Модифицированные анти-egfr антитела с уменьшенной иммуногенностью

Модифицированные анти-egfr антитела с уменьшенной иммуногенностью

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам, которые направлены на EGF рецептор (HER1) для назначения главным образом человеку, и, в частности, для терапевтического использования при опухолях. Антитела представляют собой модифицированные антитела, в которых модификация приводит к уменьшенной склонности антитела вызывать иммунный ответ при введении человеку. Изобретение, в частности, относится к модификации анти-EGFR антитела 425 в его различных формах и их фрагментах, которая приводит к получению вариантов Mab 425, которые являются существенно неиммуногенными или менее иммуногенными, чем любой их немодифицированный эквивалент, при использовании in vivo. Изобретение также относится к пептидному эпитопу Т-клеток, который имеет происхождение от указанного немодифицированного антитела, с помощью которого возможно создать модифицированные варианты Mab 425 с уменьшенной иммуногенностью.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рецептор эпидермального фактора роста (EGF рецептор или EGFR), также известный как c-erbB I/Her 1, и продукт neu онкогена (также известный как с-erbB2/Her 2) являются членами суперсемейства EFG рецептора, которое принадлежит большому семейству рецепторов тирозинкиназы. Они взаимодействуют на поверхности клетки с определенными факторами роста или природными лигандами, такими как EGF или альфа TGF, таким образом активируя рецептор тирозинкиназы. Каскад нисходящего потока, сигнализирующих белков активируется, что в общем приводит к изменению экспрессии гена и увеличению скорости роста.

C-erbB2 (Her 2) - трансмембранная тирозинкиназа, имеющая молекулярную массу около 185000, со значительной гомологией с рецептором EGF (Her 1), хотя специфический лиганд к Her 2 пока еще четко не идентифицирован.

EGF рецептор представляет собой трансмембранный гликопротеин, который имеет молекулярную массу 170000 и найден во многих типах клеток эпителия. Он активируется по крайней мере тремя лигандами, EGF, TGF-α (преобразующий фактор роста альфа) и амфирегулином. Как было показано, эпидермальный фактор роста (EGF) так и преобразующий фактор роста альфа (TGF-α), связывается с EGF рецептором и приводит к клеточной пролиферации и росту опухоли. Эти факторы роста не связываются с Her 2 (Ulrich и Schlesinger, 1990, Cell 61, 203). В отличие от нескольких семейств факторов роста, которые вызывают димеризацию рецептора в силу их димерной природы (например, PDGF), мономерные факторы роста, такие как EGF, содержат два связующих места для их рецепторов, и, поэтому, могут кросс-связывать два соседних EGF рецептора (Lemmon и др., 1997, EMBO J. 16, 281). Димеризация рецептора является существенной для стимулирования внутренней каталитической активности и для автофосфорилирования рецепторов фактора роста. Следует отметить, что рецепторы протеин тирозинкиназ (PTKs) способны претерпевать как гомо-, так и гетеродимеризацию.

Клинические исследования показали, что как EGF рецептор так и C-erbB2 с избытком присутствуют в определенных типах опухолей, особенно, груди, яичника, пузыря, ободочной кишки, почки, рака головы и шеи, сквамозного рака легкого (Mendelsohn, 1989, Cancer Cells 7, 359; Mendelsohn, 1990, Cancer Biology 1, 339). Поэтому эти наблюдения стимулировали до клинические исследования, направленные на ингибирование функции EGF рецепторов человека или C-erbB2, как новые терапевтические подходы к лечению рака (см., например, Baselga и др., 1996, J. Clin. Oncol. 14, 737; Fan и Mendelsohn, 1998, Curr. Opin. Oncol. 10, 67). Сообщалось, что, например, антитела анти-EGF рецептора, а так же антитела анти-Her 2 показывают многообещающие результаты в терапии рака человека. Так, гуманизированное моноклональное антитело 4D5 (hMAb 4D5, HERCEPTIN®) - уже является продажным препаратом.

Было показано, что антитела анти-EGF рецептора, блокируя EGF и TGF-a связываясь с рецептором, подавляют пролиферацию опухолевой клетки. Принимая во внимание эти результаты, было произведено некоторое количество мышиных и крысиных моноклональных антител против EGF рецептора и проверена их способность подавлять рост опухолевых клеток in vitro и in vivo (Modjtahedi и Dean, 1994, J. Oncology 4, 277).

Гуманизированное моноклональное антитело 425 (hMAb 425) (US 5558864; ЕР 0531 472) и химерное моноклональное антитело 225 (cMAb 225) (Naramura и др., 1993. Cancer Immunol. Immunother. 37, 343-349.WO 96/40210), направленные на EGF рецептор, показали свою эффективность в клинических экспериментах.

С225 антитело продемонстрировало способность ингибировать EGF-опосредованный рост опухолевой клетки in vitro и подавлять формирование опухоли человека in vivo на бестимусных мышах. Антитело, кроме того, проявляет синергизм, главным образом, с некоторыми химиотерапевтическими средствами, (например, доксорубицин, адриамицин, таксол и цисплатин), чтобы ликвидировать опухоли человека in vivo на ксенотрансплантантных моделях мышей. Ye и др. (1999, Oncogene 18, 731) сообщили, что овариальные раковые клетки яичника человека могут успешно лечиться комбинацией cMAb 225 и hMAb 4D5.

Существует много случаев, при которых эффективность терапевтических белков ограничена нежелательной иммунной реакцией на терапевтический белок. Было показано, что некоторые мышиные моноклональные антитела являются перспективными в качестве терапевтических средств при лечении ряда заболеваний человека, однако в некоторых случаях они являются неудачными в связи с индукцией значительного уровня человеческого антимышиного антитела (НАМА) (SchroffR.W. и др. (1985), Cancer Res. 45: 879-885; Shawler D.L. и др. (1985) J.Immunol. 135: 1530-1535). Для моноклональных антител было предложено много способов уменьшения НАМА ответа (WO 89/09622; ЕР 0239400; ЕР 0438310; WO 91/06667). Эти подходы на основе рекомбинантной ДНК обычно ослабляют мышиную генетическую информацию при конечной конструкции антитела, усиливая тем самым генетическую информацию человека в полученной конструкции. Тем не менее, полученные "гуманизированные" антитела все же вызывают в ряде случаев иммунный ответ у пациентов (Issacs J.D. (1990) Sem.Immunol. 2: 449, 456: Rebello, P.R. и др. (1999) Transplantation 68: 1417-1420).

Антитела не являются единственным классом полипептидных молекул, которые назначаются в качестве терапевтического агента и против которых может развиваться иммунный ответ. Даже белки человеческого происхождения и те, которые имеют существующие у человека аминокислотные последовательности, могут индуцировать иммунный ответ у человека. Показательные примеры включают терапевтическое использование колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (Wadhwa M. и др. (1999) din. Cancer. Res. 5.: 1353-1361) и интерферон альфа-2 (Russo D. и др. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein R. и др. (1998) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413) среди прочих.

Принципиальным фактором в индукции иммунного ответа является присутствие в белке пептидов, которые могут стимулировать активность Т-клеток через презентацию молекул класса II МНС, так называемые "эпитопы Т-клеток". Такие потенциальные эпитопы Т-клеток обычно определяют как любую последовательность аминокислотных остатков, которая обладает способностью связываться с молекулой класса II МНС. Такие эпитопы Т-клеток можно измерять для установления МНС-связывания. Конечно, "эпитоп Т-клеток" означает эпитоп, который при связывании с молекулами МНС может узнаваться рецептором Т-клеток (TCR) и который может, по крайней мере, в принципе вызывать активацию этих Т-клеток посредством сцепления TCR для улучшения Т-клеточного ответа. Это, однако, обычно понимается как то, что определенные пептиды, которые являются такими, что связываются с молекулами класса II МНС, могут удерживаться в белковой последовательности, поскольку такие пептиды узнаются как "собственные" для организма, в который вводится конечный белок.

Известно, что определенные пептиды Т-клеточных эпитопов могут высвобождаться во время разрушения пептидов, полипептидов или белков внутри клеток и, следовательно, принимать участие в презентации молекулами основного комплекса гистосовместимости (МНС) для того, чтобы инициировать активацию Т-клеток. Для пептидов, представленных классом II МНС такая активация Т-клеток может потом вызывать, например, ответ антител путем прямой стимуляции В-клеток для получения таких антител.

Молекулы класса II МНС представляют собой группу высокополиморфных белков, которые играют центральную роль в отборе хелперных Т-клеток и активации. Человеческая лейкоцитарная антигенная группа DR (HLA-DR) представляет собой преобладающий изотип этой группы белков и является базисной точкой данного изобретения. Однако, изотипы HLA-DQ и HLA-DP выполняют сходные функции, таким образом, данное изобретение равно применимо к этим двум изотипам. Молекулы класса II МНС DR понимаются как альфа- и бета-цепи, которые встроены своими С-терминальными концами в клеточную мембрану. Каждый гетеродимер обладает лиганд-связывающим доменом, который связывается с пептидами и имеет длину, варьирующую от 9 до 20 аминокислот, несмотря на то, что связывающий желобок может включать максимум 11 аминокислот. Лиганд-связывающий домен включает аминокислоты с 1 по 85 альфа-цепи, и аминокислоты с 1 по 94 бета-цепи. DQ-молекулы, как было показано недавно, имеют гомологичную структуру и DP семейство белков, как ожидается, также является очень подобным. У человека известно около 70 различных аллотипов DR изотипа, для DQ известно 30 различных аллотипов, а для DP - 47 различных аллотипов. Каждая особь несет от двух до четырех аллелей DR, два аллеля DQ и два DP аллеля. Структура ряда DR молекул изучена, и эти структуры указывают на связывающий желобок пептида с открытой концевой структурой с рядом гидрофобных карманов, которые вовлекают гидрофобные остатки (остатки кармана) пептида (Brown и др. Nature (1993) 364: 33, Stern и др. (1994) Nature 368: 215). Полиморфизм, идентифицирующий различные аллотипы класса II молекул вносит свой вклад в широкое разнообразие различных связывающих поверхностей для пептидов в пределах связывающего желобка пептида и на популяционном уровне обеспечивает максимальную гибкость в отношении способности узнавать чужеродные белки и вызывать иммунный ответ к патогенным организмам.

Существует значительный полиморфизм в пределах лиганд-связывающего домена с четкими "семействами" в пределах различных географических популяций и этнических групп. Этот полиморфизм влияет на характеристики связывания пептид-связывающего домена, и таким образом, различные "семейства" DR молекул будут иметь специфичность для пептидов с различными свойствами последовательности, несмотря на то, что они могут в некоторой степени перекрываться. Эта специфичность определяет узнавание Th-клеточных эпитопов (класс II Т-клеточного ответа), которые в конечном счете ответственны за стимулирование выработки антител к Р-клеточным эпитопам, которые присутствуют в том же белке, из которого происходит Th-клеточный эпитоп. Таким образом, иммунный ответ на белок в индивидуальном человеческом организме в значительной степени находится под влиянием узнавания Т-клеточного эпитопа, что является функцией пептид-связывающей специфичности такого индивидуального HLA-DR аллотипа. Таким образом, для того, чтобы идентифицировать Т-клеточные эпитопы в пределах белка или пептида в контексте глобальной популяции, желательно рассматривать связывающие свойства такого широкого набора HLA-DR аллотипов, насколько это возможно, покрывая таким образом настолько высокий процент мировой популяции, насколько это возможно.

Иммунный ответ на терапевтический белок, такой, как белок в соответствии с изобретением, проходит via путь презентации пептида класса II МНС. Тут экзогенные белки вовлекаются в процесс и подвергаются обработке для презентации в ассоциации с молекулами класса II МНС DR, DQ или DP типа. Молекулы класса II МНС экспрессируются профессиональными антиген-презентирующими клетками (АРС), такими, как макрофаги и дендритные клетки, среди прочих. Сцепление пептидного комплекса класса II МНС с родственным Т-клеточным рецептором на поверхности Т-клеток, вместе с перекрестным связыванием определенных других сорецепторов, таких, как CD4 молекула, может индуцировать активированное состояние в Т-клетках. Активация ведет к высвобождению цитокинов, активирующих в дальнейшем другие лимфоциты, такие как В-клетки, для продуцирования антител или активирующих клеток Т-киллеров в качестве полного клеточного иммунного ответа. Способность пептида связывать данные молекулы класса II МНС для презентации на поверхности АРС зависит от числа факторов, в особенности от их первичной последовательности. Это будет влиять как на их склонность к протеолитическому расщеплению, так и на их сродство к связыванию в пределах связывающего желобка молекулы класса II МНС. Комплекс класс II МНС/пептид на поверхности АРС представляет собой центральную часть связывания для частного рецептора Т-клеток (TCR), способного узнавать детерминанты, которые обеспечиваются как открытыми остатками пептида, так и молекулой класса II МНС.

В области техники существуют способы для идентификации синтетических пептидов, способных к связыванию молекул класса II МНС (например, WO 98/52976 и WO 00/34317). Такие пептиды могут не функционировать как эпитопы Т-клеток во всех ситуациях, в частности, in vivo, благодаря путям процессирования и другим явлениям. Идентификация эпитопа Т-клеток представляет собой первый этап удаления эпитопа. Идентификация и удаление потенциальных эпитопов Т-клеток из белков была раскрыта ранее. В области техники существуют способы для получения возможности определения эпитопов Т-клеток обычно с помощью вычислительных средств исследования для узнавания участка последовательности в экспериментально определенных эпитопах Т-клеток или, альтернативно, при использовании вычислительных способов для прогнозирования пептидов, связывающих класс II МНС и, в частности, DR-связывающих пептидов. WO 98/52976 и WO 00/34317 обеспечивают вычислительные подходы к идентификации полипептидных последовательностей с потенциалом для связывания подмножества человеческих DR аллотипов класса II МНС. В этих способах, спрогнозированные эпитопы Т-клеток вычленяются при использовании целесообразных аминокислотных замен в первичной последовательности терапевтического антитела или белка, который не представляет собой антитела, имеющих происхождение как от человека, так и нечеловеческого происхождения.

Другие способы, использующие растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами, которые способны к связыванию с клонами Т-клеток образцов периферической крови человека или экспериментальных животных, применяются в области техники (Kern F. и др. (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. и др. (2001) TRENDS in Immunology 22: 583-588) и могут использоваться в стратегии идентификации эпитопа.

Как показано выше, и как следствие этого, желательно идентифицировать и удалить или, по крайней мере, уменьшить количество Т-клеточных эпитопов из данных, в принципе, терапевтически ценных, но изначально иммуногенных иммуноглобулинов, полипептидов или белков.

Модифицированный Mab 425 был получен ранее (US 5558864; ЕР 0531472) точно также как и химерная и гуманизированная версии с225 (WO 96/40210), но эти подходы были направлены на уменьшение имуногенности путем получения химерных и гуманизированных версий указанных антител из мышиной формы стандартными методами. Однако ни один из этих методов не признает важности эпитопов Т-клеток для иммуногенных свойств белка, не рассматривает прямого влияния указанных свойств на специфический и контролированный путь в соответствии со схемой данного изобретения.

Тем не менее, существует потребность в анти-EGFR антителах с улучшенными свойствами. Желательные усовершенствования включают альтернативные схемы и модальности для экспрессии и очистки указанного терапевтического средства, а также в особенности, улучшения биологических свойств иммуноглобулина. Существует особая потребность в улучшении in vivo характеристик при назначении человеку. В этой связи особенно желательно обеспечить анти-EGFR антитела, особенно MAb 425, с уменьшенным или отсутствующим потенциалом индукции иммунного ответа в человеческом организме.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ И ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение обеспечивает модифицированные формы анти-EGFR антитела, особенно MAb 425, в которых иммунные характеристики модифицированы путем уменьшения или удаления числа потенциальных эпитопов Т-клеток.

Изобретение раскрывает последовательности, идентифицированные в пределах первичной последовательности MAb 425 и являющиеся потенциальными эпитопами Т-клеток на основании потенциала связывания класса II МНС.

Изобретение раскрывает также специфические положения в пределах первичной последовательности молекулы в соответствии с изобретением, которые должны быть изменены посредством замен аминокислот, добавлений или делеций, без затрагивания биологической активности в принципе. В случаях, когда потеря иммуногенности может быть достигнута только путем одновременной потери биологической активности или авидности/специфичности антитела, возможно восстановить указанные параметры путем дальнейших изменений в пределах аминокислотной последовательности варианта антитела.

Изобретение раскрывает также способы получения таких модифицированных антител, главным образом, идентификации эпитопов Т-клеток, которые должны быть изменены для того, чтобы уменьшить или устранить иммуногенетические сайты.

Модифицированное анти-EGFR антитело в соответствии с изобретением, как ожидается, будет демонстрировать увеличенное время циркуляции в человеке и будет особенно полезно при хронических или рецидивирующих заболеваниях, как, например, в случае показаний. Данное изобретение обеспечивает модифицированные формы белков указанного антитела, которые, как ожидается, будут демонстрировать улучшенные свойства in vivo. Эти модифицированные молекулы анти-EGFR антитела могут использоваться в фармацевтических композициях.

Вкратце изобретение относится к следующим результатам:

- модифицированному антителу или его фрагменту, направленному на EGF рецептор (Нег1), которое является существенно неиммуногенным или менее иммуногенным, чем любое исходно иммуногенно немодифицированное антитело, направленное на тот же рецептор, когда подвергнуто иммунной системе определенного вида и по сравнению с немодифицированным антителом, где модифицированное антитело - по сравнению с исходно немодифицированным антителом - не содержит или содержит меньшее количество последовательностей эпитопов Т-клеток и / или МНС аллотипов, обладающих способностью связывать пептиды, производные из указанного немодифицированного антитела;

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором указанные исходно присутствующие эпитопы Т-клеток являются лигандами класса II МНС или пептидными последовательностями, которые демонстрируют способность стимулировать или связывать Т-клетки посредством презентации на классе II;

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором 1-9 аминокислотных остатков, предпочтительно один аминокислотный остаток в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток, изменен(ы);

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором изменение аминокислотных остатков представляет собой замену, добавление или делецию исходно присутствующего(их) аминокислотного(ых) остатка(ов) другим(ми) аминокислотным(ми) остатком(ами) в специфическом(их) положении(ях);

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором далее дополнительно производится замена, добавление или делеция специфической(их) аминокислоты(от) для восстановления биологической активности указанной молекулы;

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором изменение аминокислот выполняют в отношении гомологичной последовательности белка и/или в соответствии со способами моделирования in sili со,

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором указанное исходно иммуногенно немодифицированное антитело имеет последовательности, полностью или частично нечеловеческого происхождения;

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором указанное исходно иммуногенно немодифицированное антитело является химерным антителом или нечеловеческим антителом, включающим поверхностные остатки кроме тех, которые не являются близкими к CDR областям, которые происходят от соответствующих структур последовательностей человека (венированное антитело);

- соответственно указанному модифицированному антителу, в котором указанное исходно иммуногенно немодифицированное антитело является мышиным MAb 425, предпочтительно содержащим любую из последовательностей как показано в Таблице 5;

- последовательности ДНК, которая кодирует тяжелую и /или легкую цепь модифицированного антитела, как указано выше;

- фармацевтической композиции, включающей модифицированное анти-EGFR антитело, как указано выше, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом;

- соответствующей фармацевтической композиции или набору, включающему дополнительно фармакологически эффективное лекарственное средство, предпочтительно цитотоксическое средство, более предпочтительно химиотерапевтическое средство;

- способу производства модифицированного антитела или его фрагмента, направленного на EGF рецептор (Heri), которое является существенно неиммуногенным или менее иммуногенным, чем любое исходно иммуногенно немодифицированное антитело, направленное на тот же рецептор, когда подвергнуто иммунной системе определенного вида и по сравнению с немодифицированным антителом, и который включает следующие стадии: (i) определение аминокислотной последовательности тяжелой и /или легкой цепи исходно иммуногенно немодифицированного антитела или его части; (ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности антитела любым способом, включающим определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов; (iii) разработка новых вариантов последовательности с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных таким образом для существенного уменьшения или устранения активности эпитопов Т-клеток, как определено путем связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами, или путем связывания комплекса пептид-МНС с Т-клетками; (iv) конструирование таких вариантов последовательности с помощью техники рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами; и (v) необязательное повторение этапов (ii)-(iv);

- соответственно указанному способу, в котором стадию (iii) выполняют путем замены, добавления или делеции 1-9 аминокислотных остатков в любых исходно присутствующих эпитопах Т-клеток, необязательно в отношении гомологичной последовательности белка и/или в соответствии со способами моделирования in silico,

- соответственно указанному способу, в котором стадию (ii) выполняют с помощью следующих стадий: (а) выбора участка пептида, который имеет известную последовательность аминокислотных остатков; (b) последовательного отбора аминокислотных сегментов перекрывающихся участков аминокислотных остатков с предварительно определенным одинаковым размером и состоящих, по крайней мере, из трех аминокислотных остатков выбранного участка; (с) подсчета значения связывания молекулы класса II МНС для каждого выборочного сегмента путем суммирования определенных значений для каждой гидрофобной аминокислотной боковой цепи, которая присутствует в каждом выборочном сегменте аминокислотного остатка; и (d) идентификации, по крайней мере, одного из указанных сегментов, подходящих для модификации, основываясь на подсчитанной величине связывания молекулы класса II МНС этого сегмента для изменения общего значения связывания класса II МНС для пептида без существенного уменьшения терапевтической полезности пептида;

- соответственно указанному способу, в котором стадию (с) преимущественно выполняют при использовании функции подсчета Bohm, модифицированной для включения 12-6 составляющей отталкивания энергии комплекса лиганд-белок Ван дер Ваальса и составляющей конформационной энергии лиганда путем (1) обеспечения первой базы данных модели молекулы класса II МНС; (2) обеспечения второй базы данных возможного пептидного скелета для моделей молекул указанного класса II МНС; (3) отбора модели из указанной первой базы данных; (4) отбора возможного пептидного скелета из второй базы данных; (5) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; (6) определения значения связывающего сродства ко всем боковым цепям, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; и повторения стадий от (1) до (5) для каждой указанной модели и каждого указанного скелета;

- соответственно указанному способу, в котором используют исходно иммуногенно немодифицированное антитело, которое имеет последовательности, полностью или частично нечеловеческого происхождения;

- соответственно указанному способу, в котором указанное исходно иммуногенно немодифицированное антитело является химерным антителом или нечеловеческим антителом, включающим поверхностные остатки кроме тех, которые не являются близкими к CDR областям, которые происходят от соответствующих базовых структур последовательностей человека (венированное антитело);

- соответственно указанному способу, в котором указанное исходно иммуногенно немодифицированное антитело является мышиным антителом, предпочтительно мышиное MAb 425;

- использованию тринадцатимерного пептида эпитопа Т-клеток, предпочтительно по крайней мере 9 последовательных аминокислотных остатков указанного тринадцатимерного пептида эпитопа Т-клеток, имеющего потенциальную связывающую активность класса II МНС и созданного из иммуногенно немодифицированного антитела, для производства иммуногенно модифицированного антитела, которое существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, при использовании in vivo, по сравнению с указанным немодифицированным антителом, каждое антитело определено выше и в формуле изобретения.

Общий способ в соответствии с данным изобретением, ведущий к модифицированным анти-EGFR антителам, включает следующие стадии:

(a) определение аминокислотной последовательности антитела или его части;

(b) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности иммуноглобулина с помощью любого метода, включающего определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами;

(c) конструирование вариантов с новыми последовательностями с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных таким образом для существенного уменьшения или устранения активности Т-клеточного эпитопа, как определено связыванием пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами. Такие варианты последовательностей создаются таким путем для избежания создания новых потенциальных эпитопов Т-клеток путем вариации последовательности, до тех пор, пока не будет существовать новых потенциальных эпитопов Т-клеток, в свою очередь, модифицированных таким путем для существенного уменьшения или устранения активности эпитопов Т-клеток;и

(d) конструирование таких вариантов последовательности с помощью способов рекомбинантной ДНК и тестирование таких вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами в соответствии с хорошо известными способами рекомбинантных ДНК;

Идентификация потенциальных эпитопов Т-клеток в соответствии со стадией (b) может быть выполнена в соответствии со способами, описанными ранее в уровне техники. Приемлемые способы раскрыты в WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317; и могут быть предпочтительно использованы для идентификации предрасположенности пептидов, производных от ТРО, связываться с молекулой класса II МНС.

Другой очень эффективный способ для идентификации эпитопов Т-клеток путем вычисления описан в примере, который является предпочтительным воплощением в соответствии с изобретением.

На практике ряд вариантов иммуноглобулинов анти-EGFR, предпочтительно MAb 425, будет продуцироваться и тестироваться на желаемые иммунные и функциональные характеристики. Вариантные антитела будут наиболее предпочтительно продуцироваться с помощью техники рекомбинантных ДНК, несмотря на то, что другие процедуры, включающие химический синтез фрагментов антител, могут также рассматриваться.

Изобретение относится к аналогам антитела, в которых замены, по крайней мере, одного аминокислотного остатка сделаны в положениях, приводящих к существенному уменьшению активности или устранению одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток из белка. Одна или более аминокислотных замен в определенных точках в пределах любых потенциальных лигандов класса II МНС, идентифицированные в Таблице 1, могут приводить к образованию MAb 425 с уменьшенным иммуногенным потенциалом при введении в качестве терапевтического средства для человека. Предпочтительно, когда аминокислотные замены делаются в приемлемых точках в пределах пептидной последовательности, предсказанной для достижения существенного уменьшения или устранения активности эпитопа Т-клеток. На практике приемлемая точка будет предпочтительно совпадать с аминокислотным остатком связывания в пределах одного из карманов, которые обеспечиваются в пределах желобка связывания класса II МНС.

Наиболее предпочтительно изменять связывание в пределах первого кармана углубления, в так называемых Р1 или Р1 анкерных положениях пептида. Качество связывающего взаимодействия между Р1 анкерным остатком пептида и желобком связывания первого кармана класса II МНС признается основной детерминантой общей связывающей аффинности для целого пептида. Приемлемая замена в этом положении пептида будет осуществляться для остатка, который является менее легко приспосабливаемым в пределах кармана, например, замена на более гидрофильный остаток. Аминокислотные остатки в пептиде в положениях, приравниваемых к связыванию внутри других карманных участков в пределах углубления связывания МНС, также учитываются и подпадают под объем настоящего изобретения.

Понятно, что единственные аминокислотные замены в пределах данного потенциального эпитопа Т-клеток являются более предпочтительным путем, посредством которого эпитоп может устраняться. Комбинации замен в пределах одного эпитопа могут предполагаться и, например, могут быть особенно приемлемыми в том случае, если индивидуально определенные эпитопы перекрываются друг с другом. Кроме того, аминокислотные замены или по отдельности в пределах данного эпитопа, или в комбинации в пределах единственного эпитопа могут быть сделаны в положениях, не приравниваемых к "остаткам кармана" в отношении связывающего желобка класса П МНС, но в любой точке в пределах пептидной последовательности. Замены могут быть сделаны в отношении гомологичных структур или структурным способом, который проводится при использовании способов in silico, известных в данной области техники, эти замены могут основываться на известных структурных признаках молекулы в соответствии с данным изобретением. Все такие замены подпадают под объем данного изобретения.

Могут предполагаться аминокислотные замены иные, чем в пределах пептидов, идентифицированных выше, в особенности тогда, когда они сделаны в комбинации с заменой(ами), осуществленными в пределах приведенного пептида. Например, может предполагаться изменение для восстановления структуры или биологической активности вариантной молекулы. Такие компенсаторные изменения и изменения для включения делеции или добавления особых аминокислотных остатков из анти-EGFR антитела, приводящие к образованию вариантов с желаемой активностью, и в комбинации с изменениями в любом из раскрытых пептидов подпадают под объем данного изобретения.

Поскольку изобретение относится к модифицированным анти-EGFR антителам, предпочтительно к MAb 425, композиции, содержащие такие модифицированные иммуноглобулины или их фрагменты их белков слияния, и родственные им композиции считаются такими, которые также подпадают под объем данного изобретения. В другом аспекте данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим модифицированные анти-EGFR антитела, предпочтительно MAb 425. В еще одном аспекте данное изобретение относится к способам терапевтического лечения человека при использовании модифицированных иммуноглобулинов.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Следует указать, что термин "уменьшенная или сниженная иммуногенность", используемый ранее и здесь далее является относительным термином и касается иммуногенности соответствующего первоначального исходного антитела, когда оно подвергается воздействию in vivo тем же видам по сравнению с антителом, модифицированным согласно изобретению. Таким образом, исходное антитело может быть полностью нечеловеческим антителом, таким как антитело мыши или крысы. Однако изобретение также касается антител, которые уже содержат последовательности человека, таких как химерные или гуманизированные антитела. В этих искусственно созданных антителах, полученных классическими стандартными методами, есть последовательности в пределах первичной структуры, которые являются все еще иммуногенными. Также возможно, что при создании таких химерных или гуманизированных версий известными методами получают новые эпитопы Т-клеток. Даже полностью человеческие антитела или их фрагменты могут быть иммуногенными для некоторых человеческих индивидуумов или групп индивидуумов, имеющих генетически иммунологически различную структуру. Термин "химерное антитело" означает антитела, у которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной с, или гомологична по отношению к соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, тогда как остаточный член цепочки(ек) идентичен с или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, также как и фрагменты этих антител, поскольку они проявляют ожидаемую биологическую активность (например, US 4816567; Morrison и др., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Методы для создания химерных и гуманизированных антител также известны. Например, методы для создания химерных антител включают описание в патентах Boss (Celltech) и Cabilly (Genentech) (US 4816397; US 4816567). "Гуманизированные антитела" являются формами химерных антител, полученных не от человека (например, грызун), которые содержат минимальную последовательность, полученную из не человеческого иммуноглобулина. В большей части гуманизированные антитела это иммуноглобулины человека (антитело реципиента), в котором остатки от гиперпеременной области (CDRs) реципиента заменены остатками из гиперпеременной области нечеловеческого вида (антитело донора), например мыши, крысы, кролика или примата, обладающего желательной специфичностью, сродством и способностью. В некоторых случаях рабочая область (FR) остатков иммуноглобулина человека заменена соответствующими нечеловеческими остатками. Вообще, гуманизированное антитело включает в себя по крайней мере один, а обычно два изменяемых домена, в которых все или почти все гиперпеременные петли соответствуют таковым в не человеческом иммуноглобулине и все или почти все FRs которые обладают последовательностями иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет включать в себя, по крайней мере часть иммуноглобулина с постоянной областью (Fc), обычно из иммуноглобулина человека. Методы для создания гуманизированных антител описаны, например, Winter (US 5225539) и Boss (Celltech, US 4816397). "Фрагменты антитела" включают часть интактного антитела, предпочтительно, включая его антиген-связанную или переменную область. Примерами фрагментов антитела являются Fab, Fab', F(ab')2, Fv и Fc фрагменты, диатела, линейные