами. Способы получения дают высокую прибавочную стоимость, а также они дают возможность получать стабилизированные препараты ликопена для непосредственного применения в областях пищевых продуктов и фармации.

Уровень техники

Каротиноиды широко распространены в природе, придавая свой характерный цвет, от желтого до темно-красного, многим природным веществам, таким как морковь, перец, томаты, цветы или определенные микроорганизмы, включающие в себя некоторые бактерии, грибы и фотосинтезирующие организмы. Каротиноиды можно разделить на два типа: (i) чистые углеводороды, называемые каротинами, включая такие соединения, как β-каротин, α-каротин, γ-каротин или ликопен, и (ii) молекулы, называемые ксантофиллами, которые содержат кислород в различных формах (гидроксильные группы, эпоксигруппы, и т.д.), включая астаксантин, зеаксантин, капсантин, кантаксантин, лютеин и т.д. Эти две группы соединений характеризуются различным поведением в плане их физико-химических свойств и растворимости в органических растворителях. Все эти соединения играют важную роль в диете человека, интенсивно исследовались их свойства в качестве антиоксидантов для предотвращения злокачественных опухолей и других заболеваний человека и в качестве предшественников для витамина А. Недавно на крысах было продемонстрировано, что ликопен ингибирует вредное воздействие нитрилацетата железа на ДНК и предотвращает некроз печени [Matos H.R. et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys. vol. 396]. Кроме того, благодаря их окраске от желтого до красного каротиноиды очень коммерчески значимы в качестве красителей и пищевых добавок с учетом их полезного для здоровья действия и их привлекательных цветов [Ninet L. y Renaut J. (1979) In: Peppler HJ., Perlman D. (eds). Microbial Technology. 2^nd. Edition. vol. 1 Academic Press, NY, pp. 529-544].

Ликопен (C₄₀H₅₆) является промежуточным продуктом пути биосинтеза β-каротина и ксантофиллов. Он характеризуется молекулярной массой, равной 536,85, и следующей молекулярной формулой:

Ликопен

Ликопен

Действуя также как антиоксидант, ликопен предотвращает сердечно-сосудистые заболевания и некоторые типы злокачественных опухолей, и он активен при контроле роста [Giovannucci et al (1995) J Nat. Cancer Inst. 87: 1767-1776; Stahl W. and Sies, H. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336: 1-9; Clinton, SK. (1998) Nutr. Rev. 56: 35-51]. Это приводит к повышенной потребности в нем у некоторых потребителей. Получения ликопена в виде высокочистого соединения в прошлом было связано с химическим синтезом [US 5208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599]. Однако теперь существуют альтернативные пути, основанные на источниках ликопена природного происхождения и специальных способах экстракции.

Продуцирование каротиноидов путем микробного биосинтеза является классическим примером конкуренции между химическими и биологическими способами. Препараты ликопена биологического происхождения получают из томатов [PCT WO 97/48287, EP 608027] или путем ферментации плесневых грибов родов Phycomyces, Blakeslea и Choanephora [GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416, WO 00/77234]. Для получения максимального выхода каротиноидов из B. trispora необходимо ферментировать вместе (+) и (-) штаммы [Ciegler, A. (1965) Advances in Applied Microbiology 7: 1-34: Plempel, M. (1965) Planta 65: 225-231; Sutter, RP. and Rafelson. ME. (1968) J. Bacteriology 95: 426-432]. Увеличение выхода каротиноидов в смешанных культурах связано с продукцией семейства кислотных соединений, названных фактором β или триспоровыми кислотами [WO 00/77234, Caglioti L. et al. (1966) Tetrahedron Supplement 7: 175-187]. При биосинтезе триспоровых кислот β-каротин, продуцируемый (+) и (-) штаммами, метаболизируется до ретиналя и впоследствии до 4-дигидротриспорола. (+) штамм утилизирует 4-дигидротриспорол в качестве субстрата для образования дигидротриспоровой кислоты и ее метилового сложного эфира (метил-4-дигидротриспорат). Со своей стороны, (-) штамм метаболизирует 4-дигидротриспорол до триспорола. Наконец, метил-4-дигидротриспорат преобразуется в триспоровую кислоту (-) штаммом, а триспорол преобразуется в триспоровую кислоту (+) штаммом. Данное описание биосинтеза триспоровых кислот представляет собой упрощение, поскольку в течение данного процесса генерируется много совместных метаболитов, некоторые из которых обычны для (+) и (-) штаммов, но другие специфичны для одного из них. Относительные количества данных совместных метаболитов изменяются в зависимости от штаммов.

Путь биосинтеза β-каротина (см. схему 1) описан для грибов, филогенетически родственных B. trispora, таких как Phycomyces blakesleeanus и Mucor circinelloides [Arrach N. et al. (2001) Proceedings of the National Academic of Sciences USA 98: 1687-1692; Velayos A. et al. (2000) European Journal of Biochemistry 267: 5509-5519]. По меньшей мере, три фермента необходимы для указанного биосинтеза: (i) фитоенсинтаза, которая объединяет вместе две молекулы геранилгеранилпирофосфата с образованием фитоена, (ii) фитоендегидрогеназа, которая вводит четыре двойные связи в молекулу фитоена для синтеза ликопена, и (iii) ликопенциклаза, которая с использованием в качестве субстрата ликопена образует кольца, находящиеся на двух концах молекулы β-каротина. На основе анализа мутантов B. trispora было сделано заключение, что путь биосинтеза β-каротина для данного гриба сходен с описанным для P. blakesleeanus [Metha B.J. and Cerdá-Olmedo E. (1995) Applied Microbiology and Biotechnology 42: 836-838]. В случае P. blakesleeanus желтый цвет его мицелия может быть изменен путем мутации с получением штаммов с мицелием, окрашенным в красный, белый цвет и различные оттенки желтого. Красные мутанты накапливают ликопен, в то время как в белых отсутствует продукция каротиноидов или накопление фитоена. Для продукции ликопена необходимо располагать штаммами B. trispora, лишенными активности ликопенциклазы, или, альтернативно, в среду ферментации следует добавить химические средства, ингибирующие указанную ферментную активность.

Схема 1

В патентах GB 1008469, US 3097146, US 3369974, JP 73016189, JP 73016190, RU 2102416 и WO 00/77234 описана продукция ликопена посредством ферментации плесневых грибов, таких как Phycomyces, Blakeslea и Choanephora. В патентах GB 1008469 и US 3097146 описаны способы ферментации B. trispora, основанные на контроле рН в интервале значений от 7,0 до 9,5, с получением выходов ликопена 99,7 мг/л через 7 суток ферментации. В патентах JP 73016189 и JP 73016190 описаны способы продукции ликопена плесневыми грибами, основанные на добавлении третичных аминов. В патенте RU 2102416 описано добавление аминометилпиридинов и настоев табака для индукции накопления ликопена. Помимо веществ, описанных в указанных патентах, опубликовано применение других азотосодержащих оснований для блокирования синтеза каротиноидов на уровне ликопена: никотин (JP09313167), имидазол, пиридин, морфолин, хинолин и некоторые замещенные производные [US 3369974; Ninet L., Renaut J. (1979) In: Peppler HJ., Perlman D (eds). Microbial Technology, 2^nd. Edition, vol. 1 Academic Press. NY. pp. 529-544]. Более того, описаны мутанты B. trispora, которые накапливают ликопен без необходимости добавления третичных аминов [Metha B.J. and Cerdá-Olmedo E. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836-838].

В дополнение к указанным выше плесневым грибам описана продукция ликопена в водорослях [JP 09313167 и JP 2000152778] путем ферментации Streptomyces chrestomycelicus var. rubescens [US 3467579] и путем модификации пути биосинтеза каротиноидов в Flavobacterium sp. R1534 [US 6124113].

Ликопен можно получать из растительных продуктов, таких как: томаты, морковь, перец, растительные масла и т.д. Так, в патенте WO 97/48287 описан способ получения обогащенных ликопеном смол из томатов путем сдавливания томатов до получения мякоти, экстракцию ликопена из мякоти органическими растворителями и последующей элиминацией растворителя путем упаривания, с получением смолы с содержанием ликопена в интервале 2-10%. Сходные способы получения смол, богатых каротиноидами в общем и ликопеном в частности, из растений и масел описаны в различных патентах, таких как US 5245095 и EP 580745, путем осаждения солями кальция, US 5019668, путем использования способа трансэтерификации маслами с последующей перегонкой, в WO 95/16363, где описано фракционирование томатов на различные фракции, которые содержат смолы, богатые каротиноидами, и в заявке PCT WO 90/08584, где описана экстракция ликопенов путем использования жидкостей в сверхкритическом состоянии, хотя полученный экстракт представляет собой смесь различных каротиноидов, и выходы экстракции были очень низкими из-за их низкой растворимости.

Во всех этих случаях за счет низкой концентрации ликопена в данных природных продуктах и внутриклеточном расположении данного соединения в некоторых органеллах, таких как хлоропласты и хромопласты, выходы экстракции и чистота продукта являются низкими, с получением смол, богатых ликопеном или обезвоженного сырья вместе с различными концентрациями других каротиноидных и некаротиноидных соединений. В большинстве случаев описанные способы экстракции требуют обработки плодов путем измельчения или давления для облегчения экстракции растворителя и освобождения таким образом богатого ликопеном внутриклеточного содержимого. Наконец, большая часть способов, описанных в данных патентах, требует применения органических растворителей, которые присутствуют в виде следов в полученных смолах. Более того, в патенте IL 107999 описано получение смол, очень богатых ликопеном, из мякоти томатов, хотя, как и ранее, полученный продукт не состоит из кристаллов ликопена высокой частоты, но из богатых ликопеном липидных концентратов.

С другой стороны, в патенте WO 97/15554 описана экстракция каротиноидов растительного происхождения из моркови и томатов, которые включают в себя ликопен, путем выделения хлоропластов и хромопластов, с последующим расщеплением указанных органелл белками-ферментами гидролиза, такими как пектины и/или протеазы, что делает возможным высвобождение ликопена, связанного с различными структурными белками. Путем последующей щелочной обработкой и экстракции смесями низкомолекулярных спиртов возможно получить экстракты ликопена с обогащением и чистотой, превышающими таковые для смол, хотя и без получения очищенных кристаллов ликопена, но богатых ликопеном грубых экстрактов. Сходным образом, концентрированные экстракты ликопена получают в патенте EP 608027 A2 путем выделения хромопластов томата, в которых ликопен присутствует в кристаллической форме. Данные экстракты из богатых ликопеном хромопластов томата используют непосредственно в качестве красителя без последующей экстракции кристаллов ликопена, избегая при этом изменения цвета ликопена во время экстракции и избавляясь от необходимости использования органических растворителей. В соответствии с описанным в данном патенте способом невозможно получить чистый ликопен в кристаллической форме, подходящей для применения в пищевой продукции или фармацевтических композициях, но применяемой только в качестве пищевого красителя в обезвоженной, высушенной вымораживанием или замороженной форме. Некоторые богатые каротиноидами микроскопические водоросли типа Dunaliella являются другим важным источником ликопена. Имеются различные способы экстракции каротиноидов, в частности ликопена, из данных организмов, как описано в патентах US 5378369, US 4713398 и US 4680314, путем экстракции органическими растворителями (хлоруглеродами, углеводородами, и т.д.) или пищевыми маслами (DE 4342798). Другой способ описан в заявке PCT WO 98/08584, в которой экстракт ликопена получают с использованием CO₂ в сверхкритическом состоянии, хотя экстракт, полученный таким образом, также слабо очищен в плане ликопена.

Ликопен также может быть получен из некоторых плесневых грибов, таких как Blakeslea, Choanephora, Phycomyces или Mucor, путем ферментации в жидкой среде, что предоставляет преимущество по сравнению с продукцией ликопена из растительных продуктов или водорослей в повышенной концентрации данного соединения, равной в некоторых случаях примерно 5 мас. % относительно количества сухой биомассы, причем эти концентрации выше полученных из лучших разновидностей растений, а также в возможности биотехнологической разработки штаммов-гиперпродуцентов данных микроорганизмов, способом классического мутагенеза или с применением новых технологий молекулярной биологии, позволяющих проведение генетических манипуляций с данными микроорганизмами, с увеличением концентрации и выхода ликопена и устранения продукции других структурно родственных каротиноидов.

Как уже указывалось, получение кристаллического ликопена высокой чистоты из природных источников требует стадии экстракции органическими растворителями или жидкостями в сверхкритическом состоянии, и затем различных стадий очистки, таких как хроматография, способы адсорбции и элюции, и стадий преципитации и кристаллизации, как, например, описано в патентах US 3369974, EP 818255 и EP 242148. В большинстве случаев, в которых не используются данные стадии последующей очистки, и кристаллизация проводится прямо из экстракта путем упаривания растворителя до преодоления растворимости, чистота полученного продукта является очень низкой, и впоследствии необходимо осуществлять способы перекристаллизации полученного ликопена, с дополнительной сложностью, состоящей в том, что низкая растворимость продукта означает то, что должно использоваться большое количество растворителя для достижения стадии перекристаллизации, что далее приводит к снижению выхода (NL 6411184, US 4439629).

В патентной заявке WO 96/13178 описано получение концентратов стабилизированного кристаллического ликопена в совместимой с пищевым продуктом жидкой среде, в которой ликопен нерастворим, такой как этиленгликоль, этанол или глицерин, с получением, путем перемалывания, малых кристаллов (1-3 микрон) ликопена, суспендированных в жидкой среде. Более того, в патентной заявке WO 98/43620 описан способ выделения кристаллов ликопена из смолы путем омыления различных триглицеридов и фосфонатов при высокой температуре и последующем разбавлении водой с получением кристаллов ликопена с чистотой от 75 до 95%. Сходный способ недавно описан в WO 98/03480 для получения кристаллов β-каротина высокой чистоты путем промывки водой, низкомолекулярными спиртами или ацетоном, хотя это применение не описано для получения кристаллов ликопена высокой чистоты.

Нестабильность каротиноидов в кристаллической форме хорошо известна, и одним из способов их стабилизации является получение масляных дисперсий. Более того, полагают, что каротиноиды, диспергированные в масле, легче всасываются организмом. Альтернативный способ стабилизации нестабильных соединений представляет собой их микроинкапсулирование в крахмальные матриксы. Так, в патентах US 2876160, US 2827452, US 4276312 и US 5976575 описано заметное повышение стабильности различных соединений, включая каротиноиды, путем их инкапсулирования в крахмальный матрикс.

Одной из основных сложностей применения каротиноидов в области красителей является их нулевая растворимость в воде, поскольку многие их применения осуществляются в водных средах. Данная проблема растворимости указана в документе US 3998753 и решена путем получения растворов каротиноидов в летучих органических растворителях, таких как галогенированные углеводороды, и эмульгирования их водным раствором лаурилсульфата натрия.

В патенте US 5364563 описан способ получения препарата каротиноидов в порошковой форме, который включает образование суспензии каротиноидов в масле с высокой точкой кипения. Суспензию сильно нагревают паром в течение периода, максимально равного 30 секундам, для образования раствора каротиноидов в масле. Затем данный раствор эмульгируют в водном растворе коллоида и затем эмульсию сушат распылением.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к серии способов получения ликопена с высокими выходами из гриба B. trispora, а также к способам его выделения и получения его препарата. Изобретение состоит из (i) планирования способов получения и отбора мутантов B. trispora, гиперпродуцирующих ликопен, (ii) разработки улучшенных условий ферментации, (iii) создания способов выделения ликопена из мицелия и (iv) получения препаратов, в которых преодолена проблема стабильности и растворимости в различных средах, существующая в данной области в настоящее время. B. trispora представляет собой гриб с высокой промышленной значимостью для биотехнологической продукции ликопена. Фактически, указанный способ демонстрирует конкурентоспособность по отношению к способу синтеза, используемому в настоящее время в промышленности.

С целью получения штаммов, которые являются гиперпродуцентами ликопена, во-первых разработан способ мутагенеза (+) и (-) штаммов B. trispora мутагенными средствами этилметансульфонатом (EMS) и N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG). Суспензии спор для мутации получали со скошенной среды YpSs. Споры ресуспендировали путем добавления 10 мл 0,1% раствора Triton X-100 на каждую скошенную среду. Остатки мицелия удаляли путем фильтрации через нейлоновый фильтр с размером пор 20 мкм. Концентрацию спор в суспензии доводили до 10⁶ спор/мл. Способ мутации EMS состоял в инкубировании 10⁶ спор/мл в 3%-ном растворе EMS в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0, при комнатной температуре в течение 60 мин, достигая уровня смертности, равной примерно 99%. Мутированные споры промывали трижды 0,1%-ным Triton X-100 и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин при 15°С. Способ мутации NTG состоял в инкубировании 10⁶ спор/мл в растворе, содержащем 250 мкг/мл NTG и 0,1 М буфера цитрата натрия, рН 5,0, при комнатной температуре в течение 30 мин, достигая уровня смертности, равной примерно 95%. Мутированные споры промывали трижды 0,1%-ным Triton X-100 и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин при 15°С. Чашки Петри, содержащие твердую среду Sutter IV, дополненную 0,1% Triton X-100, засеивали мутированными спорами и инкубировали при 25°С в течение 4 суток для получения выделенных колоний.

Стратегии, использованные для выбора (-) штаммов B. trispora - гиперпродуцентов ликопена, были следующими: (i) применение триспоровых кислот и (ii) интенсивность цвета колонии. Отбор продуцирующих ликопен мутантов путем добавления триспоровых кислот состоял из помещения фильтров, пропитанных триспоровыми кислотами, на колонии, полученные из мутированных спор. Триспоровые кислоты получали из смешанной культуры (+) и (-) штаммов B. trispora. Колонии и фильтры инкубировали при 25°С, и наблюдалось, что мутанты, продуцирующие ликопен, приобретали темно-красный цвет, по сравнению с продуцентами β-каротина, которые были окрашены оранжевым. Применяя данный способ в отношении штамма CMA3 (-), был отобран штамм LMA1 (-) (схема 2). Отбор продуцирующих ликопен мутантов как функцию интенсивности окраски колонии проводили следующим путем: штамм CMA1 (-) (продуцент β-каротина; см. схему 2) подвергали мутации и мутированные споры выращивали на чашках с твердой средой YEDPA. Затем отбирали те колонии, которые обладали более насыщенным желто-оранжевым цветом, чем родительский штамм CMA1 (-). Данным путем выделяли 2 колонии с насыщенным желто-оранжевым цветом (обозначенные CBM1 (-) и CBM2 (-)).

Схема 2

Филогения (-) штаммов B. trispora, полученных от B. trispora VKPN F-208 (-), с использованием способов мутации и селекции. УФ: ультрафиолет; ПС: природная селекция; NTG: N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин; EMS: этилметансульфонат.

Отбор мутантов B. trispora (+) - гиперпродуцентов ликопена осуществляли путем выращивания мутированных спор на чашках Петри, содержащих твердую среду Sutter IV, дополненную 0,1% имидазола. Далее часть каждой колонии переносили на чашку с PDA, на которую была ранее высеяна B. trispora (-). Уровень продукции ликопена в твердой среде определяли как функцию интенсивности окрашивания зоны пересечения колонии (+) штамма с таковой (-) штамма. Таким путем отбирали штамм B. trispora CPA1 (+) (схема 3), который обеспечивал высокий выход ликопена в смешанных твердых культурах с серией (-) штаммов. Уровень продукции штамма B. trispora CPA1 (+) затем анализировали в смешанных структурах в жидкой среде.

Система символов, используемых для обозначения выбранных штаммов, является следующей:

СМ: Каротин, минус (-).

LM: Ликопен, минус (-).

CP: Каротин, плюс (+).

LP: Ликопен, плюс (+).

Отношение родительских поколений следует алфавитному порядку: А является родительским для В, В является родительским для С, и так далее. Число после букв соответствует номеру мутанта. Например, обозначение CMA1 (-) означает, что это продуцирующий каротин штамм (С), минус (M), родительский для СМВ, и мутант номер 1. Сходным образом, CMA1 (-),CMA2 (-),CMA3 (-) и CMA4 (-) соответствуют мутантам 1, 2, 3 и 4 того же поколения.

Схема 3

Филогения (+) штаммов B. trispora, полученных от B. trispora VKPN F-117 (+), с использованием способов мутации и селекции. УФ: ультрафиолет; ПС: природная селекция; NTG: N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин; EMS: этилметансульфонат.

(+) и (-) штаммы B. trispora, отобранные на твердой среде, ферментировали во флаконе с целью определения уровня продукции ликопена в твердой среде и смешанной культуре. Для этого отдельные флаконы инокулированного материала высевали с штаммами B. trispora CPA1 (+) и B. trispora CMB2 (-), и затем смешанные ферментации обоих штаммов осуществляли во флаконе. В начале ферментации (0-50 часов) добавляли ингибитор фермента ликопенциклазы с целью блокирования пути биосинтеза на уровне ликопена (например, имидазол в концентрации 0,7-0,8 г/л). В конце ферментации (примерно 6 суток) мицелий B. trispora лизировали путем встряхивания на вортексе, ликопен экстрагировали органическими растворителями (например, ацетоном) и определяли его концентрацию и чистоту путем HPLC. Тот же тип ферментации осуществляли с штаммами B. trispora CPA1 (+) и B. trispora LMA1 (-), за исключением того, что в данном случае не было необходимости добавлять ингибитор фермента ликопенциклазы. Выходы, полученные с данными штаммами в смешанной культуре, составляли 1,2 г/л.

Штаммы CPA1 (+) и CMB2 (-) культивировали в полукоммерческом ферментере с целью определения выхода ликопена. Для этого их отдельно выращивали во флаконах, отдельно переносили в промежуточные резервуары для роста, и наконец, их ферментировали вместе. Между 25 и 35 часами ферментации добавляли имидазол в качестве ингибитора ликопенциклазы. Ферментацию инкубировали в течение 100-140 часов. Среднее значение выхода ликопена, полученное в серии различных ферментаций штаммов CPA1 (+) и CMB2 (-), составляло 3,4 г/л.

Штаммы CPA1 (+) и LMA1 (-) культивировали в полукоммерческом ферментере с целью определения выхода ликопена без добавления ингибиторов фермента ликопенциклазы. Ферментацию проводили, как указывалось ранее для штаммов CPA1 (+) и CMB2 (-), но без добавления имидазола. Среднее значение выхода ликопена, полученное в серии различных ферментаций штаммов CPA1 (+) и LMA1 (-), составляло 1,6 г/л.

Более высокий выход на данной стадии ферментации получали путем контроля возраста вегетативных стадий роста штаммов B. trispora. Так, используемые для инокуляции культуры имеют возраст 30-60 часов, предпочтительно 48 часов, как для (+), так и для (-) штаммов, но с различием в количестве высеянных спор: 800-1000 спор/мл и 40000-60000 спор/мл соответственно. Инкубацию проводили примерно при 25°С с 0,1% об./об. каждого материала инокуляции, засеянного в фазе первичной культуры. Возраст указанных первичных культур варьирует в интервале 30-60 часов, предпочтительно 36-48 часов, при температурах в интервале 26-28°С. Затем первичные фазы (+)/(-) смешивают в отношении 1/10 об./об. и ферментеры засевают 10-20% об./об. смесью указанных фаз.

В свете внутриклеточных характеристик каротиноидного компонента, биологически синтезируемого при ферментации, способ выделения из культуральной среды, полученной, как заявлено в обычных способах, в качестве первой стадии включает отделение биомассы от культуральной среды. Данное отделение может осуществляться обычными способами фильтрации, с использованием обычных технологий с фильтрами, будь то ленточные фильтры, барабанные фильтры, пресс-фильтры, и т.д., в которых барьер, состоящий из ткани фильтра, отделяет биомассу и позволяет жидкой фазе проходить без биомассы, или центрифугирования, при котором за счет использования разницы плотности между культуральной средой и биомассой (обычно более плотной) применяется прибор, такой как центрифужный разделитель, отстойник и тому подобное, где более тяжелая фаза становится концентрированной и отделяется от жидкой фазы вместе с максимально возможным количеством биомассы. Одной из целей данной стадии является снижение потерь и оптимизация характеристик каждой фазы с достижением наибольшего количества биомассы с наивысшим содержанием сухого остатка и удаления большей части среды ферментации с минимальным количеством активного вещества.

Полученный в результате влажный мицелий содержит более 95% каротиноидов, продуцированных при ферментации, предпочтительно более 97% и более предпочтительно более 99%. Содержание каротиноидов в водной фазе поэтому составляет менее 5%, предпочтительно менее 3% и более предпочтительно менее 1%. Из этого влажного мицелия будет возможно на последующих стадиях выделить ликопен. Однако было обнаружено, что в сочетании с ферментациями данный мицелий все же характеризуется относительно высоким содержанием липофильных компонентов от 15 до 20% (жирные кислоты и масла), которые вызывают проблемы очистки на более поздних стадиях, так что становится необходимым введение в этом месте стадии очистки биомассы. Стадия очистки включает в себя ресуспендирование биомассы в спирте: метаноле, этаноле, пропаноле, изопропаноле, или любом другом спирте, в котором растворимость ликопена является очень низкой, до степени, достаточной для достижения максимальной очистки липидных компонентов. Таким образом, влажный мицелий ресуспендируют количеством спирта, изменяющимся от 1 мл/г до 10 мл/г влажного мицелия. Температура ресуспендирования варьирует от 0°С и до точки кипения спирта, предпочтительно от 10 до 50°С. Время контакта находится в интервале от 5 минут до 24 часов. Суспензию в спирте, полученную таким образом, фильтруют или центрифугируют, так что содержание твердых веществ в фильтрате или осветленной жидкости практически равно нулю. Полученный в результате влажный мицелий, который содержит спирт и воду в различных пропорциях, содержит более 93% каротиноидов, продуцированных при ферментации, предпочтительно более 95% и более предпочтительно более 97%.

В надосадочной жидкости или фильтрате, который содержит остатки культуральной среды или спирта, содержание каротиноидов составляет менее 2%, предпочтительно менее 1%, относительно изначальной культуральной среды. Данная обработка спиртом дает возможность для удаления некоторого количества растворимых в спирте липофильных веществ, в варьирующих количествах, зависящих от характеристик используемой культуральной среды, с осуществлением предварительной очистки, дающей возможность получения кристаллического конечного продукта высокой очистки. Более того, за счет удаления варьирующей части воды из начального влажного мицелия значительно облегчается последующий процесс сушки. Путем смешивания культуральной среды непосредственно со спиртом и поддержания минимального времени контакта достигается эффект очистки, эквивалентный тому, что описан ранее, так что процесс упрощается путем элиминации одной операции разделения твердой и жидкой фаз. Отношение культуральная среда/спирт может меняться от 1/0,5 до 1/5 и предпочтительно находится от 1/1 до 1/3. Температура смеси меняется от комнатной температуры до точки кипения смеси, и предпочтительно от комнатной температуры и 60°С.

Обезвоженный/очищенный мицелий сушат. Сушка может проводиться обычными периодическими или непрерывными способами. Температура сушки варьирует от комнатной температуры до 150°С, предпочтительно она не должна превышать 60°С и более предпочтительно она должна быть ниже 50°С. Время сушки зависит от используемой температуры и варьирует от 1 часа до 72 часов. Из-за возможного разложения данных каротиноидов окислением атмосферным кислородом лучше всего осуществлять данную операцию сушки в отсутствие кислорода, или в атмосфере азота, или, по меньшей мере, в вакууме. Тот факт, что каротиноидный продукт является внутриклеточным, означает, что требуется создание соответствующих условий обработки очищенной биомассы, путем сушки и перемалывания, сушки и дезинтеграции или дезинтеграции биомассы, что способствует смешиванию с растворителями и облегчает экстракцию растворителем. Чтобы растворитель имел хороший доступ к подлежащим экстракции каротиноидам, необходима предварительная операция разрушения мицелия для максимизации области контакта. Оптимальный размер частиц сухого разрушенного мицелия должен составлять менее 3 мм, предпочтительно менее 1 мм и более предпочтительно менее 0,5 мм.

Перемалывание может проводиться на сухом продукте посредством механических систем с шарнирными или фиксированными частями: молотками, ситами и т.д., путем пропускания через вращающиеся цилиндры, давящие один на другой (сдавливание или экструзия). Также возможно осуществлять сушку и перемалывание за одну стадию посредством систем мгновенной (немедленной) сушки в струйной мельнице, где влажный продукт подается в рециркулирующий поток газа при высокой температуре таким образом, что время пребывания является минимальным, для упаривания содержимого жидких компонентов, и продукт транспортируется с изменением плотности в циклон, откуда он извлекается. Во время сушки и по пути сушки также имеет место эффект гомогенизации, поскольку частицы сталкиваются со стенками.

Для экстракции ликопена из подготовленного описанным способом мицелия могут использоваться различные органические растворители. Данное изобретение относится к применению растворителей пищевой марки, рассматриваемых как натуральные, таких как сложные эфиры кислот, предпочтительно этил-, пропил-, изопропил-, бутил- или изобутилацетаты, которые сочетают довольно высокую растворимость для каротиноидных компонентов с их совместимостью как растворителей, входящих в группу класса III ICH. Данные растворители допустимы к применению как на национальном уровне, так и на уровне Сообщества в области фармакологии и пищевой области (RDL12/04/90 и RDL16/10/96). Как заявлено в ICH, содержание остаточного растворителя должно быть ниже 5000 м.д., предпочтительно ниже 1000 м.д. и более предпочтительно ниже 100 м.д., из расчета для каждого случая по сухому веществу в жидкой смеси. Температура экстракции варьирует от комнатной температуры до точки кипения растворителя, предпочтительно от 50°С до 80°С. Время экстракции является минимальным, необходимым для достижения растворения, от 1 секунды до 1 часа, предпочтительно от 1 минуты до 15 минут. Количество используемого растворителя зависит от температуры и от содержания каротиноидов в мицелии, варьируя от 5 мл/г до 30 мл/г биомассы. Число экстракций варьирует от 1 до 3. Количество экстрагированных каротиноидов составляет более 85%, предпочтительно более 90% и более предпочтительно более 95%.

После получения богатый каротиноидами экстракт должен концентрироваться до определенного объема. Конечная концентрация каротиноидов в растворе после концентрирования предпочтительно составляет от 10 до 50 г/л. Температура концентрирования должна быть ниже 80°С, предпочтительно ниже 70°С, и более предпочтительно ниже 50°С. После концентрирования экстракта до конечного объема необходимо добавлять вещество, не растворяющее каротиноиды, в частности спирт и более конкретно метанол, этанол, пропанол, изопропанол или любой другой спирт, в котором растворимость ликопена очень низка, так что выход кристаллического ликопена заметно возрастает. Добавление спирта также имеет эффект очистки. Время кристаллизации варьирует от 15 мин до 24 часов, предпочтительно от 1 ч до 12 ч и более предпочтительно от 3 до 8 часов. Температура кристаллизации должна быть ниже 25°С, предпочтительно ниже 5°С.

Отделение кристаллов от жидкости кристаллизации может осуществляться путем фильтрации или центрифугирования, при замене жидкости кристаллизации, в которую погружены кристаллы, промывкой тем же спиртом, который использовался в качестве нерастворяющей жидкости. Полученные кристаллы сушат в вакууме при комнатной температуре, по меньшей мере, в течение 1 часа до получения содержания остаточного растворителя, которое соответствует нормам, установленным законами, указанными ранее, и в случае ликопена потери при сушке составляют менее 0,5%.

Чистота полученных кристаллов соответствует титру, равному примерно 95%, определенному посредством спектрофотометрии путем считывания поглощения при 472 нм раствора кристаллов в н-гексане (EI%/1 см = 3450) с содержанием других каротиноидов ниже 3%. Содержание цис-ликопена составляет ниже 3%.

Способ по данному изобретению особенно подходит для получения кристаллического ликопена из микробного источника, предпочтительно из водорослей, грибов или дрожжей, более предпочтительно из грибов порядка Mucorales и более предпочтительно B. trispora. Исключительная чистота, достигнутая для полученных посредством указанной методологии кристаллов, и применение растворителей, которые считаются натуральными, означает, что данные кристаллы могут использоваться в пищевой, фармацевтической или косметической промышленности.

Кристаллический продукт, полученный посредством методологии, описанной в данном изобретении, может упаковываться в непрозрачные контейнеры, которые предотвращают фотодеградацию продуктов, в отсутствие кислорода (инертная атмосфера или вакуум) для предотвращения окисления и при температурах от 0 до 5°С. Упакованный надлежащим образом продукт может использоваться и продаваться «как есть». Однако целесообразно увеличить его стабильность последующими стадиями композиции и усовершенствования, где используется добавление антиоксидантов, что дает возможность для получения конечного продукта со сроком хранения выше 6 месяцев при надлежащей упаковке.

Другой важной целью настоящего изобретения является способ получения ликопена, который охватывает его композицию в различных представлениях, в зависимости от характеристик применения, для которого надлежит использовать этот ликопен. Первое применение, называемое микрокристаллической суспензией ликопена в растительном масле, состоит из предварительного смешивания указанного выше количества кристаллического ликопена с различными количествами растительного масла. Тип растительного масла может сильно варьировать, причем наиболее обычными, хотя и не единственными, являются подсолнечное масло, оливковое масло, кукурузное масло, соевое масло, масло хлопчатника и т.д. Дозировка ликопена является функцией требуемой конечной силы действия, причем наиболее обычными количествами являются суспензии с содержанием ликопена от 5 до 60%, предпочтительно от 10 и 30%. Для увеличения стабильности смеси добавляют обычные жирорастворимые антиоксиданты, такие как природные токоферолы, и предпочтительно D,L-альфа-токоферол. Доля данного компонента изменяется от 0,2 до 15% относительно массы ликопена, предпочтительно 0,5 до 5%. Чтобы композиция, которая содержит ликопен, обладала удовлетворительной биологической активностью, необходимо уменьшить размер кристаллов ликопена. Это достигается в обычных системах перемалывания, которые подходят для жидких смесей. Конкретным объектом данного изобретения являются шаровые мельницы, которые обеспечивают уменьшение размера кристаллов ниже 10 микрон, предпочтительно ниже 5 микрон и даже более предпочтительно ниже 2 микрон, с использованием микросфер с диаметром от 0,5 до 0,75 мм. Тем не менее размер кристаллов может изменяться, как заявлено в конкретном применении суспензии, с использованием подходящих сфер и условий перемалывания в каждом случае. Данные размеры кристаллов также будет определять реологиче