Дипептиды, содержащие на n-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу, в качестве ингибиторов вазопептидазы

Дипептиды, содержащие на n-концевом аминокислотном остатке 2-тиоацильную группу, в качестве ингибиторов вазопептидазы

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам вазопептидазы, описанным ниже, которые используются в качестве двойных ингибиторов как ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ), так и нейтральной эндопептидазы (NEP, КФ 3.4.24.11). Соединения по изобретению прежде всего используются для лечения и/или профилактики состояний, чувствительных к ингибированию АСЕ и NEP, прежде всего сердечно-сосудистых нарушений, таких, как гипертензия, изолированная систолическая гипертензия, почечная недостаточность (включая отек и удерживание солей), отек легких, гипертрофию левого желудочка, сердечную недостаточность (включая застойную сердечную недостаточность) и атеросклероз. Кроме того, соединения по изобретению применяются для снижения повышенного уровня холестерина в плазме крови у млекопитающих. Кроме того, эти соединения ингибируют также эндотелинконвертирующий фермент (ЕСЕ) и используются для лечения и/или профилактики состояний, чувствительных к ингибированию ЕСЕ.

Благодаря ингибированию нейтральной эндопептидазы соединения по изобретению можно также использовать для лечения боли, депрессии, некоторых психотических состояний и расстройств умственных способностей. Другие возможные показания включают лечение стенокардии, предменструального синдрома, болезни Меньера, гиперальдостеронизма, гиперкальциурии, асцитов, глаукомы, астмы и нарушений в желудочно-кишечном тракте, таких, как диарея, слизистый колит и повышенная кислотность желудочного сока.

Благодаря ингибированию ЕСЕ соединения по изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики эндотелин-зависимых состояний и заболеваний, включая церебральную ишемию (инсульт), субарахноидальное кровотечение, травматические повреждения мозга, церебральный вазоспазм, артериальную гипертрофию, рестеноз, болезнь Рейно, инфаркт миокарда, ожирение, а также гипертрофию предстательной железы, мигрень, сахарный диабет (диабетическая нефропатия), преэклампсию, глаукому и отторжение транплантата, такого, как аорта или целый орган, а также эректильную дисфункцию.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I

где R означает водород, (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил(низш.)алкил или циклоалкил(низш.)алкил,

R₁ означает (низш.)алкил, циклоалкил, карбоциклический или гетероциклический арил, или R₁ означает (циклоалкил, карбоциклический арил или биарил, гетероциклический арил или биарил)(низш.)алкил,

alk означает (низш.)алкилен,

R₃ означает водород или ацил,

R₄ означает водород, необязательно замещенный (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил, (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.) алкил, циклоалкил, циклоалкил (низш.)алкил, биарил, биарил(низш.)алкил, оксациклоалкил, тиациклоалкил, азациклоалкил или (оксациклоалкил, тиациклоалкил или азациклоалкил)(низш.)алкил,

R₅ означает водород или (низш.)алкил или

R₄ и R₅ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают циклоалкилиден, конденсированный бензоциклоалкилиден или 5- или 6-членный (оксациклоалкилиден, тиациклоалкилиден или азациклоалкилиден), каждый из которых необязательно замещен (низш.)алкилом или арил(низш.)алкилом,

R₆ означает (низш.)алкил, карбоциклический или гетероциклический арил, (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, циклоалкил, циклоалкил (низш.)алкил, биарил или биарил(низш.)алкил,

R₇ означает (низш.)алкил, (карбоциклический или гетероциклический арил) (низш.)алкил, циклоалкил (низш.)алкил или биарил(низш.)алкил или

R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают 3-10-членный циклоалкилиден, который необязательно замещен (низш.)алкилом или арил(низш.)алкилом, или конденсирован с насыщенным или ненасыщенным карбоциклическим 5-7-членным циклом, или 5- или 6-членный (оксациклоалкилиден, тиациклоалкилиден или азациклоалкилиден), каждый из которых необязательно замещен (низш.)алкилом или арил (низш.)алкилом, или 2,2-норборнилиден,

Х означает -О-, -S(О)_n-, -NHSO₂- или -NHCO-,

n равно 0, 1 или 2, а

COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира,

и к дисульфидным производным указанных соединений, где R₃ означает водород, и к их фармацевтически приемлемым солям.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные соединения, способам получения указанных соединений, промежуточным соединениям и способам лечения нарушений у млекопитающих, которые чувствительны к ингибированию АСЕ и NEP при введении указанных соединений млекопитающим, нуждающимся в таком лечении.

Кроме того, настоящее изобретение включает любые пролекарства соединений по изобретению, содержащих свободный карбоксил, сульфгидрильную или гидроксильную группу, причем указанные пролекарства при сольволизе или в физиологических условиях превращаются в соединения, содержащие свободные карбоксильную, сульфгидрильную и/или гидроксильную группу. Пролекарствами являются, например, сложные эфиры карбоновых кислот и S-ацил- и O-ацилпроизводные тиолов, спиртов или фенолов, в которых ацил имеет значения, указанные в тексте заявки.

Фармацевтически приемлемыми сложными эфирами предпочтительно являются такие пролекарства в виде сложных эфиров, которые при сольволизе или в физиологических условиях превращаются в свободные карбоновые кислоты формулы I.

Фармацевтически приемлемые сложные эфиры, используемые в качестве пролекарств, предпочтительно означают, например, (низш.)алкильные, арил(низш.)алкильные, α-((низш.)алканоилокси)(низш.)алкильные сложные эфиры, такие, как пивалоилоксиметиловый эфир и α-((низш.)алкоксикарбонил, морфолинокарбонил, пиперидинокарбонил, пирролидинокарбонил или ди(низш.) алкиламинокарбонил)(низш.)алкильные сложные эфиры.

Фармацевтически приемлемые соли означают соли фармацевтически приемлемых оснований любых кислотных соединений по изобретению, например, таких соединений, в которых COOR₂ означает карбоксил. Такие соли включают, например, соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочно-земельных металлов (например, соли магния и кальция), соли аминов (например, соли трометамина).

В зависимости от природы заместителя соединения формулы I могут содержать два или более асимметрических атома углерода. Настоящее изобретение включает диастереомеры и оптические антиподы соединений по изобретению. Предпочтительная конфигурация показана на формуле Ia

где асимметрические атомы углерода, содержащие заместители -alk-X-R₁ и R₄ обычно находятся в S-конфигурации.

Предпочтительными являются соединения формул I и Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает (низш.)алкил, С₅- или С₆циклоалкил, карбоциклический или гетероциклический арил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, alk означает (низш.)алкилен, Х означает -О- или -S(O)_n-, где n равно 0 или 2, R₃ означает водород или ацил, R₄ означает необязательно замещенный (низш.)алкил, оксациклоалкил, оксациклоалкил(низш.)алкил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, R₅ означает водород или R₄ и R₅ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают С₅- или С₆циклоалкилиден, R₆ и R₇ означают (низш.)алкил, или R₆ и R₇ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, означают С₅- или С₆циклоалкилиден, COOR₂ означает карбоксил или производное карбоксильной группы в форме фармацевтически приемлемого сложного эфира, и дисульфидные производные указанных соединений, в которых R₃ означает водород и их фармацевтически приемлемые соли.

Кроме того, предпочтительными являются соединения формул I и Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает карбоциклический или гетероциклический арил или (карбоциклический или гетероциклический арил)(низш.)алкил, R₃ означает водород или необязательно замещенный (низш.)алканоил, R₄ означает (низш.)алкил, циклоалкил, тетрагидропиранил или С₁-С₄(низш.)алкокси(низш.)алкил, R₆ и R₇ оба означают С₁-С₄алкил и являются идентичными, Х означает -О- или -S-, alk означает метилен, COOR₂ означает карбоксил, (низш.)алкоксикарбонил, (ди(низш.)алкиламинокарбонил)(низш.) алкоксикарбонил или (морфолинокарбонил, пиперидинокарбонил, пирролидинокарбонил)(низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли.

Предпочтительными прежде всего являются соединения формул I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает карбоциклический арил или карбоциклический арил(низш.)алкил, в котором карбоциклический арил означает фенил или фенил, замещенный одной или двумя гидроксигруппами, (низш.)алканоилокси, (низш.)алкил, (низш.)алкокси, трифторметил, трифторметокси или галоген, R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, необязательно замещенный (низш.)алкоксигруппой, R₄ означает (низш.)алкил, 4-тетрагидропиранил или С₁-С₄(низш.)алкокси(С₁-С₄)(низш.)алкил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен или этилен, a COOR₂ означает карбоксил или (низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли. Одим из вариантов являются соединения, в которых R₃ означает водород или (низш.)алканоил.

Кроме того, предпочтительными являются указанные выше соединения формулы I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает фенил, фторфенил, бензил или фторбензил, R₃ означает водород, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный (низш.)алкоксигруппой, R₄ означает изопропил, трет-бутил, 1-метоксиэтил или 4-тетрагидропиранил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен, a COOR₂ означает карбоксил или (низш.)алкоксикарбонил, и их фармацевтически приемлемые соли. Одим из вариантов являются соединения, в которых R₃ означает водород или (низш.)алканоил.

Предпочтительными являются прежде всего соединения формул I или Ia, где R и R₅ означают водород, R₁ означает бензил, R₃ означает водород, ацетил или мстоксиацетил, R₄ означает изопропил или трет-бутил, R₆ и R₇ означают метил, Х означает -О-, alk означает метилен, а COOR₂ означает карбоксил или этоксикарбонил, или их фармацевтически приемлемые соли.

Если не указано иное, термины в объеме настоящего изобретения имеют следующие значения независимо от того, используются эти термины отдельно или в различных сочетаниях.

Арил означает карбоциклический или гетероциклический арил, как моноциклический, так и бициклический.

Моноциклический карбоциклический арил означает необязательно замещенный фенил, предпочтительно фенил или фенил, замещенный одним или тремя заместителями, предпочтительно такими, как (низш.)алкил, гидрокси, (низш.)алкокси, ацилокси, галоген, циано, трифторметил, трифторметокси, амино, (низш.)алканоиламино, (низш.)алкил(тио, сульфинил или сульфонил), (низш.)алкоксикарбонил, моно- или ди(низш.) алкилкарбамоил или моно- или ди(низш.)алкиламино, или фенил, замещенный (низш.)алкилендиокси.

Бициклический карбоциклический арил означает 1- или 2-нафтил или 1- или 2-нафтил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой или галогеном.

Моноциклический гетероциклический арил предпочтительно означает необязательно замещенный тиазолил, пиримидил, триазолил, тиенил, фуранил или пиридил.

Необязательно замещенный фуранил означает 2- или 3-фуранил или 2- или 3-фуранил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный пиридил означает 2-, 3- или 4-пиридил или 2-, 3- или 4-пиридил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом, галогеном или цианогруппой.

Необязательно замещенный тиенил означает 2- или 3-тиенил или 2- или 3-тиенил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный пиримидил означает, например, 2-пиримидил или 2-пиримидил, замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный тиазолил означает, например, 2-тиазолил или 2-тиазолил, замещенный (низш.)алкилом.

Необязательно замещенный триазолил означает, например, 1,2,4-триазолил или 1,2,4-триазолил, предпочтительно замещенный (низш.)алкилом.

Бициклический гетероциклический арил предпочтительно означает индолил, бензотиазолил, хинолинил или изохинолинил, необязательно замещенный гидроксигруппой, (низш.)алкилом, (низш.)алкоксигруппой или галогеном, предпочтительно 3-индолил, 2-бензотиазолил или 2- или 4-хинолинил.

Арил в группе арил(низш.)алкил предпочтительно означает фенил или фенил, замещенный одним или двумя группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси, (низш.)алканоилокси, галоген, трифторметил, циано, (низш.)алканоиламино или (низш.)алкоксикарбонил, а также необязательно замещенный нафтил.

Арил(низш.)алкил предпочтительно означает бензил или 1- или 2-фенетил, необязательно замещенный в группе фенил одной или двумя группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, гидрокси, (низш.)алканоилокси, галоген или трифторметил.

Термин «низш.», используемый в тексте в связи с органическими радикалами или соединениями, соответственно означает радикалы или соединения, содержащие включительно до 7, предпочтительно включительно до 4 и предпочтительно один или два атома углерода. Такие радикалы или соединения могут иметь прямую или разветвленную углеродную цепь.

Необязательно замещенный (низш.)алкил означает (низш.)алкил или (низш.)алкил, замещенный, например, группами ряда галоген, гидрокси, (низш.)алкокси, амино, (моно- или ди(низш.)алкил)амино, ациламино, 1-(низш.)алкилпиперазино, морфолино, пиперидино, пирролидино и т.п.

(Низш.)алкилен означает прямую или разветвленную углеродную цепь, предпочтительно содержащую от 1 до 4 атомов углерода, замещенную, например, (низш.)алкоксигруппой, например, -СН₂-, -СН(СН₃)-, -СН₂СН₂- и т.п.

(Низш.)алкил предпочтительно содержит 1-4 атома углерода, является прямым или разветвленным и означает, например, этил, пропил, бутил или предпочтительно метил.

(Низш.)алкоксигруппа предпочтительно содержит 1-4 атома углерода, является прямой или разветвленной и означает, например, метокси, пропокси, изопропокси или предпочтительно этокси.

Циклоалкил означает насыщенный циклический углеводородный радикал, который предпочтительно содержит в цикле от 5 до 7 атомов углерода, предпочтительно циклопентил или циклогексил.

Оксациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный оксациклоалкил, например, тетрагидропиранил, такой, как 4-тетрагидропиранил.

Тиациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный тиациклоалкил, например, тетрагидротиапиранил, такой, как 4-тетрагидротиапиранил.

Азациклоалкил предпочтительно означает 5-7-членный азациклоалкил, например пирролидинил или пиперидинил, в котором атом азота замещен группой (низш.)алкил или арил(низш.)алкил.

Термин циклоалкил(низш.)алкил предпочтительно означает (циклопентил или циклогексил)метил, 1- или 2-(циклопентил или циклогексил)этил, 1-, 2- или 3-(циклопентил или циклогексил)пропил или 1-, 2-, 3- или 4-(циклопентил или циклогексил)бутил. То же самое относится к (оксациклил, тиациклоалкил или азациклоалкил)(низш.)алкилу.

(Низш.)алкоксикарбонильная группа предпочтительно содержит в группе алкокси от 1 до 4 атомов углерода и означает, например, метоксикарбонил, пропоксикарбонил, изопропоксикарбонил или предпочтительно этоксикарбонил.

Циклоалкилиден является 3-10-членным, предпочтительно 5- или 6-членным, и означает циклоалкановую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому циклоалканового кольца присоединены две группы;

5- или 6-членный оксациклоалкилиден означает тетрагидрофурановую или тетрагидропирановую связывающую группу, например тетрагидрофуранилиден или тетрагидропиранилиден, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы;

5- или 6-членный тиациклоалкилиден означает тетрагидротиофеновую или тетрагидротиопирановую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы;

5- или 6-членный азациклоалкилиден означает пирролидиновую или пиперидиновую связывающую группу, к которой по одному и тому же атому углерода соответствующего цикла, например, по положению 3 или 4, присоединены две группы, а атом азота замещен (низш.)алкилом, например метилом, или арил(низш.)алкилом, например бензилом.

Конденсированный бензоциклоалкилиден означает, например, 1,1- или 2,2-тетралинилиден или 1,1- или 2,2-инданилиден.

Галоген (гало) предпочтительно означает фтор или хлор, а также бром или иод.

Ацил образуется из карбоновой кислоты и предпочтительно означает необязательно замещенный (низш.)алканоил, карбоциклический арил(низш.)алканоил, ароил, (низш.)алкоксикарбонил или арил(низш.)алкоксикарбонил, преимущественно необязательно замещенный (низш.)алканоил, или ароил.

(Низш.)алканоил предпочтительно означает ацетил, пропионил, бутирил или пивалоил.

Необязательно замещенный (низш.)алканоил означает, например, (низш.)алканоил или (низш.)алканоил, замещенный, например, группами ряда (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоилокси, (низш.)алканоилтио, (низш.)алкокси, (низш.)алкилтио, гидрокси, ди(низш.)алкиламино, (низш.)алканоиламино, морфолино, пиперидино, пирролидино, 1-(низш.)алкилпиперазино, арил или гетероарил.

Ароил означает карбоциклический или гетероциклический ароил, предпочтительно моноциклический карбоциклический или моноциклический гетероциклический ароил.

Моноциклический карбоциклический ароил предпочтительно означает бензоил или бензоил, замещенный группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, галоген или трифторметил.

Моноцикличсский гетероциклический ароил предпочтительно означает пиридилкарбонил или тиенилкарбонил.

Ацилокси предпочтительно означает необязательно замещенный группами ряда (низш.)алканоилокси, (низш.)алкоксикарбонилокси, моноциклический карбоциклический ароилокси или моноциклический гетероциклический ароилокси.

Арил(низш.)алкоксикарбонил предпочтительно означает моноциклический карбоциклический (низш.)алкоксикарбонил, предпочтительно бензилоксикарбонил.

Биарил означает монокарбоциклический арил, замещенный моноциклическим карбоциклическим или моноциклическим гетероциклическим арилом, и предпочтительно означает бифенилил, предпочтительно 4-бифенилил, необязательно замещенный в одном или двух бензольных циклах группами ряда (низш.)алкил, (низш.)алкокси, галоген или трифторметил.

Биарил(низш.)алкил предпочтительно означает 4-бифенилил(низш.)алкил, предпочтительно 4-бифенилилметил.

Новые соединения по изобретению являются ингибиторами АСЕ, ингибирующими конверсию ангиотензина I с образованием вазопрессорного (сосудосуживающего) соединения ангиотензина II и, таким образом, снижают кровяное давление в организме млекопитающих. Кроме того, соединения по изобретению ингибируют NEP и, таким образом, стимулируют сердечно-сосудистое действие (например, диуретическое и натрийуретическое) атриальных натрийуретических факторов (ANF). Комбинированное действие является полезным при лечении сердечно-сосудистых нарушений у млекопитающих, прежде всего гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, таких, как застойная сердечная недостаточность, и почечная недостаточность. Другим полезным действием соединений по изобретению при терапии указанных сердечно-сосудистых нарушений является ингибирование ECE.

Указанные свойства подтверждаются при испытаниях in vitro и in vivo, предпочтительно с использованием млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян, или при испытании на изолированных органах, тканях и их препаратах. Указанные соединения можно применять in vitro в форме растворов, например, предпочтительно водных растворов, и in vivo при энтеральном, парентеральном, предпочтительно при оральном (пероральном) и внутривенном способе введении, например, в виде суспензии или водного раствора. Дозы при испытаниях in vitro составляют от приблизительно 10^-6 до 10^-9 молярных концентраций. Дозы при испытаниях in vivo в зависимости от способа введения составляют от приблизительно 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,1 до 25 мг/кг.

Для испытаний in vitro наиболее пригодны свободные карбоновые кислоты соединений по изобретению. Анализируемое соединение растворяют в диметилсульфоксиде, этаноле или 0,25 М растворе бикарбоната натрия, а затем разбавляют буферным раствором до необходимой концентрации.

Ингибирование АСЕ соединениями по изобретению в условиях in vitro определяют по методу, описанному в Biochem. Pharmacol, 20, 1637 (1971). Буферный раствор для анализа ингибирования АСЕ имеет следующий состав: 300 мМ NaCl, 100 мМ КН₂PO₄ (рН 8,3). Для инициирования реакции в пробирку, содержащую фермент и лекарственное средство в объеме 150 мкл, добавляют 100 мкл гиппурил-гистидил-лейцина (2 мг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,75 мл 0,6 н. NaOH. Затем в пробирки добавляют 100 мкл свежеприготовленного раствора орто-фталевого альдегида (2 мг/мл в метаноле), перемешивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и добавляют 100 мкл 6 н. HCl. Пробирки центрифугируют и в супернатанте определяют оптическую плотность при 360 нм. Для определения величины IC₅₀ строят график зависимости оптической плотности от концентрации лекарственного средства. IC₅₀ означает концентрацию лекарственного средства, при которой наблюдается ингибирование ферментативной активности на 50% по сравнению с контрольными образцами, не содержащими лекарственного средства.

Обычно при ингибировании АСЕ соединениями по изобретению значения IC₅₀ составляют от приблизительно 0,1 до 50 нМ.

При испытании in vitro типичное соединение по изобретению (пример 6(а)) характеризуется значением IC₅₀ приблизительно 20 нМ.

Ингибирование АСЕ можно продемонстрировать in vivo при пероральном или внутривенном введении по ингибированию прессорной ответной реакции, индуцированной ангиотензином I у крыс с нормальным артериальным давлением.

Испытания in vivo при внутривенном введении проводят на находящихся в сознании самцах крыс с нормальным артериальным давлением. В бедренную артерию и бедренную вену вводят катетеры соответственно для прямого измерения кровяного давления при внутривенном введении ангиотензина I и внутривенном или пероральном введении соединения по настоящему изобретению. После стабилизации артериального базального кровяного давления регистрировали прессорные ответные реакции на 3 или 4 стимуляции ангиотезином I (300 нг/кг, внутривенно, с интервалами 15 мин). Такие ответные реакции обычно регистрировали повторно через 15, 30, 60 и 90 мин, а затем каждый час вплоть до 6 ч после внутривенного или перорального введения анализируемого соединения, и сравнивали с исходными ответными реакциями. Любое наблюдаемое снижение указанной прессорной ответной реакции является признаком ингибирования АСЕ.

Типичное соединение по изобретению (пример 6(а)) ингибирует ответную прессорную реакцию, индуцированную ангиотензином I, через 3 ч при внутривенном введении в дозе 10 мг/кг. Аналогичным образом соединение, описанное в примере 1(а), ингибирует прессорную ответную реакцию, индуцированную ангиотензином I, через 6 ч при пероральном введении в дозе 11,8 мг/кг.

Ингибирование NEP (КФ 3.4.24.11) в условиях in vitro определяют по следующеей методике.

Активность NEP (КФ 3.4.24.11) определяют по гидролизу субстрата глутарил-ала-ала-фен-2-нафтиламида (GAAP) по модифицированной методике Orlowski и Wilk (1981). Реакционная смесь (общим объемом 125 мкл) имеет следующий состав: 4,5 мкл белка (мембраны коркового вещества почки крысы, полученные по методу Maeda и др. (1983)), 50 мМ трис-буферный раствор, рН 7,4 при 25°С, 500 мкМ субстрат (конечная концентрация) и лейцинаминопептидаза М (2,5 мкг). Смесь инкубируют при 25°С в течение 10 мин и добавляют 100 мкл раствора красителя прочно-темно-красный (гранатовый) (250 мкг/мл в 1 М ацетате натрия, рН 4,2, содержащем 10% твин 20). Активность фермента измеряют спектрофотомеричсским способом при 540 нм. Одна единица активности NEP 24.11 означает образование 2-нафтиламина со скоростью 1 нмоль/мин при 25°С и рН 7,4. Величина IC₅₀ означает концентрацию анализируемого соединения, необходимую для ингибирования образования 2-нафтиламина на 50%.

Кроме того, активность NEP определяют с использованием в качестве субстрата ANF. Активность гидролиза ANF определяют, измеряя скорость потребления ANF крысы (r-ANF) методом обращенно-фазовой ЖХВР (в течение 3 мин). Аликвотные части раствора фермента в 50 мМ трис-HCl буферном растворе (рН 7,4) предварительно инкубируют при 37°С в течение 2 мин и реакцию инициируют добавлением в общий объем 50 мкл 4 нмолей ANF крысы. Через 4 мин реакцию останавливают добавлением 30 мкл 0,27% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Одна единица активности означает гидролиз ANF крысы со скоростью 1 нмоль/мин при 37°С и рН 7,4. Величина IC₅₀ означает концентрацию анализируемого соединения, необходимую для ингибирования гидролиза ANF на 50%.

Обычно при ингибировании NEP соединениями по изобретению значения IC₅₀ составляют от приблизительно от 0,1 до 50 нМ.

У типичного соединения по изобретению (пример 6(а)) при испытании in vitro по скорости гидролиза GAAP значение IC₅₀ составляет приблизительно 5 нМ.

Действие соединений по изобретению на концентрацию ANF в плазме крови крысы определяют по следующей методике.

Самцов крыс Sprague-Dawley (массой 275-390 г) анестезируют кетамином (150 мг/кг)/ацепромазином (10%) и в бедренные артерию и вену вводят катетеры для отбора образцов крови и вливания ANF соответственно. Крыс фиксируют в шарнирном устройстве и оставляют в покое на 24 ч, чтобы привести в сознание и свободное состояние перед проведением испытаний.

При проведении испытаний в плазме определяют уровень ANF в присутствие и в отсутствии ингибирования NEP. В первый день испытаний всем животным проводят непрерывное вливание ANF со скоростью 450 нг/кг/мин внутривенно в течение всех 5 ч проведения эксперимента. Через 60 мин после начала вливания отбирают образцы крови для определения базового уровня ANF (время 0), а затем крыс произвольно разделяют на группы для введения анализируемого соединения или носителя. Дополнительные образцы крови отбирают через 30, 60, 120, 180 и 240 мин после введения анализируемого соединения.

Концентрацию ANF в плазме определяют специфичным радиоиммунным методом. Плазму разбавляют (в 12,5, 25 и 50 раз) буферным раствором следующего состава: 50 мМ трис (рН 6,8), 154 мМ NaCl, 0,3% бычий сывороточный альбумин, 0,01% ЭДТА. Затем к 100 мкл кроличьей сыворотки анти-rANF добавляют по 100 мкл стандартных растворов (rANF (99-126)) или образцов и инкубируют при 4°С в течение 16 ч. В реакционную смесь добавляют [¹²⁵I]rANF(10⁴ имп./мин) и инкубируют при 4°С в течение еще 24 ч. Затем в реакционную смесь добавляют козью сыворотку, содержащую коньюгат антикроличьего IgG на парамагнитных частицах, и связанный [¹²⁵I]rANF осаждают, помещая смесь на магнитную подставку. Супернатант декантируют, в осадке определяют радиоактивность на счетчике γ-излучения. Все анализы дублируют. Уровень ANF в плазме выражают в процентах от содержанию ANF в плазме животных, обработанных носителем и получавших лишь один ANF (450 нг/кг/мин внутривенно).

Типичное соединение по изобретению (пример 1(а)) в дозе 11,8 мг/кг (внутривенно) вызывает увеличение уровня ANF в плазме приблизительно на 70%.

Антигипертензивную активность определяют, например, с использованием спонтанно гипертензивных крыс (СГК) и гипертензивных крыс, получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), например, по методике, описанной Bazil и др., J.Cardiovasc. PharmacoL, 22, 897-905 (1993), и Trapani и др., J.Cardiovasc. PharmacoL, 14, 419-424 (1989) соответственно.

Типичное соединение по изобретению (пример 1(а)) приводит к снижению среднего значения артериального давления у СГК в сознании при однократном суточном введении 11,8 мг/кг (перорально).

Антигипертензивное дейстие определяют у гипертензивных крыс, получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), по следующей методике

Гипертензивных крыс (массой 280-380 г), получавших соль ацетата дезоксикортикостерона (DOCA), готовили к испытаниям стандартным способом. Крыс подвергали односторонней нефрэктомии (удаление одной почки) и через неделю имплантировали кремнийорганические гранулы, содержащие 100 мг/кг DOCA. В течении от трех до пяти недель крысам давали воду, содержащую 1% NaCl/0,2% KCl до появления у животных достоверной гипертензии. Затем проводили анализ гипертензивной активности.

За двое суток до начала эксперимента крыс анестезировалии метоксифлураном и в бедренную артерию вводили катетеры для измерения артериального давления. Через 48 ч регистрировали фоновое артериальное давление и частоту сердечных сокращений в течение 1 ч. Затем вводили анализируемое соединение или носитель и регистрировали указанные параметры в течение 5 ч.

Диуретическую (салуретическую) активность определяли стандартным диуретическим методом анализа, например, как описано в книге "New Antihypertensive Drugs, Spectrum Publications, 307-321 (1976), или измерением потенцирования ANF-индуцированного натрийуреза и диуреза у крыс.

Потенцирование натрийуретического действия ANF определяют по следующей методике.

Самцов крыс Sprague-Dawley (массой 280-390 г) анестезируют инактином (100 мг/кг, внутривенно) и в бедренную артерию, бедренную вену и в мочевой пузырь вводят катетеры для измерения артериального давления, введения ANF и сбора мочи соответственно. Непрерывное вливание обычного солевого раствора (33 мкл/мин) осуществляют в течение всего эксперимента для стимуляции диуреза и экскреции натрия. Протокол эксперимента включает сбор мочи в течение первых 15 мин (обозначенные как предварительный контроль) и последующие три периода дополнительного сбора мочи. Сразу после завершения периода предварительного контроля животным вводят анализируемое соединение или носитель и оставляют в покое в течение 45 мин. Затем в течение второго периода (обозначаемого как контроль в течение 15 мин) регистрируют кровяное давление и почечные параметры. По завершению этого периода всем животным вводят ANF (1 мкг/кг, внутривенное вливание) и в течение двух последующих 15-минутных периодов регистрируют артериальное давление и почечные параметры. В течение всех периодов сбора мочи определяют среднее артериальное давление, скорость потока мочи и экскрецию натрия в моче. Кровяное давление измеряют с использованием датчика кровяного давления (Gould p50), поток мочи определяют гравиметрическим методом, концентрацию натрия определяют пламенной фотометрией, а экскрецию натрия в моче рассчитывают по скорости потока мочи и концентрации натрия.

Ингибирование ЕСЕ in vitro определяют по следующей методике.

ЕСЕ выделяют в виде частично очищенного препарата из первичных эндотелиальных клеток аорты свиньи хроматографией на колонке с анионитом DE52, а активность определяют радиоиммунным методом, как описано в Anal. Biochem., 212, 434-436 (1993). В другом варианте нативный фермент заменяют рекомбинантной формой ЕСЕ, как описано, например, в Cell, 78, 478-485 (1994). Рядом авторов описан ЕСЕ-1 человека (Schmidt и др., FEBS Letters, 356, 238-243 (1994), Kaw и др., 4^th Conf.on Endothelin, April 23-25, London (UK) (1995) C6, Valdenaire и др., J.Biol. Chem., 270, 29794-29798 (1995), Shimada и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 207, 807-812 (1995)). Ингибирование ЕСЕ определяют по методике, описанной в Biochem. Mol. Biol. Int., 31, №5, 861-867 (1993), измеряя радиоиммунным методом количество ЕТ-1, образующееся из большого ЕТ-1.

В другом варианте используют рекомбинантный ЕСЕ-1 человека (rhECE-1), а анализ проводят по следующей методике.

Яйцеклетки китайского хомячка, экспрессирующие rhECE-1 (Kaw и др., 4^th Int Conf. on Endothelin, April 23-25, London (UK) (1995) C6), культивируют в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотик с фунгицидным действием (1х). Клетки соскребают сборщиком клеток, осаждают центрифугированием и гомогенизируют при 4°С в буферном растворе следующего состава: 5 мМ MgCl₂, 1 мкМ пепстатин А, 100 мкМ лейпептин, 1 мМ PMSF и 20 мМ трис, рН 7,0, в соотношении 2 мл буферного раствора/1 мл млеточной массы. Клеточный дебрис удаляют коротким центрифугированием, а супернатант центрифугируют посторно при 100000g в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендируют в буферном растворе, содержащем 200 мМ NaCl и 50 мМ TES, рН 7,0, при концентрации белка приблизительно 15 мг/мл и хранят в виде аликвотных частей при -80°С.

Для определения действия ингибитора на активность ЕСЕ - 1 10 мкг белка предварительно инкубируют с анализируемым соединением при необходимой концентрации при комнатной температуре в течение 20 мин в 50 мМ TES, рН 7,0, содержащем 0,005% тритона Х-100, в объеме 10 мкл. Затем добавляют большой ЕТ-1 человека (5 мкл) до конечной концентрации 0,2 мкМ и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение еще 2 ч. Реакцию останавливают добавлением 500 мкл буферного раствора для радиоиммунного анализа, содержащего 0,1% тритона Х-100, 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% NaN₃ в фосфатно-солевом буферном растворе.

Разбавленные образцы (200 мкл), полученные при указанном выше анализе ферментативной активности, в смеси с 25 мкл [¹²⁵I]ET-1 (10⁴ имп./пробирку) и 25 мкл разбавленного (1:20000) раствора кроличьих антител, специфичных в отношении С-концевого остатка триптофана ЕТ-1, инкубируют при 4°С в течение ночи. Затем в каждую пробирку добавляют конъюгат козьих антикроличьих антител на магнитных гранулах (70 мкг) и реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Гранулы осаждают на магнитной подставке, супернатант декантируют, в осадке определяют радиоактивность на счетчике γ-излучения. Общее и неспецифичсское связывание определяют в отсутствие нерадиоактивного ЕТ-1 и анти-ЕТ антител соответственно. В этих условиях ЕТ-1 и большой ЕТ-1 блокируют связывание [¹²⁵I]ET-1 с антителами, причем величина IC₅₀ составляет 21±2 и 260000±66000 (среднее значение ± средняя ошибка измерения, n=3-5) соответственно.

Для определения значений IC₅₀ для каждого ингибитора строят график зависимости ингибирующей активности от концентрации ингибитора. Для анализа данных по однофакторной модели используют программное обеспечение ALLFIT, совместимое с IBM.

Ингибирование ЕСЕ можно также определять in vivo при измерении ингибирования прессорной ответной реакции, индуцированной большим ЕТ-1 у анестезированных или находящихся в сознании крыс, как описано ниже. Действие ингибиторов на прессорную ответную реакцию, стимулированную введением большого ЕТ-1, измеряют на крысах Sprague-Dawley, как описано в Biochem. Mol. Biol. Int., 31, №5, 861-867 (1993). Результаты представляют в виде процента ингибирования прессорной ответной реакции, индуцированной большим ЕТ-1, по сравнению с введением носителя.

Самцов крыс Sprague-Dawley анестезируют инактином (100 мг/кг, внутрибрюшинно) и в бедренную артерию, и вену вводят катетеры для измерения среднего артериального давления (САД) и введения соединений соответственно. Затем проводят трахеотомию и в трахею вводят трубочку, чтобы обеспечить животному свободное дыхание. Температуру тела животных поддерживают на уровне 37±1°С с использованием обогреваемого покрытия. После проведения операции животных выдерживают до стабилизации САД, а затем блокируют вегетативную передачу нервного импульса введением хлоризондамина (3 мг/кг, внутривенно). Затем крысам вводят анализируемое соединение в дозе 10 мг/кг (внутривенно) или носитель и через 15 и 90 мин стимулируют введением большого ЕТ-1 (1 нмоль/кг, внутривенно). Обычно результаты представляют в виде максимального увеличения САД, вызванного введением большого ЕТ-1, у животных, обработанных анализируемым соединением или носителем.

Самцов крыс Sprague-Dawley анестезируют метогекситалом натрия (75 мг/кг, внутрибрюшинно) и в бедренные артерию и вену вводят катетеры для измерения среднего артериального давления (САД) и введения лекарственных средств соответственно. Катетеры фиксируют через шарнирную систему, которая обеспечивает свободное движение крыс после реабилитации. Крыс оставляют в покое в течение 24 ч до начала э