Растение, характеризующееся уменьшенным периодом покоя, и способ продукции указанных растений

Растение, характеризующееся уменьшенным периодом покоя, и способ продукции указанных растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к растениям, характеризующимся уменьшенным периодом покоя, и, более конкретно, к растениям, характеризующимся уменьшенным периодом покоя и повышенной урожайностью.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам продукции растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя, и, более конкретно, к способам продукции растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя и характеризующихся повышенной урожайностью.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Состоянием покоя обозначают состояние, в котором живое растение не дает почек или ростков, даже если условия окружающей среды, такие как влажность, температура и т.д., благоприятны для прорастания семян или образования из них побегов. Состояние покоя обычно для семян, луковиц, листопадных плодовых деревьев и тому подобного. Состояние покоя считается важной функцией защиты растений от неблагоприятных условий среды и сохранения их семян. Однако в современном сельском хозяйстве условия культуры улучшены с распространением культивирования в теплицах или мультикультивирования и, таким образом, это состояние покоя может сильно препятствовать культивированию. В этой связи, активно культивировали виды растений с коротким периодом покоя или без периода покоя и так получали отличные результаты.

Кроме того, разработан способ нарушения состояния покоя растений путем искусственной обработки. Считается, что состояние покоя главным образом вызвано накоплением ингибиторов прорастания, таких как абсцизиновая кислота. Считается, что для прерывания состояния покоя необходимо снижение количества ингибитора прорастания или повышение количества гиббереллина, который обладает действием антагониста ингибиторов прорастания. Поэтому при обработке растений гиббереллином ожидаются эффекты прерывания состояния покоя.

Фактически, гиббереллин проявляет эффект индуцирования прорастания покоящихся семян овса, латука, и т.д. и покоящихся почек томата, персика, камелии и т.д. (Tomokazu Koshiba and Yuji Kamiya, "Science of new plant hormone", Kodansha Ltd., 2002). И было признано, что он имеет заметный эффект по улучшению прорастания семян риса, семейства пшеницы, рами, арахиса, Bromus catharticus, Bromus inermis Leyss., японского хрена, Brassica, латука, баклажана, печеночницы, глоксинии, каланхоэ, Primula, Nigella damascene и т.д., и также клубники, Aralia cordata Thunberg и т.д. (Vegetable horticulture great dictionary, Yokendo, 1977). Лук, лук-шалот, шпинат, луковичные цветы также считаются представителями растений, характеризующимися состоянием покоя, хотя корреляция между гиббереллином и созреванием семян не выяснена.

Картофель также является растением, характеризующимся состоянием покоя, и прорастание картофеля может не наблюдаться в течение примерно 3 месяцев после сбора урожая. Однако, как описано выше, имеются сообщения о том, что период покоя может быть укорочен обработкой гиббереллином (Tokushima Test and Research Report of Agriculture, vol. 36, pp. 7-17, 2000), и картофель считается подходящим материалом для оценки корреляции между регуляторами состояния покоя и содержанием эндогенного гиббереллина.

Картофель культивируют примерно на 20 миллионах га (гектар) и его средняя урожайность составляет 1,48 тонн на 10 а (ар), его общий урожай составляет примерно триста миллионов тонн. Максимальные посевные площади находятся в России, затем следуют Китай и Польша, и общий урожай на этих территориях также подобного порядка величины. Посевная площадь картофеля в Японии составляет примерно 130 тысяч га и его урожай составляет примерно 4 миллиона тонн. Его потребление распределяется по 44% на сырьевой крахмал, 21% на сырую пищу и 13% на обработанную пищу. Однако, поскольку либерализация импорта кукурузы и пшеницы стала эффективной, стал доступен импорт дешевого крахмала. Поэтому для победы в этой жесткой ценовой конкуренции требуется гарантировать систему продукции, имеющей высокое качество и одновременно большое количество, путем дальнейшего улучшения культивирования картофеля. Конкретно, считается необходимым увеличивать среднее количество крахмала с 13% до 18% и увеличивать средний выход продукции на 10 ар с 4 до 7 тонн и далее снижать стоимость продукции наполовину.

Содержание крахмала на начальной стадии утолщения клубня после образования клубня составляет примерно 0,8% и после этого это содержание возрастает по мере утолщения клубня. В соответствии с этим, для повышения содержания крахмала в клубнях важно предоставить достаточно времени для их утолщения. Кроме того, так как содержание крахмала быстро снижается при понижении температуры почвы, оптимальной температурой почвы (на глубине 10 см) является температура от 17 до 22°C. Ввиду этого требуется так подстраивать время культивирования, чтобы температура во время цветения, которое инициирует образование клубня, составляла примерно 18°C, и, более конкретно, рекомендуется, чтобы весенняя посадка осуществлялась за 7-10 суток до того, как температура воздуха достигнет 10°C, и осенняя посадка должна осуществляться за 10 суток до достижения средней температуры 23°C.

С другой стороны, для урожая клубней предпочтительно подбирать достаточный период утолщения клубней, и урожай картофеля возрастает примерно на 60-70 кг в сутки на 10 ар во время периода утолщения, и требуется осуществлять посадку на сельскохозяйственные поля как можно раньше в плане температуры, оптимальной для содержания крахмала.

Кроме того, в общем, время от клубней до проросших побегов (период прорастания) варьирует, и вариации, равные 15 суткам, не являются необычными. В общем, по сравнению с урожайностью побегов, проросших раньше, урожайность побегов, проросших позже снижается, поскольку для утолщения клубней недостаточно времени. Если прорастание задерживается на 15 суток, урожай в пересчете на растение, по оценкам, снижается максимум на 24%. Таким образом, вариация периода прорастания считается важным фактором снижения урожайности. Поэтому быстрое и одновременное прорастание из клубней, то есть малая вариация роста, является существенным фактором увеличения урожайности (Potato encyclopedia, Minoru Yoshida, Rural Culture Association, 1988).

Гиббереллин, как считается, синтезируется двумя путями: один из них является путем мевалоновой кислоты, в котором гиббереллин синтезируется из происходящей из уксусной кислоты мевалоновой кислоты через изопентенилдифосфат, а другой представляет собой не связанный с мевалоновой кислотой путь, в котором гиббереллин синтезируется из изопентенилдифосфата, продуцируемого из происходящих из глюкозы пировиноградной кислоты и глицеральдегид-3-фосфата. Изопентенилдифосфат преобразуется в тетрациклический углеводород энт-каурен через геранилдифосфат, геранилгеранилдифосфат, и энт-копалилдифосфат. Затем энт-каурен подвергается трем последовательным окислениям с образованием энт-кауреновой кислоты, и энт-кауреновая кислота подвергается трем последовательным окислением с синтезом GA12. Биосинтез после синтеза GA12 катализируется диоксигеназой, которая использует в качестве совместного субстрата 2-оксоглутарат. В настоящее время зарегистрировано 100 или более разновидностей свободных гиббереллинов, но активные гиббереллины, обладающие физиологической активностью, составляют лишь часть их (GA1, GA3, GA4, и т.д.).

С целью изучения физиологического эффекта гиббереллина сделана попытка введения в растение генов, ответственных за синтез гиббереллина. Huang et al. продуцировали трансформированное растение путем введения гена 20-оксидазы, выделенного из Arabidopsis, в Arabidopsis в смысловом направлении, где этот ген был гиперэкспрессирован. Сообщалось, что это трансформированное растение характеризовалось повышенным содержанием GA1, GA9, и GA20, продленным периодом цветения, и сниженным периодом покоя семян по сравнению с нетрансформированными растениями, но также сообщалось, что имела место заметная морфологическая аномалия растения, в котором наблюдалось вытяжение гипокотилей и стеблей (Plant Physiology, 118: 773-781, 1998). Более того, Carrera et al. выделили из картофеля ген, кодирующий GA20-оксидазу (StGA20ox1), и ввели его в картофель в смысловом направлении и в антисмысловом направлении. Сообщалось, что при его введении в смысловом направлении и гиперэкспрессии длина междоузлия возрастала и время прорастания из клубней продлевалось (Plant Journal, 22: 247-256, 2000). Однако в трансформированном растении, в которое был введен ген, кодирующий GA20-оксидазу, в антисмысловом положении, уменьшался период покоя, и число и масса клубней сильно уменьшались, и таким образом, улучшение урожайности не достигалось. Далее, поскольку не наблюдалось различий между временем прорастания клубней картофеля, куда был введен ген, кодирующий GA20-оксидазу, в антисмысловом положении, и временем прорастания клубней нетрансформированного растения, авторы заключили, что между GA20-оксидазой и состоянием покоя нет корреляции.

С другой стороны, независимо от описанного выше исследования было получено трансгенное растение с введением в него гена глутаматдегидрогеназы (GDH), и происходящий из E. coli ген NADP-зависимой GDH (gdhA) вводили в табак и кукурузу с целью достижения устойчивости к гербициду - фосфоноглицину. На основе этих исследований сообщалось, что сухой вес растений, общее содержание аминокислот и содержание водорастворимых углеводов существенно возрастало (Lightfoot et al., Canada, CA2180786, 1996). Сходным образом, Tian et al. (патент Китая, CN00109779.2) сообщают, что табак характеризовался хорошими ростовыми результатами при введении в него происходящего из Neurospora гена NADP-зависимой GDH, по сравнению с табаком, в который не был введен указанный ген. Более того, сообщалось, что происходящий из Aspergillus nidulans ген NADP-зависимой GDH вводили в томаты с повышением, таким образом, содержания свободных аминокислот в плоде (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-238556, Kisaka et al.), и тот же ген вводили в картофель с повышением, таким образом, массы и числа клубней (JP2000-404322). Однако ни в одном из этих отчетов не описано изменений в содержании гиббереллина, и в них не проводили исследования состояния покоя.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является получение растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя.

Далее, другой целью настоящего изобретения является разработка способа продукции растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя.

Кроме того, другой целью настоящего изобретения является разработка способа уменьшения периода покоя у растений.

В частности, целью настоящего изобретения является получение растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов или прорастания.

Более того, еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа продукции растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов или прорастания.

Кроме того, другой целью настоящего изобретения является разработка способа уменьшения периода покоя у растений и продукции растений, характеризующихся уменьшенным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов или прорастания.

В частности, другой целью настоящего изобретения является получение растений, характеризующихся сниженным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов или прорастания и, следовательно, характеризующихся повышенной урожайностью.

Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка способа продукции растений, характеризующихся сниженным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов или прорастания и, следовательно, характеризующихся повышенной урожайностью.

Авторами настоящего изобретения уже обнаружено, что внутриклеточное содержание 2-OG повышается путем повышенной экспрессии гена глутаматдегидрогеназы (здесь и далее обозначается как GDH) в растительных клетках (Kisaka et al., заявка на выдачу патента Японии № 2003-198559). GDH катализирует обратимую реакцию введения аминогруппы в 2-OG с образованием глутаминовой кислоты, и обратимо высвобождает аммиак из глутаминовой кислоты с образованием 2-OG. Однако, в общем считается, что GDH разлагает глутаминовую кислоту на 2-OG и аммиак, а не включает аминогруппу в состав 2-OG с образованием глутаминовой кислоты в клетках, поскольку GDH имеет высокое значение Km для аммиака, и в результате повышается содержание 2-OG.

С другой стороны, по настоящему изобретению считается, что период покоя может быть снижен путем увеличения активности эндогенного гиббереллина в растении, что приводит к улучшению сроков созревания, с получением таким образом сорта, обладающего синхронностью роста, и так может быть повышена урожайность. Более конкретно, авторами настоящего изобретения обнаружено, что поскольку биосинтез после синтеза GA12 катализируется диоксигеназой, которая использует в качестве совместного субстрата 2-оксоглутаровую кислоту (2-OG), стабильно обеспечивается избыточная подача 2-OG путем гиперэкспрессии гена глутаматдегидрогеназы (GDH) растения, и активность гиббереллина в клубнях может возрастать, и что в результате действительно могут быть получены штаммы, характеризующиеся сниженным периодом покоя, улучшенными сроками образования побегов или прорастания и одновременными сроками образования побегов или прорастания, и поэтому могут быть получены штаммы, характеризующиеся синхронным ростом. Авторами настоящего изобретения также обнаружено, что урожайность увеличилась.

Иными словами, настоящее изобретение относится к растению, характеризующемуся повышенным уровнем внутриклеточного 2-OG и уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, и к способу продукции растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, путем повышения в указанном растении внутриклеточного содержания 2-OG.

Кроме того, настоящее изобретение относится к растению, характеризующемуся повышенным внутриклеточным содержанием 2-OG, уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, и характеризующемуся одновременными сроками образования побегов или прорастания; и к способу продукции растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, и характеризующегося одновременными сроками образования побегов или прорастания, путем повышения в указанном растении внутриклеточного содержания 2-OG.

Настоящее изобретение относится к растению, характеризующемуся уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, за счет гиперэкспрессии внутриклеточного гена GDH, и к способу продукции растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, путем гиперэкспрессии в указанном растении внутриклеточного гена GDH.

Далее, настоящее изобретение относится к растению, характеризующемуся уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, и характеризующемуся одновременными сроками образования побегов и/или прорастания, за счет гиперэкспрессии внутриклеточного гена GDH, и к способу продукции растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, и характеризующегося одновременными сроками образования побегов и/или прорастания, путем гиперэкспрессии в указанном растении внутриклеточного гена GDH. Растение по настоящему изобретению и растение, продуцированное способом по настоящему изобретению, характеризуется уменьшенным периодом покоя и одновременными сроками образования побегов и/или прорастания, и в результате они обладают синхронностью роста, и, таким образом, характеризуются повышенной урожайностью.

В частности, настоящее изобретение относится к растению, в которое введена конструкция нуклеиновой кислоты, способная усиливать экспрессию гена GDH, и которая может гиперэкспрессировать ген GDH в клетках, причем указанное растение характеризуется сниженным периодом покоя по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продукции растения, характеризующегося сниженным периодом покоя, по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, путем введения в указанное растение конструкции нуклеиновой кислоты, способной усиливать экспрессию гена GDH для гиперэкспрессии гена GDH в растительных клетках.

В частности, настоящее изобретение относится к описанному выше способу или растению, в котором конструкция нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. Кроме того, настоящее изобретение относится к описанному выше способу или растению, где нуклеиновая конструкция содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, характеризующейся последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в жестких условиях, и указанная нуклеиновая конструкция кодирует полипептид, характеризующийся активностью GDH.

Конкретно, настоящее изобретение относится к описанному выше растению и способу продукции растения, где указанное растение представляет собой картофель, и растение, продуцируемое указанным способом, представляет собой картофель.

Состояние покоя растения не только ограничивает сроки культивирования, но также представляет собой препятствие, определяющее рост и урожайность растения. Поэтому по настоящему изобретению путем снижения периода покоя растения без индукции значительных нарушений ограничения по времени культивирования могут быть сняты, и это обеспечит улучшение сроков образования побегов или прорастания, что приводит к одновременным срокам образования побегов или прорастания. Поэтому настоящее изобретение может обеспечивать одновременный рост растения и, следовательно, может обеспечивать простое культивирование и высокий урожай, рост и качество.

Фиг. 1 представляет собой схематичную иллюстрацию сконструированного плазмидного вектора.

Nos-Pro: промотор нопалинсинтазы

NPTII: неомицинфосфотрансфераза

Nos-Ter: терминатор нопалинсинтазы

35S-Pro: промотор 35S вируса мозаики цветной капусты

Mtd-AN-GDH: происходящая из Aspergillus nidulans глутаматдегидрогеназа, содержащая пептид митохондриального транспорта

HPT: гидромицинфосфотрансфераза

H: HindIII, B: BamHI, X: XbaI, Sp: SpeI, E: EcoRI,

LB: левая граница, RB: правая граница

На фиг. 2 показаны результаты PCR трансгенного картофеля, где использовали праймер, специфичный для гена An-GDH (A), праймер, специфичный для гена NPTII (B). Дорожка 1: маркер размером 100 н.п., дорожка 2: нетрасгенный картофель, дорожка 3: трансгенный картофель Mtd 1, дорожка 4: трансгенный картофель Mtd 2, дорожка 5: трансгенный картофель Mtd 3, дорожка 6: трансгенный картофель Mtd 5 и дорожка 7: трансгенный картофель Mtd 8.

На фиг. 3 показаны результаты нозерн-блоттинга на трансгенном картофеле. Общее количество РНК, равное 10 мкг, выделенное из клубней, подвергали электрофорезу и окрашивали этидий-бромидом. Полноразмерный ген An-GDH применяли в качестве зонда. Дорожка 1: нетрасгенный картофель, дорожка 2: трансгенный картофель Mtd 1, дорожка 3: трансгенный картофель Mtd 2, дорожка 4: трансгенный картофель Mtd 3, дорожка 5: трансгенный картофель Mtd 5 и дорожка 6: трансгенный картофель Mtd 8.

На фиг. 4 показано содержание 2-оксоглутарата (2-OG) в трансгенном по GDH картофеле (n=3). Контроль: нетрансгенный картофель, и Mtd8: трансгенный картофель.

На фиг. 5 показаны результаты анализа на гиббереллин из клубня трансгенного по GDH картофеля. Контроль: раствор образца из клубня нетрансгенного картофеля, Mtd8: раствор образца из клубня нетрансгенного картофеля, Mtd8+Dami: раствор образца из клубня трансгенного картофеля + раствор даминозида. После 0-M: клубень непосредственно после сбора, после 2-M: клубень через 2 месяца после сбора, и после 3-M: клубень через 3 месяца после сбора.

На фиг. 6 показаны результаты теста на прорастание трансгенного по GDH клубня картофеля. (A) Световая обработка: в течение 3 суток при 24°C в теплице и затем пересадка на вермикулит; (B) Без обработки: пересадка на вермикулит без тепловой обработки.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Как описано выше, настоящее изобретение относится к растению (включая его потомство), характеризующемуся уменьшенным периодом покоя по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида, за счет гиперэкспрессии гена GDH в растительных клетках, и к способу продукции этого растения.

Далее, настоящее изобретение относится к растению (включая его потомство), способному к гиперэкспрессии гена глутаматдегидрогеназы (GDH) в растительных клетках, характеризующемуся уменьшенным периодом покоя по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида и характеризующемуся одновременными сроками образования побегов или прорастания, и также к способу продукции растения, характеризующегося уменьшенным периодом покоя по сравнению с таковым во встречающихся в природе растениях того же вида и характеризующегося одновременными сроками образования побегов или прорастания, путем гиперэкспрессии гена GDH в растительных клетках.

В настоящем описании «встречающееся в природе растение того же вида» относится к растению, которое принадлежит к тому же виду, что и продуцируемое по настоящему изобретению, и наблюдается в природе, и которое, как было подтверждено, не подвергалось искусственным манипуляциям или не было получено в результате искусственных манипуляций.

Более конкретно, в одном из вариантов осуществления по настоящему изобретению может быть получено растение, которое может избыточно экспрессировать ген GDH и характеризуется уменьшенным периодом покоя по сравнению с встречающимися в природе растениями того же вида, путем введения гена, способного усиливать экспрессию гена GDH в растении.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения путем введения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей GDH, в растение, GDH экспрессируется в полученном в результате трансформированном растении с повышением содержания 2-OG, и затем повышается активность гиббереллина. В результате может быть получено растение, которое характеризуется уменьшенным периодом покоя и однородными сроками образования побегов или прорастания. GDH катализирует реакцию окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты с образованием аммиака, а также обратную реакцию образования глутаминовой кислоты путем конденсации 2-OG и аммиака. Однако в основном считается, что GDH in vivo преимущественно катализирует распад глутаминовой кислоты, то есть реакцию продукции 2-OG и аммиака, поскольку уровень Km для аммиака высок. В общем, избыточное количество внутриклеточного гиббереллина или быстрое повышение уровня внутриклеточного гиббереллина может иметь вредное влияние на рост или урожайность. Однако по настоящему изобретению гиббереллин получают не извне клетки, а, наоборот, увеличивается уровень внутриклеточного гиббереллина за счет увеличения уровня 2-OG вследствие гиперэкспрессии гена GDH. Поэтому по настоящему изобретению активность эндогенного гиббереллина будет подниматься медленно путем повышения 2-OG, что приводит к снижению периода покоя и синхронизации сроков образования побегов или прорастания без индукции значимых вредных эффектов, таких как морфологические аномалии. Обычно культуры собирают одновременно для всех растений, культивируемых, по существу, в одинаковых условиях в течение предварительно определенного периода, что приводит к задержке и разнобою в сроках образования побегов или прорастании, что может непосредственно вызвать низкий выход урожайности. Поэтому по настоящему изобретению может достигаться дальнейшее стабильное улучшение выхода.

По настоящему изобретению для увеличения содержания 2-OG в растении и, в результате, для повышения активности гиббереллина способ не ограничен только введением гена GDH, но ген фермента, который может отличаться от GDH, также может использоваться, причем этот фермент может генерировать 2-OG. В растении, куда введен такой ген, содержание 2-OG повысится и в результате возрастет активность гиббереллина. Например, такие ферменты могут включать аспартатаминотрансферазу или аланинаминотрансферазу или тому подобное.

Хотя источник ферментов, которые могут повышать содержание 2-OG, например GDH, используемый согласно изобретению, конкретно не ограничен, фермент из организма рода Aspergillus, например GDH из организма рода Aspergillus, может быть более предпочтительным. Более предпочтительно, фермент представляет собой GDH из Aspergillus nidulans или Aspergillus awamorii. Кроме того, модифицированный фермент или его ген, содержащий делецию 1 или нескольких аминокислот, замену и вставку, например модифицированная GDH и модифицированный ген GDH, может использоваться по настоящему изобретению при условии, что модифицированный фермент имеет описанную выше ферментативную активность, например активность GDH.

Для гиперэкспрессии 1 или нескольких из этих генов экспрессия эндогенных генов растений может усиливаться вместо прямого введения конструкции нуклеиновой кислоты, которая может экспрессировать указанные гены. Например, такие процедуры включают в себя введение действующей в цис-направлении конструкции нуклеиновой кислоты, которая повышает экспрессию эндогенного гена, включая мощный промотор и/или энхансер, и введение действующего в транс-направлении фактора, который может усиливать экспрессию этих генов.

Более того, локализация GDH во внутриклеточной органелле растительной клетки не ограничивается цитоплазмой, но возможно применение GDH, локализованной в митохондрии, хлоропласте, пероксисоме и т.д. Кроме того, GDH с сигнальным или транспортным пептидом, который присоединен к N-концу или С-концу для транспорта белка-фермента в этих внутриклеточных органеллах, также может использоваться согласно изобретению.

Эти гены или кДНК могут легко продуцироваться специалистами в данной области по опубликованным SEQ ID NO. Например, нуклеотидная последовательность кДНК гена GDH Aspergillus nidulans опубликована в GenBank под инвентарным № X16121. Последовательность нуклеотидов (последовательность кДНК) происходящего из Aspergillus nidulans гена GDH показана в SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность GDH - в SEQ ID NO: 2. На основе данных последовательностей может быть легко получена кДНК GDH путем синтеза PCR-праймера, с помощью которого можно амплифицировать фрагмент ДНК, кодирующий последовательность белка, и провести RT-PCR с использованием в качестве матрицы РНК, выделенной из культуры Aspergillus nidulans. Aspergillus nidulans может быть получена в American Type Culture Collection, в том числе те штаммы, которые зарегистрированы как ATCC10074 или ATCC11267 или подобные им. Кроме того, последовательность кДНК GDH Aspergillus awamorii также опубликована в GenBank под инвентарным № Y15784. Aspergillus awamorii зарегистрирована в American Type Culture Collection как ATCC10548 или ATCC11358 или подобные им, и кДНК GDH может быть получена способом, описанным выше с использованием полученных штаммов. Нуклеотидная последовательность (последовательность кДНК) гена GDH, происходящего из Aspergillus awamorii, обозначена как SEQ ID NO:3, а аминокислотная последовательность GDH показана в SEQ ID NO:4.

По настоящему изобретению может использоваться конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью, описанной в SEQ ID NO: 2 или 4. Более того, также возможно применять конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую молекулы нуклеиновой кислоты, которые характеризуются гомологией, составляющей по меньшей мере 70% или более, предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более, в отношении SEQ ID NO: 1 или 3, где конструкция нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, характеризующийся активностью GDH. Эта гомология может рассчитываться с использованием программы, хорошо известной в данной области, например FASTA, со стандартными параметрами. Например, такие программы, как FASTA, и т.д., предоставляются Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics (DDBJ/CIB) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html) (например, ее можно использовать с коэффициентом 100 и выравниванием 100). Другой алгоритм и программа для рассчета гомологии среди 2 или более последовательностей хорошо известны в данной области вместе со стандартными параметрами для них. Эти молекулы нуклеиновой кислоты также могут пониматься как молекула нуклеиновой кислоты, способная гибридизоваться с указанными последовательностями в «жестких условиях», в частности с последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 1 или 3. Используемый здесь термин «жесткие условия» относится к условиям, в которых образуются так называемые специфичные гибриды и не образуются неспецифичные гибриды. Трудно выразить эти условия численно, но, например, можно определить их как условия, в которых способны преимущественно гибридизоваться молекулы ДНК, характеризующиеся гомологией 70% или более, а другие ДНК, характеризующиеся гомологией 70% или менее, значимо не гибридизуются. Более конкретно, их можно определить, как условия, в которых гибридизация может происходить при условиях отмывки, которые соответствуют нормальным условиям отмывки для саузерн-гибридизации, представляющим собой 50°C, 2 × SSC и 0,1% SDS, предпочтительно 1 × SSC, и 0,1% SDS, и более предпочтительно 0,1 × SSC и 0,1% SDS. Более того, любые эквивалентные условия могут быть понятны специалистам в данной области (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994). Хотя ген, способный гибридизоваться в таких условиях, может содержать стоп-кодон(-ы) внутри себя или может иметь в своем активном центре мутацию, вызывающую потерю активности, такой ген может быть легко удален путем определения ферментативной активности после его присоединения к коммерчески доступному экспрессирующему вектору.

SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 характеризуются гомологией 66%, рассчитанной посредством Genetyx Ver 3.2. Сходным образом, SEQ ID NO: 2 и 4, как показано, характеризуются гомологией 87%.

Активность GDH может, например, измеряться способом Ameziane et al. (Plant and Soil, 221: 47-57, 2000). Более конкретно, растительные ткани, например лист, подвергают криообработке для сохранения жидким азотом, измельчают в ступке и смешивают с буфером для экстракции {200 мМ Tris (pH 8,0), 14 мМ β-меркаптоэтанола, 10 мМ L-цистеин-HCl и 0,5 мМ PMSF} в 5-кратном объеме относительно массы образца ткани. Полученную в результате смесь переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 30 минут при 12000 об./мин при 4°C и надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации (Millipore, фильтровальное устройство Ultrafree 0,5, Biomax-10) и остаток несколько раз промывают буфером для экстракции. Полученный в результате экстрагированный раствор фермента добавляют к раствору, содержащему 100 мМ Tris (pH 8,5), 20 мМ 2-оксоглутаровой кислоты, 10 мМ CaCl₂, 0,2 мМ NADH и 200 мМ NH₄Cl. Затем активность GDH можно определить путем измерения снижения поглощения при 340 нм. Концентрацию белка в экстрагированном растворе неочищенного фермента можно измерить хорошо известным способом, таким как метод Брэдфорд, с использованием в качестве стандарта, например, бычьего сывороточного альбумина (BSA).

Кроме того, по настоящему изобретению способ повышения активности гиббереллина путем увеличения содержания 2-OG не ограничен введением гена GDH. Растение, характеризующееся высокой активностью гиббереллина вследствие повышения содержания 2-OG, также может продуцироваться путем введения фермента, который продуцирует 2-OG из глутаминовой кислоты и который может отличаться от GDH. Примеры таких ферментов включают в себя аспартатаминотрансферазу или аланинаминотрансферазу или подобные им.

Конструкция нуклеиновой кислоты, используемая по настоящему изобретению, может быть получена способами, хорошо известными специалистам в данной области. Способы молекулярной биологии, включающие в себя выделение и определение последовательности конструкции нуклеиновой кислоты, указаны в публикациях, таких как Sambrook et al., Molecular Cloning-Laboratory Manual, the 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Альтернативно, способ амплификации генов, такой как PCR, может потребоваться для продукции конструкции нуклеиновой кислоты, которая может использоваться по настоящему изобретению. Эти способы также указаны в таких публикациях, как F.M. Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).

Конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая GDH или описанные выше ферменты, может, в основном, содержать подходящий промотор растительных клеток, например промотор гена нопалинсинтазы, 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S) или подходящие терминаторы, такие как терминаторы гена нопалинсинтазы, и другие требуемые или предпочтительные последовательности для экспрессии, такие как энхансер и маркерный ген для скрининга трансформантов, например ген устойчивости к лекарственному средству, включая ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к G418 и ген устойчивости к гидромицину.

Промотор, используемый в такой конструкции нуклеиновой кислоты, может представлять собой конститутивный промотор, тканеспецифический промотор, или специфичный для стадии роста промотор, который может быть выбран в зависимости от используемого промотора, в зависимости от хозяина, требуемого уровня экспрессии, органа-мишени экспрессии или стадии роста. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения могут использоваться сильные промоторы, которые не специфичны в отношении ткани и стадии роста, включая, например, промотор CaMV35S. Тканеспецифические промоторы включают в себя, например, промотор гена фазеолина или промотор гена пататина или подобные тому. В наиболее предпочтительном осуществлении настоящего изобретения используют конструкцию нуклеиновой кислоты, где ген GDH направляется сильным конститутивным промотором, таким как промотор CaMV35S.

Способ переноса генов по настоящему изобретению конкретно не ограничен, и возможно адаптировать подходящий способ переноса генов к растительным клеткам, известный специалистам в данной области, в зависимости от хозяина. Например, в одном из осуществлений настоящего изобретения используют способ переноса генов с применением Agrobacteruim. В такой системе трансформации предпочтительно использовать бинарный вектор. В случае применения Agrobacterium, конструкция нуклеиновой кислоты, применяемая при трансформации, далее включает в себя область Т-ДНК, фланкирующую подлежащую введению последовательность ДНК. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения введенную последовательность встраивают между левой и правой пограничными T-ДНК-последовательностями. Подходящий дизайн и конструкция такого трансформирующего вектора, основанного на T-ДНК, хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, условия трансфекции растения Agrobacterium, несущей такую конструкцию нуклеиновой кислоты, также хорошо известны специалистам в данной области.

В настоящем изобретении могут быть также использованы другие способы переноса генов. Примеры способов переноса генов включают способ введения ДНК в протопласт с использованием полиэтиленгликоля или кальция, процедуры трансформации протопласта электропорацией, способ с использованием обстрела частицами и т.п.

Растительные клетки и подобные им, с которыми манипулировали, как описано выше, могут подвергаться отбору на предмет трансформации. Этот отбор может проводиться, например, на основе экспрессии маркерного гена, присутствующего в конструкции нуклеиновой кислоты, использованной для трансформации. Например, когда маркерный ген представляет собой ген устойчивости к лекарственному средству, их можно отбирать путем культивирования или выращивания растительных клеток в культуральной среде, содержащей антибиотики или гербицид, или подобное им, в умеренной концентрации. Альтернативно, когда маркерный ген представляет собой ген β-глюкуронидазы или ген люциферазы, трансформированные клетки могут отбираться путем скрининга на активность