Производные нафтиридина, способ их получения и применение

Производные нафтиридина, способ их получения и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к органическим соединениям, их получению и их применению в качестве фармацевтических препаратов.

В одном из аспектов настоящее изобретение обеспечивает соединения формулы I

в свободной форме или в виде соли, где

R¹ означает одновалентную ароматическую группу, содержащую до 10 атомов углерода, и

R² означает циклоалифатическую группу, содержащую до 8 кольцевых углеродных атомов.

"(С₁-С₈)алкил", как используется в контексте, означает (С₁-С₈)алкил с прямой или разветвленной цепью, который может означать, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил с прямой или разветвленной цепью, гексил с прямой или разветвленной цепью, гептил с прямой или разветвленной цепью или октил с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно (C₁-C₈)алкил означает (С₁-С₄)алкил.

"(C₁-C₈)алкоксигруппа", как используется в контексте, означает (C₁-С₈)алкоксигруппу с прямой или разветвленной цепью, которая может означать, например, метокси-, этокси-, н-пропокси-, изопропокси-, н-бутокси-, изобутокси-, втор-бутокси-, трет-бутоксигруппу, пентоксигруппу с прямой или разветвленной цепью, гексилоксигруппу с прямой или разветвленной цепью, гептилоксигруппу с прямой или разветвленной цепью или октилоксигруппу с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно (C₁-C₈)алкоксигруппа означает (С₁-С₄)алкоксигруппу.

"(С₁-С₈)алкилтиогруппа", как используется в контексте, означает (C₁-С₈)алкил-тиогруппу с прямой или разветвленной цепью, которая может быть, например, метилтио-, этилтио-, н-пропилтио-, изопропилтио-, н-бутилтио-, изобутилтио-, втор-бутилтио-, трет-бутилтиогруппой, пентилтиогруппой с прямой или разветвленной цепью, гексилтиогруппой с прямой или разветвленной цепью, гептилтиогруппой с прямой или разветвленной цепью или октилтиогруппой с прямой или разветвленной цепью. Предпочтительно (C₁-С₈)алкилтиогруппа означает (С₁-С₄)алкилтиогруппу.

"(С₁-С₈)галоидалкил", как используется в контексте, означает (С₁-С₈)алкил, как он определен выше, замещенный одним или несколькими атомами галоида, предпочтительно одним, двумя или тремя атомами галоида.

"(С₁-С₈)галоидалкоксигруппа", как используется в контексте, означает (C₁-С₈)-алкоксигруппу, как определено выше, замещенную одним или несколькими атомами галоида, предпочтительно одним, двумя или тремя атомами галоида.

"(С₃-С₈)циклоалкил", как этот термин используется в контексте, означает циклоалкил, содержащий от 3 до 8 кольцевых углеродных атомов, например моноциклическую группу, как, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил, любая из которых может быть замещена одной или несколькими, обычно одной или двумя, (C₁-С₄)алкильными группами, или бициклическую группу, как, например, бициклогептил или бициклооктил. Предпочтительно "(С₃-С₈)циклоалкил" означает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил.

"Ацил", как используется в контексте, означает алкилкарбонил, например (С₁-С₈)алкилкарбонил, где (С₁-С₈)алкил может быть одной из (С₁-С₈)алкильных групп, упомянутых выше, необязательно замещенной одним или несколькими атомами галогена; циклоалкилкарбонил, например (С₃-С₈)циклоалкилкарбонил, где (С₃-С₈)-циклоалкил может быть, например, циклопропилом, циклобутилом, циклопентилом, циклогексилом, циклогептилом или циклооктилом; 5- или 6-членный гетероциклил-карбонил, содержащий в кольце один или два гетероатома, выбранные из азота, кислорода и серы, как, например, фурилкарбонил, тетрагидрофурилкарбонил, пирролидинилкарбонил, пиперидинилкарбонил или пиридилкарбонил; арилкарбонил, например (С₆-С₁₀)арилкарбонил, как, например, бензоил; или аралкилкарбонил, например (С₆-С₁₀)арил(С₁-С₄)алкилкарбонил, как, например, бензилкарбонил или фенилэтилкарбонил.

"(С₁-С₈)алкоксикарбонил", как используется в контексте, означает (С₁-С₈)-алкоксигруппу, как определено выше, связанную через ее атом кислорода с карбонильной группой.

"(С₁-С₈)галоидалкоксикарбонил", как используется в контексте, означает (С₁-С₈)галоидалкоксигруппу, как определено выше, связанную через ее атом кислорода с карбонильной группой.

"(С₁-С₈)гидроксиалкоксикарбонил" и "(С₁-С₈)алкокси(С₁-С₈)алкоксикарбонил", как они используются в контексте, означают (С₁-С₈)алкоксикарбонил, как определено выше, в котором (С₁-С₈)алкоксигруппа замещена гидроксилом или дополнительной (С₁-С₈)алкоксигруппой соответственно.

"Карбокси(С₁-С₈)алкоксигруппа", как используется в контексте, означает (С₁-С₈)алкоксигруппу, как определено выше, замещенную карбоксилом.

"Галоген" или "галоид", как используется в контексте, может быть фтором, хлором, бромом или иодом, предпочтительно это фтор, хлор или бром.

R¹ может означать, например, фенил, необязательно замещенный одним или несколькими электроноакцепторными заместителями, предпочтительно выбранными из циангруппы, галогена, карбоксила, аминокарбонила, (С₁-С₈)галоидалкила или (С₁-С₈)-галоидалкоксигруппы, предпочтительно одним или двумя такими заместителями, и/или необязательно замещенный (С₁-С₈)алкилом, гидроксилом, (С₁-С₈)алкоксигруппой или (С₁-С₈)алкилтиогруппой, или R¹ может быть гетероциклической ароматической группой, содержащей до 10 кольцевых атомов и от 1 до 4 кольцевых гетероатомов, предпочтительно выбранных из азота, кислорода и серы, например гетероциклической группой, как, например, фурил, тиенил, пирролил, имидазолил, пиразолил, фуразанил, триазолил, тетразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, пиридил, пиримидил, пиридазинил, триазинил, индолил, изоиндолил или бензимидазолил, такая гетероциклическая группа может быть незамещенной или замещенной, например, как минимум, одним (С₁-С₈)алкилом, галогеном или (С₁-С₈)алкоксигруппой. Предпочтительные группы R¹ включают (а) фенил, замещенный циангруппой, галогеном (в особенности, фтором или хлором), карбоксилом или (С₁-С₄)галоид-алкоксигруппой, и необязательно (С₁-С₄)алкилом или (С₁-С₄)алкоксигруппой, (б) фенил, замещенный (С₁-С₄)алкоксигруппой и (в) ароматическую гетероциклическую группу с 5 или 6 атомами в кольце и одним или двумя кольцевыми гетероатомами.

R² может быть, например, (С₃-С₈)циклоалкильной группой, как, например, циклопропил, метилциклопропил, циклобутил, циклопентил, метилциклопентил, циклогексил, метилциклогексил, диметилциклогексил, циклогептил, бициклогептил или циклооктил, необязательно замещенной, как минимум, одним заместителем, выбранным из (С₁-С₈)алкила, (С₁-С₈)алкоксигруппы, карбоксила, (С₁-С₈)алкоксикарбонила, (С₁-С₈)галоидалкоксикарбонила, (С₁-С₈)гидроксиалкоксикарбонила, (С₁-С₈)-алкокси(С₁-С₈)алкоксикарбонила, аминокарбонила, (С₁-С₈)алкиламинокарбонила, ди((С₁-С₈)алкил)аминокарбонила, гидроксила, ацила или (С₁-С₈)алкила, необязательно замещенного гидроксилом, циангруппой, карбоксилом или (С₁-С₈)алкоксикарбонилом. Предпочтительно R² означает (С₅-С₇)циклоалкил, замещенный (С₁-С₄)алкилом, карбоксилом, (С₁-С₈)алкоксикарбонилом или аминокарбонилом.

Предпочтительные соединения формулы I в свободной форме или в виде соли включают такие, где

R¹ означает фенил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из циангруппы, галогена, карбоксила или аминокарбонила, и необязательно (С₁-С₈)алкоксигруппой, или R¹ означает фенил, замещенный (С₁-С₄)алкоксигруппой, гидроксилом или (C₁-С₄)алкилтиогруппой, и

R² означает (С₃-С₈)циклоалкил, необязательно замещенный, как минимум, одним заместителем, выбранным из (С₁-С₄)алкила, карбоксила, (C₁-С₈)алкоксикарбонила или аминокарбонила.

Другие предпочтительные соединения формулы I в свободной форме или в виде соли включают такие, где

R¹ означает фенил, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из циангруппы, галогена, карбоксила или аминокарбонила, в мета-положении к указанному нафтиридиновому кольцу и необязательно (С₁-С₄)алкоксигруппой в орто-положении к указанному нафтиридиновому кольцу, или R¹ означает фенил, замещенный (С₁-С₄)алкоксигруппой в мета-положении к указанному нафтиридиновому кольцу, и

R² означает (С₅-С₇)циклоалкил, необязательно замещенный, как минимум, одним заместителем, выбранным из карбоксила и (C₁-С₄)алкоксикарбонила.

Другие предпочтительные соединения формулы I в свободной форме или в виде соли включают такие, где

R¹ означает фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, циангруппы, (С₁-С₈)алкила, (С₁-С₈)алкилтиогруппы, -SO-(С₁-С₈)алкила, (С₁-С₈)алкоксигруппы и (С₁-С₈)галоидалкоксигруппы, или фенил, конденсированный с гетероциклическим кольцом, содержащим от 3 до 8 кольцевых атомов, из которых до 4 атомов могут быть углеродными атомами и до 4 атомов могут быть гетероатомами; и

R² означает (С₃-С₈)циклоалкил, необязательно замещенный, как минимум, одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из карбоксила и карбокси(С₁-С₈)алкоксигруппы.

Кроме того, предпочтительные соединения формулы I в свободной форме или в виде соли включают такие, где

R¹ означает фенил, необязательно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, циангруппы, (С₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)алкилтиогруппы, -SO-(С₁-С₄)алкила, (С₁-С₄)алкоксигруппы и (С₁-С₄)галоидалкоксигруппы, или фенил, конденсированный с гетероциклическим кольцом, содержащим 5 или 6 кольцевых атомов, из которых до 4 атомов могут быть углеродными атомами и до 2 атомов могут быть гетероатомами; и

R² означает (С₅-С₇)циклоалкил, необязательно замещенный, как минимум, одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из карбоксила и карбокси(С₁-С₄)алкоксигруппы.

Соединения, представленные формулой I, способны образовывать кислотно-аддитивные соли, в частности фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединений формулы I включают соли неорганических кислот, например галоидводородных кислот, как, например, фтористоводородная кислота, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота или иодистоводородная кислота, азотной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, и органических кислот, например алифатических монокарбоновых кислот, как, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота, алифатических гидроксикислот, как, например, молочная кислота, лимонная кислота, винная кислота или яблочная кислота, дикарбоновых кислот, как, например, малеиновая кислота или янтарная кислота, ароматических карбоновых кислот, как, например, бензойная кислота, п-хлорбензойная кислота, дифенилуксусная кислота или трифенилуксусная кислота, ароматических гидроксикислот, как, например, о-гидроксибензойная кислота, п-гидроксибензойная кислота, 1-гидроксинафталин-2-карбоновая кислота или 3-гидроксинафталин-2-карбоновая кислота, и сульфокислот, как, например, метансульфокислота или бензолсульфокислота.

Такие соли могут быть получены из соединений формулы I с помощью известных методик получения солей.

Соединения формулы I, содержащие кислотные группы, например карбоксильные, также способны образовывать соли с основаниями, в частности с фармацевтически приемлемыми основаниями, такими, которые хорошо известны в данной области; такие подходящие соли включают соли металлов, особенно соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, как, например, натриевые, калиевые, магниевые или кальциевые соли, или соли с аммиаком или с фармацевтически приемлемыми органическими аминами или гетероциклическими основаниями, как, например, этаноламины, бензиламины или пиридин. Такие соли могут быть получены из соединений формулы I с помощью известных методик получения солей.

Соединения формулы I в свободной форме или в виде соли могут существовать в стереоизомерных формах в соответствии с расположением остатков, присоединенных к циклоалифатическому кольцу. Изобретение охватывает и отдельные такие изомеры, то есть цис- и транс-изомеры, и их смеси. Там, где R¹ или R² содержат асимметрический атом углерода, соединения формулы I в свободной форме или в виде соли существуют в виде отдельных оптически активных изомерных форм или в виде их смесей, например в виде рацемических или диастереомерных смесей. Изобретение охватывает как отдельные оптически активные R- и S-изомеры, так и их смеси, например рацемические или диастереомерные смеси.

Конкретными особенно предпочтительными соединениями формулы I являются соединения, описанные далее в примерах.

Настоящее изобретение также предоставляет способ получения соединений формулы I в свободной форме или в виде соли, который включает

(i) (А) взаимодействие соединения формулы II

необязательно защищенного, где R¹ является таким, как определено ранее, и L является уходящим атомом или уходящей группой, например галогеном, или алифатической, или ароматической сульфонилоксигруппой, как, например, трифторметилсульфонилоксигруппа, с соединением формулы III

необязательно защищенного, где R² является таким, как определено ранее, и Х является уходящим атомом или уходящей группой, которая реагирует с L в формуле II с образованием прямой связи между R² и указанным нафтиридиновым кольцом, затем, если требуется, проводят снятие защиты;

(Б) реакцию соединения формулы I, где R² означает циклоалкил, замещенный (С₁-С₈)алкоксикарбонильной группой, с целью превращения алкоксикарбонильной группы в карбоксильную группу;

(В) для получения соединений формулы I, где R² является циклоалифатической группой, замещенной карбокси(С₁-С₈)алкоксигруппой, гидролиз соединения формулы I, где R² является циклоалифатической группой, замещенной (С₁-С₈)-алкоксикарбонил(С₁-С₈)алкоксигруппой; или

(Г) для получения соединений формулы I, где R¹ означает фенил, замещенный -SO-(С₁-С₈)алкилом, окисление соединения формулы I, где R¹ означает фенил, замещенный (С₁-С₈)алкилтиогруппой; и

(ii) выделение продукта в свободной форме или в виде соли.

Там, где L в формуле II является ароматической сульфонилоксигруппой, Х может быть, например, группой YM-, где Y означает галоид, например иод, и М означает металл, например цинк или магний.

Вариант (А) способа может быть осуществлен, применяя известные методики для реакции уходящих атомов или групп или аналогичные, например, описанные далее в примерах. Там, где Х в формуле III означает YM-, соединение YMR² может быть образовано in situ при реакции металла М и галогенида YR², где М является цинком, такая in situ реакция обычно проходит в присутствии дибромэтана и триалкилсилил-галогенида, предпочтительно в растворителе, например в простом эфире, как, например, тетрагидрофуран (ТТФ), подходящими являются температуры реакции от 25 до 50°С. Реакция соединения 5 формулы II с YMR² может быть осуществлена в присутствии катализатора из переходного металла, в частности катализатора, представляющего комплекс палладий-кетон, 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцена и галогенида четвертичного аммония, как, например, тетрабутиламмонийиодид, обычно в растворителе, например в смеси простого эфира, например, ТГФ, и N-метилпирролидона (NMP), подходящие температуры реакции лежат в пределах от 25 до 50°С. Если желательно уменьшить возможность протекания реакций с участием других функциональных групп, а не тех, которые участвуют в желаемой реакции, то такие функциональные группы могут быть защищены с помощью подходящих защитных групп.

Вариант (Б) способа может быть осуществлен с применением известных методик превращения алкоксикарбонильных групп в карбоксильные группы, например, путем гидролиза водными гидроокисями щелочных металлов, или аналогично тому, как описано в дальнейшем в примерах.

Вариант (В) способа может быть осуществлен с применением известных методик гидролиза сложных эфиров в карбоновые кислоты, например с помощью трифторуксусной кислоты или аналогично тому, как описано ниже в примерах.

Вариант (Г) способа может быть осуществлен с применением известных методик окисления сульфанильных групп в сульфинильные группы, например, используя озон или перекись водорода, или аналогично тому, как описано ниже в примерах.

Соединения формулы II могут быть получены, как описано в международной заявке на патент WO98/18796 или аналогично, например, как описано ниже в примерах. Соединения формулы III могут быть получены по известным методикам, например, in situ, как описано выше и (в примерах) ниже.

Там, где ссылаются на защищаемые функциональные группы или на защитные группы, последние могут быть выбраны в соответствии с природой функциональной группы, например, как описано в "Protective Groups in Organic Synthesis", T.W.Green и P.G.M.Wuts, изд-во John Wiley & Sons Inc, второе издание, 1991, в этой ссылке также описываются методики, подходящие для замены защитных групп водородом.

Соединения формулы I в свободной форме могут быть превращены в соли и наоборот общепринятым способом. Соединения в свободной форме или в виде соли могут быть получены в виде гидратов или сольватов, содержащих растворитель, использованный для кристаллизации. Соединения формулы I могут быть выделены из реакционных смесей и очищены обычным способом. Изомеры, как, например, энантиомеры, могут быть получены общепринятым способом, например, с помощью фракционной кристаллизации или асимметрического синтеза из соответствующим образом асимметрически замещенных, например, оптически активных, исходных веществ.

Соединения формулы I в свободной форме или в виде соли полезны в качестве фармацевтических препаратов. Соответственно изобретение также предоставляет соединение формулы I в свободной форме или в виде соли для применения в качестве фармацевтического средства. Соединения формулы I в свободной форме или в виде соли, упоминаемые в дальнейшем альтернативно как "вещества по изобретению", проявляют ингибирующую активность в отношении изофермента циклической нуклеотидной фосфодиэстеразы (PDE), селективную для изофермента типа 4. Вещества по изобретению обладают противовоспалительными свойствами, свойствами против повышенной реактивности дыхательных путей и бронхорасширяющими свойствами. Они также обладают иммуноподавляющей активностью и ингибирующей секрецию TNF-α активностью. Фармакологическая активность может быть продемонстрирована с помощью следующих способов исследования, например, представленных ниже:

Анализ ингибирования изофермента PDE4

Клонирование: Конструкции по технологии GATEWAY с фланкирующей последовательностью кДНК PDE4, содержащие кодирующие участки трех изоферментов, человеческого PDE4A, человеческого PDE4B и человеческого PDE4D, генерируют с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и перемещают в бифункциональный вектор pDONOR-201 согласно GATEWAY. Дополнительно для облегчения очистки белка с помощью PCR вводится 6-гистидиновая метка по концевому карбоксилу каждой из конструкций. После проверки последовательностей конструкции PDE4 перемещают в экспрессионный вектор pDEST-8 согласно GATEWAY. Позитивные рекомбинанты отбирают и перемещают в штамм DH10Bac E.coli и продуцированную бакмиду искусственно вводят в клетки SF21, используя технологию Вас-То-Вас (Invitrogen Life Technologies). Позитивные продукты трансфекции отбирают и применяют с целью генерации вирусных культур с высоким титром для использования при экспрессии белка.

Экспрессия PDE4: Клетки Sf21 выращивают до плотности 2Х106 клеток/мл и заражают человеческими PDE4A, PDE4B или PDE4D3, содержащими бакуловирус, до множественности заражения (m.o.i.) 1 в течение 72 часов. Инфицированные клетки собирают путем центрифугирования при 1,400 g в течение 4 минут при 4°С и осадок из клеток замораживают при -80°С. Клетки насекомых Sf21 (Spodoptera frugiperda 21) регулярно сохраняются при плотностях между 3Х105 и 3Х106 клеток/мл в не содержащей сыворотки среде (SF00) (Invitrogen Life Technologies). Клетки Sf21 (1X109) повторно суспендируют в 100 мл холодного (4°С) буфера для лизиса (50 мМ Na₂HPO₄, 200 мМ NaCl, 10 мМ имидазол). Клетки инкубируют на льду в течение 30 минут, затем центрифугируют при 15,000 g в течение 20 минут при 4°С.

Очистка PDE4: 6-Гистидин-меченые белки PDE4 выделяют из неочищенных клеточных лизатов с использованием осуществляемой периодическим способом очистки с помощью Ni-NTA (никелевая соль нитрилотриуксусной кислоты) (QIAGEN). Смолу с Ni-NTA сначала предварительно промывают для удаления этанольного консерванта и уравновешивают буфером для лизиса. Прибавляют клеточный лизат (10 мл 50% суспензии смолы с Ni-NTA на 50 мл лизата) и осторожно вращают в перемешивающем устройстве при 4°С в течение 1-2 часов. Образец затем центрифугируют при 1,000 g в течение 5 минут при 4°С, используя стендовую центрифугу Денли. Надосадочную жидкость удаляют и смолу промывают три раза 50 мл охлажденного до температуры льда буфера для промывки (50 мМ Na₂HPO₄, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазол), затем центрифугируют при 1,000 g в течение 5 минут при 4°С. 6-Гистидин-меченый белок вымывают со смолы с помощью 3×5 мл буфера для элюирования, охлажденного до температуры льда (50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол) и собирают путем центрифугирования при 1,000 g в течение 5 минут при 4°С. Надосадочные жидкости затем объединяют перед обменом буфера и концентрируют, используя концентратор VivaScience, 20 мл 5К 0,2 мкМ. Образцы в аликвотных количествах хранят при -20°С.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE): Образцы очищенного PDE4 анализируют с помощью SDS-PAGE, используя мини-гели (Novex), градиент 8-16%, и образцы денатурируют при 100°С в восстанавливающем буфере (62 мМ трис-HCl с рН 6,8, 10% глицерина, 3% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптоэтанола, 0,02% бромфенола синего) в течение 3 минут перед загрузкой. Также загружают стандарты с определенной молекулярной массой, предварительно окрашенные красителем Novex SeeBlue. Гели работают при постоянном токе в 25 мА. Гели окрашивают с помощью красителя кумасси синего (GelCode Colloidal Coomassie G-250) (Pierce) согласно методике производителя.

Анализ путем вестерн-блотирования: Образцы анализируют на гелях Novex, градиент 8-16%, как описано выше. Затем гель влажным подвергают блотированию на мембрану из поливинилиденфторида Millipore Immobilon-P, применяя способ переноса в резервуаре с помощью буфера для переноса, содержащего 25 мМ трис-HCl, рН 8,8, 192 мМ глицин, 15% метанола, при 80 мА в течение 16 часов. Иммунозондирование осуществляют в буфере TTBS (20 мМ трис-HCl с рН 7,6, 0,9% (мас./об.) NaCl, 0,05% (об./об.) тритона Х-100, 0,5% (мас./об.) казеина) с моноклональным антителом против 6 гистидина (QIAGEN) при разбавлении 1:1000. В качестве вторичного антитела (Sigma A9919) применяют конъюгат противомышиного иммуноглобулина G со щелочной фосфатазой при разбавлении 1:10000 и белки обнаруживают с помощью субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитротетразолий голубой (BCIP/NBT), приготовленного из таблеток (Sigma) в соответствии с методикой производителя.

Анализ PDE4: Исследование основывается на технологии анализа эффекта сцинтилляционной близости (SPA), разработанного фирмой Amersham Pharmacia Biotech. Фермент разбавляют буфером для разбавления фермента (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту) для обеспечения гидролиза 10-30% общего количества субстрата во время анализа. Ферментативная реакция начинается при прибавлении 10 мкл разбавленного фермента к 80 мкл субстрата (0,1 мкКи [3H]-цАМФ, 1 мкМ цАМФ) и 10 мкл раствора ингибитора в 96-ячеечный планшет для титрования. После 30-60 минут инкубирования при комнатной температуре реакцию останавливают путем прибавления 50 мкл шариков фосфодиэстеразы для SPA (20 мг/мл). Через 30 минут содержимое планшета центрифугируют (3000 g, 10 минут) и проводят подсчет (Packard TopCount).

Исходные растворы ингибитора готовят в 100%-ном диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавляют ДМСО/водой для обеспечения 10 концентраций для охватывания диапазона ингибирования 0-100%. Концентрация ДМСО сохраняется постоянной и составляет 1% (об./об.) в течение анализа.

Концентрацию, при которой происходит 50%-ное ингибирование (IC₅₀), определяют общепринятым способом из кривых зависимости ингибирования от концентрации. В рамках группы изоферментов PDE4 вещества по изобретению обычно проявляют селективность при ингибировании изофермента PDE4D относительно PDE4A, PDE4B и PDE4C. Соединения из примеров 1, 3, 10, 12, 14 и 15 имеют значения IC₅₀ 38, 9, 25, 21, 57 и 9 нМ соответственно для ингибирования PDE4D в приведенном выше анализе.

Принимая во внимание ингибирование веществами по изобретению связывания PDE4, вещества по изобретению являются полезными для лечения состояний, опосредствованных PDE4, в частности воспалительных состояний. Лечение в соответствии с изобретением может быть симптоматическим или профилактическим.

Соответственно вещества по изобретению полезны при лечении воспалительных или обструктивных заболеваний дыхательных путей, приводя в результате к уменьшению поражения тканей, снижению повышенной реактивности бронхов, коррекции или развития болезни. Воспалительные или обструктивные заболевания дыхательных путей, к которым применимо настоящее изобретение, включают астму любого типа или происхождения, включая как врожденную (неаллергическую) астму, так и приобретенную (аллергическую) астму, легкую астму, астму средней тяжести, тяжелую астму, бронхиальную астму, вызванную нагрузкой астму, профессиональную астму и астму, вызванную бактериальной или вирусной инфекцией. Понятно, что лечение астмы охватывает лечение больных, например, в возрасте моложе 4 или 5 лет, у которых проявляются симптомы затрудненного дыхания с присвистом и которым ставят диагноз или которые диагностируются как "младенцы или дети младшего возраста со свистящим дыханием", это установленная категория больных особого медицинского внимания и теперь часто идентифицируемая как ранние астматики или астматики в начальной стадии болезни (Для удобства на это особое астматическое состояние ссылаются как на "синдром дышащих со свистом детей младшего возраста".)

Об эффективности профилактики при лечении астмы свидетельствуют уменьшенная частота или тяжесть симптоматического приступа, например острого астматического приступа или приступа бронхостеноза, улучшенная легочная функция или положительная динамика в случае повышенной реактивности дыхательных путей. Об этом может также свидетельствовать уменьшенная потребность в другой симптоматической терапии, то есть терапии, предназначающейся для ограничения или остановки развития симптоматического приступа, когда он происходит, например противовоспалительной (например, кортикостероидами) или терапии с помощью бронхорасширяющих средств. Польза профилактики при астме может, в частности, быть очевидной для больных, склонных к "утренней глубокой пальпации". "Утренняя глубокая пальпация" является узнаваемым астматическим синдромом, обычным для существенного процента астматиков и характеризующимся астматическим приступом, например, между примерно 4 и 6 часами утра, то есть во время, обычно существенно отдаленное от любой проведенной симптоматической терапии астмы.

Другие воспалительные или обструктивные заболевания и состояния дыхательных путей, к которым применимо настоящее изобретение, включают острое поражение легкого (ALI), острый респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), хроническое обструктивное легочное заболевание, заболевание дыхательных путей или легкого (COPD, COAD или COLD), включая хронический бронхит или связанную с этим одышку, эмфизему, а также обострение повышенной реактивности дыхательных путей в результате другой лекарственной терапии, в частности терапии другим вдыхаемым лекарственным средством. Изобретение также применимо для лечения бронхита любого вида и происхождения, включая, например, острый, арахидный, катаральный, крупозный, хронический или гнойный туберкулезный бронхит. Другие воспалительные или обструктивные заболевания дыхательных путей, к которым применимо настоящее изобретение, включают пневмокониоз (воспалительное, обычно профессиональное, заболевание легких, часто сопровождающееся обструкцией дыхательных путей, хроническое или острое, и вызываемое частым вдыханием различной пыли) любого вида или происхождения, включая, например, алюминоз, антракоз, асбестоз, халикоз, птилоз, сидероз, силикоз, табакоз и биссиноз.

Учитывая противовоспалительную активность веществ по изобретению, их влияние на повышенную реактивность дыхательных путей и их характеристики в отношении ингибирования изоферментов фосфодиэстеразы, в частности, в качестве селективных ингибиторов типа 4, вещества по изобретению полезны для лечения, в частности, профилактического лечения, обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей. Таким образом, при продолжительном и регулярном применении в течение длительных периодов времени вещества по изобретению полезны для обеспечения улучшенной защиты против рецидива бронхостеноза или другого симптоматического приступа, являющегося следствием обструктивного или воспалительного заболевания дыхательных путей, или для регулирования, улучшения или изменения базального статуса такого заболевания.

Принимая во внимание их бронхорасширяющую активность, вещества по изобретению полезны в качестве бронхорасширяющих средств, например, для лечения хронического или острого бронхостеноза, например для симптоматического лечения обструктивного или воспалительного заболевания дыхательных путей.

Принимая во внимание их активность в качестве селективных ингибиторов высвобождения TNF-α, вещества по изобретению также полезны для понижающей регуляции или ингибирования высвобождения TNF-α, например, при лечении заболеваний или состояний, в которые вовлечено высвобождение TNF-α или высвобождение играет промежуточную роль, например, заболеваний или состояний, имеющих этиологию, включающую или заключающую в себе патологическое, например, нежелательное избыточное или нерегулируемое высвобождение TNF-α, в частности, для лечения кахексии или эндотоксинового шока и для лечения СПИД [сравните Sharief и др. Mediators of Inflammation, 1, 323-338 (1992)], лечения кахексии, связанной с патологическим высвобождением TNF-α или уровнями TNF-α в сыворотке крови любого происхождения, включая кахексию, являющуюся следствием, например, бактериального, вирусного или паразитарного, заражения или недостаточности или ухудшения гуморальной или другой функции организма, например почечной функции, лечения злокачественной, малярийной и вызванной глистами кахексии, кахексии в результате дисфункции гипофиза, щитовидной железы или вилочковой железы, а также обусловленной уремией кахексии и, в частности, лечения связанной со СПИД кахексии, то есть кахексии, вытекающей из или связанной с заражением вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

Способ по изобретению также применим для лечения септического шока, например состояний шока в результате бактериального заражения. В этом отношении следует отметить, что настоящее изобретение обеспечивает способ лечения септического шока как такового, а также состояний, вытекающих из или симптоматических для септического шока, например респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS).

Вещества по изобретению далее применимы для лечения заболевания в результате заражения ВИЧ, например СПИД, например, для уменьшения интенсивности симптомов заболевания или регулирования прогрессирования такого заболевания.

Принимая во внимание показатели веществ по изобретению, относящиеся к ингибированию изоферментов PDE и/или ингибированию высвобождения TNF-α, а также их иммунодепрессивную активность, вещества по изобретению также полезны в качестве иммунодепрессивных средств, например, для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, для лечения аутоиммунных заболеваний, в которые вовлечены воспалительные процессы или которые включают воспалительный компонент или этиологию, или в качестве противовоспалительных средств для лечения воспалительных заболеваний, в частности для лечения воспалительных заболеваний, в которые вовлечены аутоиммунные реакции или которые включают аутоиммунный компонент или этиологию. Примеры таких заболеваний, к которым применимо настоящее изобретение, включают аутоиммунные гематологические нарушения (например, гемолитическая анемия, апластическая анемия, чистая эритроцитарная анемия или тромбоцитопения неясного происхождения), системную красную волчанку, полихондрит, склеродермию, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую миастению, синдром Стивенса-Джонсона, синдром мальабсорбции неясного происхождения, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, альвеолит, хронический аллергический пневмонит, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз печени, юношеский диабет (сахарный диабет типа I), увеит (передний и задний), кератоконъюнктивит высушивающий и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит и гломерулонефрит (с и без нефротического синдрома, например, включая нефротический синдром неясного происхождения или нефропатию с минимальными изменениями), а также воспалительные и/или гиперпролиферативные кожные заболевания, как, например, псориаз, атонический дерматит, пузырчатку и, в частности, контактный дерматит, например аллергический контактный дерматит.

Вещества по изобретению особенно полезны для лечения артрита и других ревматических или воспалительных заболеваний, особенно для лечения ревматоидного артрита.

В качестве иммунодепрессантов вещества по изобретению, кроме того, полезны для предупреждения отторжения трансплантата, например для поддержания аллогенных трансплантатов органов или им подобных, например трансплантатов почки, печени, сердца, сердца-легкого, кишки, костного мозга, кожи или роговичного трансплантата.

Принимая во внимание показатели в отношении ингибирования изоферментов PDE, в частности характеристики в качестве селективных ингибиторов типа 4, вещества по изобретению, кроме того, полезны для лечения заболеваний, включающих снижение кальция в тканях, в частности дегенеративных заболеваний костей и суставов, включающих снижение кальция, особенно остеопороза. В этой связи они, кроме того, полезны для лечения аллергических воспалительных заболеваний, как, например, ринит, конъюнктивит, атопический дерматит, крапивница и аллергические заболевания желудочно-кишечного тракта; в качестве вазодилататоров, например, для лечения стенокардии, гипертензии, ишемии/поражения реперфузии, застойной сердечной недостаточности и деменции в результате множественных инфарктов; и для лечения других состояний, когда показано ингибирование PDE 4, например депрессии, состояний и заболеваний, характеризующихся ухудшенной познавательной функцией, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и удар.

Вещества по изобретению также полезны в качестве дополнительных терапевтических средств в комбинац