Способ получения восстановленного кофермента q 10 и способ получения окисленного кофермента q 10

Способ получения восстановленного кофермента q 10 и способ получения окисленного кофермента q 10

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения восстановленного кофермента Q₁₀, представленного нижеследующей формулой (I):

и к способу получения окисленного кофермента Q₁₀, представленного нижеследующей формулой (II):

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения восстановленного кофермента Q₁₀, который предусматривает следующее:

культивирование микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, в целях получения микробных клеток, содержащих восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀;

необязательно разрушение указанных микробиологических клеток и выделение полученного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀.

Настоящее изобретение также относится к способу получения окисленного кофермента Q₁₀, который предусматривает либо выделение окисленного кофермента Q₁₀ после окисления вышеупомянутых микробных клеток или продукта их разрушения, либо выделение восстановленного кофермента Q₁₀ из вышеупомянутых микробных клеток или продукта их разрушения и окисление полученного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀.

Предпосылки создания изобретения

Восстановленный кофермент Q₁₀ (I) и окисленный кофермент Q₁₀ (II) представляют собой митохондриальные системные факторы транспорта электронов, присутствующие в клетках живого организма человека и участвующие в качестве носителей электронов в продуцировании АТФ в реакциях окислительного фосфорилирования.

Обычно окисленный кофермент Q₁₀, помимо его применения в фармацевтических продуктах в качестве фармацевтически и физиологически активного вещества для лечения различных заболеваний, широко используется в качестве пищевых добавок и косметических продуктов.

С другой стороны, до настоящего времени восстановленный кофермент Q₁₀ не был объектом особого внимания, однако в последние годы появились сообщения, что восстановленный кофермент Q₁₀ является более эффективным для различных применений, чем окисленный кофермент Q₁₀.

Так, например, в публикации японской заявки Kokai Hei-10-330251 описано средство против гиперхолестеринемии, обладающее превосходной способностью снижать уровни холестерина, средство против гиперлипидемии и средство для лечения и предупреждения артериосклероза, которые содержат восстановленный кофермент Q₁₀ в качестве активного ингредиента. Кроме того, в публикации японской заявки Kokai Hei-10-109933 описана фармацевтическая композиция, которая обладает превосходной абсорбционной способностью при пероральном введении и содержит кофермент Q₁₀, включая восстановленный кофермент Q₁₀, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, восстановленный кофермент Q₁₀ является эффективным в качестве антиоксиданта и акцептора радикалов. В работе R. Stocker et al. сообщалось, что восстановленный кофермент Q₁₀ предупреждает перекисное окисление человеческого ЛПНП более эффективно, чем α-токоферол, ликопен и β-каротин (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, vol. 88, pp.1646-1650, 1991).

Известно, что окисленный кофермент Q₁₀ и восстановленный кофермент Q₁₀ находятся в определенном равновесии в живом организме и что окисленный кофермент Q₁₀/восстановленный кофермент Q₁₀, абсорбируемые в живом организме, подвергаются взаимному окислению/восстановлению.

Восстановленный кофермент Q₁₀ может быть продуцирован методом химического синтеза, аналогичным методу продуцирования окисленного кофермента Q₁₀. Но этот метод синтеза, как предполагается, является более сложным, небезопасным и дорогостоящим. Кроме того, в случае применения методов химического синтеза необходимо минимизировать субгенерирование и продуцирование в качестве примеси (Z)-изомера, который, как подозревают, является небезопасным (Biomedical and Clinical Aspects of Coenzyme Q, vol.3, pp.19-30, 1981). Согласно Европейской фармакопее, считается, что содержание (Z)-изомера в окисленном коферменте Q₁₀ не должно превышать 0,1%.

Другим способом продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ может быть способ утилизации микробных клеток, то есть способ разделения и выделения восстановленного кофермента Q₁₀ из микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀. Однако восстановленный кофермент Q₁₀, продуцируемый микробными клетками вышеупомянутых микроорганизмов, содержит большое количество окисленного кофермента Q₁₀, и стандартный метод разделения и выделения восстановленного кофермента Q₁₀ является очень дорогостоящим.

В указанных ниже документах описано присутствие восстановленного кофермента Q₁₀ в микробных клетках, и известны примеры таких бактерий, приведенные ниже. (1) Описан пример, где из всех коферментов Q₁₀ в культуральных клетках фотосинтезирующих бактерий присутствует по меньшей мере 5-10 мас.% и по большей мере 30-60 мас.% восстановленного кофермента Q₁₀ (публикация японской заявки Kokai Sho-57-70834). (2) Описан пример, в котором бактерию рода Pseudomonas подвергают тепловой экстракции органическим растворителем в присутствии гидроксида натрия и пирогаллола, и полученное вещество обрабатывают 5% раствором гидросульфита натрия, а затем подвергают дегидратации и концентрируют для сбора растворимой в ацетоне части, в результате чего получают масло, содержащее восстановленный кофермент Q₁₀ (публикация японской заявки Kokai Sho-60-75294).

Оба метода в вышеуказанных примерах (1) и (2) направлены на превращение смеси полученного восстановленного кофермента Q₁₀ и окисленного кофермента Q₁₀ или превращение полученного восстановленного кофермента Q₁₀ в окисленный кофермент Q₁₀ путем дополнительного окисления. Таким образом, восстановленный кофермент Q₁₀ описан лишь как промежуточное вещество при продуцировании окисленного кофермента Q₁₀.

В вышеуказанном примере (1) используются фотосинтезирующие бактерии, метод культивирования которых является достаточно сложным. Кроме того, нельзя утверждать, что в микробных клетках вышеупомянутых микроорганизмов, в том случае, если планируется продуцирование восстановленного кофермента Q₁₀, отношение количества восстановленного кофермента Q₁₀ к общему количеству коферментов Q₁₀ будет достаточным.

В вышеуказанном примере (2) описан способ превращения окисленного кофермента Q₁₀, содержащегося в гексановой фазе, в восстановленный кофермент Q₁₀ с использованием гидросульфита натрия в качестве восстановителя (см. пример 3 в публикации японской заявки Kokai Sho-60-75294). Таким образом, отношение количества восстановленного кофермента Q₁₀ к общему количеству кофермента Q₁₀ в микробных клетках неизвестно.

Кроме того, в обоих вышеуказанных примерах (1) и (2) не указывается количество продуцированных коферментов Q₁₀ в культуре.

Как описано выше, пока еще не было сообщений о микробных клетках, содержащих высокие уровни восстановленного кофермента Q₁₀. Кроме того, пока еще не разработан способ ферментативного продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ в промышленном масштабе, то есть способ, предусматривающий культивирование микроорганизмов с получением микробных клеток, содержащих высокие уровни восстановленного кофермента Q₁₀ по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀, и выделение восстановленного кофермента Q₁₀ с получением восстановленного кофермента Q₁₀ высокой чистоты.

Таким образом, если будет разработан способ получения большого количества кофермента Q₁₀, содержащего высокие уровни восстановленного кофермента Q₁₀, путем культивирования микроорганизмов, то этот способ может быть в высокой степени эффективным для продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка безопасного и эффективного способа продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ в промышленном масштабе путем культивирования микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, с получением микробных клеток, содержащих высокие уровни восстановленного кофермента Q₁₀, и путем соответствующего выделения восстановленного кофермента Q₁₀ из указанных микробных клеток.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа продуцирования окисленного кофермента Q₁₀ в соответствии с простыми процедурами культивирования микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, путем продуцирования микробных клеток, содержащих высокие уровни восстановленного кофермента Q₁₀, и окисления восстановленного кофермента Q₁₀, полученного из указанных микробных клеток, в качестве промежуточного вещества при продуцировании окисленного кофермента Q₁₀.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀, представленного нижеследующей формулой (I):

где указанный способ предусматривает следующее:

культивирование микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, в культуральной среде, содержащей источник углерода, источник азота, источник фосфора и микроэлементы, с получением микробных клеток, содержащих восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀,

необязательно разрушение указанных микробных клеток и

экстракцию продуцированного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀ органическим растворителем.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу продуцирования окисленного кофермента Q₁₀, представленного нижеследующей формулой (II):

где указанный способ предусматривает

культивирование микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, в культуральной среде, содержащий источник углерода, источник азота, источник фосфора и микроэлементы, с получением микробных клеток, содержащих восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀,

необязательно разрушение указанных микробных клеток и

либо окисление полученного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀ до окисленного кофермента Q₁₀, а затем экстракцию полученного продукта органическим растворителем, либо экстракцию продуцированного таким образом восстановленного кофермента Q₁₀ органическим растворителем, необязательную очистку и окисление полученного продукта до окисленного кофермента Q₁₀.

В соответствии со способами настоящего изобретения, восстановленный кофермент Q₁₀ может быть получен в промышленном масштабе недорогостоящим способом путем проведения достаточно простых стадий, предусматривающих культивирование микроорганизмов и выделения восстановленного кофермента Q₁₀. Кроме того, окисленный кофермент Q₁₀ также может быть продуцирован простыми способами. Более того, такие продуцируемые микроорганизмами коферменты Q₁₀ обычно не содержат своих (Z)-изомеров, и могут быть получены (все Е)-изомеры, которые идентичны изомерам, содержащимся в мясе, рыбе и т.п.

Подробное описание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, сначала культивируют микроорганизмы, продуцирующие восстановленный кофермент Q₁₀, в результате чего получают микробные клетки, содержащие восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.%, а предпочтительно не менее чем 75 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀ (ферментация).

Микробные клетки, содержащие восстановленный кофермент Q₁₀ на таком высоком уровне по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀, могут быть в основном получены путем культивирования микроорганизмов, способных продуцировать восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.%, а предпочтительно не менее чем 75 мол.% по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀.

Уровень продуцирования микроорганизмами восстановленного кофермента Q₁₀ по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀ может быть оценен, например, способом, предусматривающим культивирование микроорганизмов со встряхиванием (амплитуда: 2 см, 310 возвратно-поступательных движений/мин) при 25°С в течение 72 часов в 10 мл культуральной среды [(глюкоза: 20 г, пептон: 5 г, дрожжевой экстракт: 3 г, солодовый экстракт: 3 г)/л, рН: 6,0] с использованием тест-пробирки (внутренний диаметр: 21 мм, вся длина: 200 мм).

Хотя предпочтительные условия культивирования для ферментативного продуцирования в промышленном масштабе будут описаны позже, однако следует отметить, что вышеупомянутые условия культивирования являются одним из методов стандартизации уровня восстановленного кофермента Q₁₀, продуцируемого микроорганизмами, обладающими такой способностью, так, чтобы указанный уровень был установлен в соответствующих пределах без каких-либо значительных отклонений.

В целях настоящего изобретения, при вышеупомянутых условиях культивирования предпочтительно использовать микробные клетки, которые содержат восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.%, а предпочтительно не менее чем 75 мол.% по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀. Еще более предпочтительно использовать микроорганизмы, способные продуцировать восстановленный кофермент Q₁₀ на единицу культуральной среды в количестве, в основном не менее чем 1 мкг/мл, предпочтительно не менее чем 2 мкг/мл в вышеупомянутых условиях культивирования.

Вышеупомянутое содержание восстановленного кофермента Q₁₀ и отношение количества восстановленного кофермента Q₁₀ к общему количеству коферментов Q₁₀ может быть подтверждено путем физического разрушения микробных клеток, экстракции кофермента Q₁₀ органическим растворителем из полученных таким образом клеток и проведения ВЭЖХ-анализа. В частности, такое измерение может быть осуществлено в соответствии с нижеследующими процедурами:

(1) бульон, содержащий микроорганизмы, необязательно концентрируют, а затем 10 объемных частей указанного бульона помещают в тест-пробирку с завинчивающейся крышкой (внутренний диаметр: 16,5 мм, вся длина: 130 мм) и добавляют 10 объемных частей стеклянных сфер (425-600 мкм, изготавливаемых SIGMA Со.);

(2) в атмосфере азота добавляют 3 объемные части изопропанола и 18,5 объемных частей н-гексана на 10 объемных частей указанного бульона;

(3) разрушение и экстракцию микробных клеток осуществляют путем интенсивного встряхивания указанной смеси в течение 3 минут в атмосфере азота и

(4) полученную органическую фазу гидрофобного растворителя (н-гексановую фазу) выпаривают (температура бани: 40°С) при пониженном давлении и анализируют полученное вещество с помощью ВЭЖХ.

Колонка: YMC-Pack 4,6 x 250 мм (изготавливаемая YMC. Co., Ltd.)

Подвижная фаза: метанол/н-гексан = 85/15

Скорость потока: 1 мл/мин,

Детекция: УФ на 275 нм,

Время удерживания: восстановленный кофермент Q₁₀, 13,5 мин,

окисленный кофермент Q₁₀, 22,0 мин.

Вышеописанный метод измерения предусматривает получение результата, указывающего на содержание восстановленного кофермента Q₁₀ и, по возможности, точное отношение количества восстановленного кофермента Q₁₀ к общему количеству коферментов Q₁₀, и стандартизацию указанного содержания и уровня восстановленного кофермента Q₁₀, которые могут быть, как минимум, гарантированы. Этот способ был продемонстрирован несколькими легкими и доступными для осуществления экспериментами, проведенными авторами настоящего изобретения.

В качестве микроорганизмов, продуцирующих вышеупомянутый восстановленный кофермент Q₁₀, применяемый в настоящем изобретении, могут быть использованы любые бактерии, дрожжи и грибки без каких либо ограничений. В качестве конкретных примеров вышеуказанных микроорганизмов, могут быть упомянуты, например, микроорганизмы рода Agrobacterium, рода Aspergillus, рода Acetobacter, рода Aminobacter, рода Agromonas, рода Acidiphilium, рода Bulleromyces, рода Bullera, рода Brevundimonas, рода Cryptococcus, рода Chionosphaera, рода Candida, рода Cerinosterus, рода Exisophiala, рода Exobasidium, рода Fellomyces, рода Filobasidiella, рода Filobasidium, рода Geotrichum, рода Graphiola, рода Gluconobacter, рода Kockovaella, рода Kurtzmanomyces, рода Lalaria, рода Leucosporidium, рода Legionella, рода Methylobacterium, рода Mycoplana, рода Oosporidium, рода Pseudomonas, рода Psedozyma, рода Paracoccus, рода Petromyces, рода Rhodotorula, рода Rhodosporidium, рода Rhizomonas, рода Rhodobium, рода Rhodoplanes, рода Rhodopseudomonas, рода Rhodobacter, рода Sporobolomyces, рода Sporidiobolus, рода Saitoella, рода Schizosaccharomyces, рода Sphingomonas, рода Sporotrichum, рода Sympodiomycopsis, рода Sterigmatosporidium, рода Tapharina, рода Tremella, рода Trichosporon, рода Tilletiaria, рода Tilletia, рода Tolyposporium, рода Tilletiopsis, рода Ustilago, рода Udeniomyces, рода Xanthophilomyces, рода Xanthobacter, рода Paecilomyces, рода Acremonium, рода Hyhomonus и рода Rhizobium.

С точки зрения легкости и продуктивности культивирования, предпочтительными являются бактерии (предпочтительно, нефотосинтезирующие бактерии) и дрожжи. В качестве примеров бактерий могут быть упомянуты бактерии рода Agrobacterium, рода Gluconobacter и т.п. В качестве примеров дрожжей могут быть упомянуты, дрожжи рода Schizosaccharomyces, рода Saitoella и т.п.

В качестве предпочтительных видов могут быть упомянуты, например, Agrobacterium tumefacience IFО13263, Agrobacterium radiobacter ATCC4718, Aspergillus clavatus JCM1718, Acetobacter xylinum IFО15237, Aminobacter aganouensis JCM7854, Agromonas oligotrophica JCM1494, Acidiphilium multivorum JCM8867, Bulleromyces albus IFО1192, Bullera armeniaca IFО10112, Brevundimonas diminuta JCM2788, Cryptococcus laurentii IFO0609, Chionosphaera apobasidialis CBS7430, Candida curvata ATCC10567, Cerinosterus luteoalbus JCM2923, Exisophiala alcalophila JCM12519, Exobasidium gracile IFO7788, Fellomyces fuzhouensis IFO10374, Filobasidiella neoformans CBS132, Filobasidium capsuloigenum CBS1906, Geotrichum capitatum JCM6258, Graphiola cylindrica IFO6426, Gluconobacter suboxydans IFO3257, Kockovaella imperatae JCM7826, Kurtzmanomyces nectairei IFO10118, Lalaria cerasi CBS275.28, Leucosporidium scottii IFO1212, Legionella anisa JCM7573, Methylobacterium extorguens JCM2802, Mycoplana ramosa JCM7822, Oosporidium margaritiferum CBS2531, Pseudomonas denitrificans IAM 12023, Pseudomonas shuylkilliensis IAM 1092, Psedozyma aphidis CBS517.23, Paracoccus denitrificans JCM6892, Petromyces alliaceus IFO7538, Rhodotorula glutinis IFO1125, Rhodotorula minuta IFO0387, Rhodosporidium diobovatum ATCC1830, Rhizomonas suberifaciens IFO15212, Rhodobium orients JCM9337, Rhodoplanes elegans JCM9224, Rhodopseudomonas palustris JCM2524, Rhodobacter capsulatus SB1003, Sporobolomyces holsaticus IFO1034, Sporobolomyces pararoseus IFO0471, Sporidiobolus johnsonii IFO1840, Saitoella complicata IFO10748, Schizosaccharomyces pombe IFO0347, Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100, Sporotrichum cellulophilium ATCC20493, Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318, Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121, Sphingomonas adhesiva JCM7370, Tapharina caerulescens CBS351.35, Tremella mesenterica ATCC24438, Trichosporon cutaneum IFO1198, Tilletiaria anomala CBS436.72, Tilletia caries JCM1761, Tolyposporium bullatum JCM2006, Tilletiopsis washintonesis CBS544, Ustilago esculenta IFO9887, Udeniomyces megalosporus JCM5269, Xanthophilomyces dendrorhous IFO10129, Xanthobacter flavus JCM1204, Paecilomyces lilacinus ATCC10114, Acremonium chrysogenum ATCC11550, Hyphomonas hirschiana ATCC33886, Rhizobium meliloti АТСС9930, и т.п.

В качестве микроорганизмов, продуцирующих восстановленный кофермент Q₁₀, могут быть использованы не только вышеупомянутые микроорганизмы дикого типа, но также, предпочтительно, микроорганизмы, в которых, например, транскрипционная и трансляционная активность генов, подходящих для биосинтеза восстановленного кофермента Q₁₀ в вышеупомянутых микроорганизмах, или ферментативная активность экспрессированного белка является модифицированной или повышенной.

В качестве средства для модификации или повышения транскрипционной и трансляционной активности генов или ферментативной активности экспрессированного белка может быть упомянута рекомбинация генов (включая собственную модификацию, амплификацию и деструкцию гена, введение чужеродного гена и модификацию и пролиферацию введенных таким образом чужеродных генов) и мутагенез под действием мутагенов. В частности, предпочтительным является мутагенез под действием мутагенов.

Более предпочтительными микроорганизмами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются микроорганизмы, содержащие восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.%, предпочтительно не менее, чем 75 моль%, более предпочтительно, не менее чем 80 мол.%, еще более предпочтительно не менее чем 85 мол.% и наиболее предпочтительно не менее чем 90 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀, где оценку вышеупомянутых модифицированных микроорганизмов или микроорганизмов с улучшенными свойствами, предпочтительно микроорганизмов, мутированных мутагенами, проводят вышеупомянутым пролиферативным методом и вышеупомянутым методом измерений. При ферментативном продуцировании в промышленном масштабе предпочтительно используют микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать восстановленный кофермент Q₁₀ на единицу культуральной среды в количестве не менее чем 1 мкг/мл, предпочтительно не менее чем 2 мкг/мл, более предпочтительно не менее чем 3 мкг/мл, еще более предпочтительно не менее чем 5 мкг/мл, особенно предпочтительно не менее чем 10 мкг/мл, еще более предпочтительно не менее чем 15 мкг/мл и наиболее предпочтительно не менее чем 20 мкг/мл.

Мутагенез может быть осуществлен методом однократного мутагенеза, однако предпочтительно, чтобы мутагенез был осуществлен не менее 2-х раз. Это обусловлено тем, что, как было установлено, уровень продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ может быть увеличен на соответствующих стадиях мутагенеза. Нет необходимости говорить о том, что кандидатами микробных клеток, предназначенных для мутагенеза, являются клетки, продуцирующие по возможности наиболее высокий уровень восстановленного кофермента Q₁₀, где оценку проводят вышеупомянутым пролиферативным методом и вышеупомянутым методом измерения.

Мутагенез может быть осуществлен с использованием факультативных и истинных мутагенов. В широком смысле термин "мутаген" включает не только химические агенты, обладающие мутагенным действием, но также, например, такую обработку как УФ-облучение, индуцирующее мутагенез. В качестве примеров истинных мутагенов могут быть упомянуты этилметансульфонат, УФ-излучение, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, аналоги нуклеотидных оснований, такие как бромурацил и акридины, однако эти примеры не имеют конкретных ограничений.

В соответствии со стандартной техникой мутагенеза, успешно применяемой для осуществления мутагенеза, проводят "правильный" отбор микробных клеток, обладающих высокой способностью продуцировать восстановленный кофермент Q₁₀. Для этого культура, полученная из одиночной колонии, должна быть оценена, например, вышеупомянутым пролиферативным методом и вышеупомянутым методом измерения. Поскольку кристаллы восстановленного кофермента Q₁₀ образуют белый твердый слой или бесцветную жидкую фазу, то продуктивность восстановленного кофермента Q₁₀ может быть соответствующим образом оценена вышеупомянутым методом измерения в процессе отбора колоний.

В способах настоящего изобретения высокая степень продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ при ферментативном продуцировании в промышленном масштабе может частично достигаться с использованием микробных клеток, содержащих восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.% по отношению к общему количеству коферментов Q₁₀, и частично в подходящих условиях культивирования (ферментации), способствующих увеличению уровня продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀ на единицу культуральной среды, как описано ниже. Особенно предпочтительным является комбинированное использование подходящих микробных клеток, описанных выше, и подходящих условий культивирования (ферментации), описанных ниже.

Культивирование осуществляют в основном в культуральной среде, содержащей основные питательные вещества и микроэлементы, необходимые для размножения микроорганизмов. В качестве указанных питательных веществ могут быть упомянуты, например, источники углерода (например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, кукурузный сироп и мелассы; спирты, такие как метанол и этанол), источники азота (например, жидкий кукурузный экстракт, сульфат аммония, фосфат аммония, гидроксид аммония, мочевина и пептон), источники фосфора (например, фосфат аммония и фосфорная кислота) и микроэлементы (например, минералы, такие как магний, калий, цинк, медь, железо, марганец, молибден, серная кислота и соляная кислота; витамины, такие как биотин, дезтиобиотин и витамин В1; аминокислоты, такие как аланин и гистидин; и природное сырье, содержащее витамины, такие как дрожжевой экстракт и солодовый экстракт); однако могут быть использованы любые питательные элементы без каких-либо ограничений. Иногда в природных компонентах культуральной среды, такой как дрожжевой экстракт, содержатся источники фосфора, такие как фосфаты. Вышеупомянутые питательные элементы могут быть использованы в соответствующих комбинациях.

Культивирование обычно осуществляют при температуре в пределах от 15 до 45°С, а предпочтительно от 20 до 37^оС. Если температура составляет ниже 15°С, то скорость размножения микроорганизмов слишком низка для промышленного производства, тогда как высокие температуры, превышающие 45°С, значительно ограничивают жизнеспособность микроорганизмов.

В основном культивирование осуществляют при рН в пределах от 4 до 9, а предпочтительно от 5 до 8. Если рН составляет не более чем 3 или не менее чем 10, то размножение микроорганизмов значительно замедляется.

Хотя ферментативное продуцирование в промышленных масштабах зависит от вида микроорганизмов, однако предпочтительно, чтобы концентрация источников углерода (включая продуцированные спирты) в процессе культивирования регулировалась так, чтобы она не оказывала значительного негативного воздействия на уровни продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀. В соответствии с этим данную культуру предпочтительно регулировать так, чтобы концентрация содержащихся в ней источников углерода не оказывала значительного негативного воздействия на уровень продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀, то есть так, чтобы концентрация этих источников в бульоне составляла в основном не более чем 20 г/л, предпочтительно не более чем 5 г/л, а более предпочтительно не более чем 2 г/л.

Для регуляции концентрации источников углерода предпочтительно использовать клеточную культуру с подпиткой. Концентрацию источника углерода в бульоне можно регулировать путем скорректированной подачи источников питательных веществ (особенно источников углерода), исходя из контрольных показателей данной культуры, таких как рН, концентрация растворенного кислорода (DO) или остаточная концентрация сахаридов. Хотя такая регуляция зависит от вида микроорганизма, однако подача источников питательных веществ может быть начата в начальной стадии инициирования или в процессе культивирования. Подача источников питательных веществ может осуществляться непрерывно или периодически. Иногда при подаче источников питательных веществ может оказаться предпочтительным вводить вышеупомянутые источники углерода в культуральную среду отдельно от других компонентов.

Культивирование может быть завершено, когда будет продуцировано нужное количество восстановленного кофермента Q₁₀. Время культивирования не имеет конкретных ограничений, и обычно оно составляет 20-200 часов.

Вышеупомянутое культивирование обычно осуществляют в аэробных условиях. Термин "аэробные условия" означает условия, при которых кислород подается так, чтобы в процессе культивирования не было ограничений в поступлении кислорода (его дефицита), а предпочтительно условия, при которых кислород подается в достаточном количестве, так, чтобы в процессе культивирования не наблюдалось какого-либо значительного ограничения его поступления. Такое культивирование обычно осуществляют в условиях аэрации, а предпочтительно в условиях аэрации и перемешивания.

Использование вышеупомянутых микроорганизмов и условий культивирования дает возможность получить микробные клетки, содержащие восстановленный кофермент Q₁₀ в количестве не менее чем 70 мол.%, а предпочтительно не менее чем 75 мол.% от общего количества коферментов Q₁₀. Кроме того, может быть достигнут уровень продуцирования восстановленного кофермента Q₁₀, составляющий не менее чем 1 мкг/мл, предпочтительно не менее чем 2 мкг/мл и еще более предпочтительно не менее чем 3 мкг/мл.

Ниже будет описано выделение восстановленного кофермента Q₁₀, продуцируемого вышеупомянутым методом культивирования.

В соответствии с настоящим изобретением, эффективное продуцирование восстановленного кофермента Q₁₀ в промышленном масштабе может быть осуществлено частично вышеупомянутым подходящим способом культивирования и частично подходящим способом выделения восстановленного кофермента Q₁₀, как описано ниже.

Выделение восстановленного кофермента Q₁₀ осуществляют путем экстракции из микробных клеток, полученных вышеупомянутым способом культивирования с использованием органического растворителя.

При такой экстракции клетки могут быть, но необязательно, подвергнуты разрушению. Разрушение клеток способствует эффективной экстракции восстановленного кофермента Q₁₀, продуцированного и аккумулированного в клетках. Нет необходимости говорить о том, что разрушение и экстракция клеток могут быть осуществлены одновременно.

В некоторых случаях "разрушение" в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлено лишь до определенной степени, при которой разрушается поверхностная структура, такая как клеточная стенка, что позволяет осуществлять экстракцию восстановленного кофермента Q₁₀, а поэтому нет необходимости в проведении стадий лизиса или фрагментации микробных клеток.

В случае бактерий вышеупомянутое разрушение клеток не является обязательным. Однако в случае использования дрожжей или грибов разрушение клеток в основном является необходимым, а если клетки не подвергаются разрушению, то это создает определенные трудности для эффективного выделения восстановленного кофермента Q₁₀, продуцируемого и аккумулируемого в этих клетках.

Вышеупомянутое разрушение микробных клеток может быть осуществлено нижеследующим одним или несколькими методами разрушения, причем порядок их осуществления не имеет существенного значения. В качестве примеров методов разрушения могут быть упомянуты физическая обработка, химическая обработка, ферментативная обработка, а также термообработка, автолиз, осмолизис и плазмоптиз и т.п.

Вышеупомянутая физическая обработка может быть осуществлена, например, с использованием гомогенизатора высокого давления, ультразвукового гомогенизатора, пресса Френча, шаровой мельницы и т.п. или их комбинаций.

Вышеупомянутая химическая обработка может быть осуществлена, например, с использованием кислоты (предпочтительно сильной кислоты), такой как соляная кислота и серная кислота, основания (предпочтительно сильного основания), такого как гидроксид натрия и гидроксид калия и т.п. или их комбинаций.

Вышеупомянутая ферментативная обработка может быть осуществлена, например, с использованием лизоцима, зимолиазы, глюканазы, новозима, протеазы, целлюлазы и т.п. либо с использованием их соответствующих комбинаций.

Вышеупомянутая термообработка может быть осуществлена, например, путем нагревания до температуры в пределах от 60 до 100°С в течение периода времени примерно от 30 минут до 3 часов.

Вышеупомянутый автолиз может быть осуществлен, например, путем обработки растворителем, таким как этилацетат.

Осмолизис или плазмоптиз, применяемый для разрушения клеток и осуществляемый путем обработки клеток раствором, имеющим концентрацию соли, отличающуюся от концентраций, присутствующих в данных клетках, часто проводят путем комбинированного применения физической обработки, химической обработки, ферментативной обработки, термообработки, автолиза и/или т.п., поскольку вышеупомянутые методы лизиса, осуществляемые отдельно, являются недостаточными для эффективного разрушения.

Из вышеупомянутых методов разрушения клеток методом, используемым в качестве предварительной обработки перед экстракцией и выделением восстановленного кофермента Q₁₀, является физическая обработка, химическая обработка (в частности, обработка кислотой, а предпочтительно сильной кислотой (например, кислотой, имеющей значение рКа, не превышающее 2,5, и используемой в виде водного раствора) в условиях, при которых восстановленный кофермент Q₁₀ защищен от реакции окисления, как описано ниже), при этом предпочтительной является термообработка. С точки зрения эффективности разрушения, более предпочтительной является физическая обработка.

Применение стандартного метода разрушения клеток и метода экстракции кофермента Q₁₀, а в частности, метода, предусматривающего экстракцию кофермента Q₁₀ органическим растворителем в присутствии гидроксида натрия и пирогаллола, представляет определенные трудности, связанные с высокими экономическими затратами, необходимостью в обработке отходов, безопасностью эффективной утилизации отработанных микроорганизмов (клеточные отходы), такой как выделение белков и т.п. Однако метод разрушения клеток, в частности, метод физической обработки согласно изобретению, не приводит к субгенерированию больших количеств солей при нейтрализации и является подходящим методом с точки зрения обработки отходов и эффективной утилизации отработанных микроорганизмов (клеточных отходов).

Микробные клетки, применяемые в вышеупомянутом способе разрушения клеток, могут быть использованы в виде бульона, концентрированного бульона, в виде сырых микробных клеток, собранных из этого бульона, в виде продукта, полученного путем их промывки, в виде суспензии сырых клеток в растворителе (включая, например, воду, физиологический раствор, буферы и т.п.), в виде сухих клеток, полученных путем сушки вышеупомянутых сырых клеток, в виде суспензии сухих клеток в растворителе (включая, например, воду, физиологический раствор, буферы и т.п.) и т.п. Предпочтительными являются водные суспензии микробных клеток, а с точки зрения удобства применения и т.п., более предпочтительными являются бульон, концентрированный бульон и продукт, полученный путем их промывки.

Микробные клетки или продукты их разрушения, применяемые для экстракции и выделения восстановленного кофермента Q₁₀, могут быть использованы в форме, аналогичной описанной выше, и не имеют конкретных ограничений, и такими клетками могут быть сырые/сухие клетки указанных микробных клеток или продуктов их разрушения. Предпочтительными являются водные суспензии микробных клеток или продуктов их разрушения, а более предпочтительными являются бульон, концентрированный и/или промывочный бульон или растворы, полученные при разрушении клеток (каждый из них является водной суспензией).

Концентрация клеток в вышеупомянутой суспензии микробных клеток или продукта их разрушения не имеет конкретных ограничений, и обычно она составляет от 1 до 25 мас.% из расчета сухой массы. С точки зрения экономических затрат, предпочтительной является концентрация от 10 до 20 мас.%.

Восстановленный кофермент Q₁₀ может быть выделен путем экстракции микробных клеток и продукта их разрушения, полученных указанным способом с использованием органического растворителя.

В качестве органического растворителя, применяемого для экстракции, могут быть упомянуты углеводороды, эфиры жирной кислоты, простые эфиры, спирты, жирные кислоты, кетоны, азотные соединения (включая нитрилы и амиды), соединения серы и т.п.

В частности, при экстракции