Антиген muc1 со сниженным числом повторяющихся vntr-блоков

Антиген muc1 со сниженным числом повторяющихся vntr-блоков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым нуклеиновокислотным конструктам, полезным в протоколах вакцинации нуклеиновой кислотой для лечения и профилактики опухолей, экспрессирующих MUC1. В частности, нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, и ДНК-конструкты содержат ген, кодирующий производное MUC1, имеющее менее чем 10 полностью повторяющихся блоков. Это изобретение дополнительно предлагает фармацевтические композиции, содержащие вышеуказанные конструкты, в частности фармацевтические композиции, адаптированные для доставки посредством частиц, способы для их получения и их применение в медицине. Также предложены новые протеины, кодируемые этой нуклеиновой кислотой, и фармацевтические композиции, содержащие их.

Предшествующий уровень техники

Муцин эпителиальных клеток MUC1 (также известный как эписиалин или полиморфный эпителиальный муцин, РЕМ) представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, экспрессирующийся на многих эпителиальных клетках. Этот протеин состоит из цитоплазматического хвоста, трансмембранного домена и варьирующего числа тандемных повторов мотива из 20 аминокислот (называемого здесь VNTR-мономер, он также может быть известным как VNTR-эпитоп или VNTR-повтор), содержащего большую долю остатков пролина, серина и треонина. Число повторов варьирует из-за генетического полиморфизма в локусе MUC1 и чаще всего находится в диапазоне 30-100 (Swallow et al., 1987, Nature 328:82-84). В нормальных эпителиях протоков протеин MUC1 найден только на апикальной поверхности клетки, обращенной к просвету протока (Graham et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 42:71-80; Barratt-Boyes et al., 1996, Cancer Immunol Immunother 43:142-151). Одним из наиболее поразительных свойств молекулы MUC1 является ее обширное гликозилирование по атомам кислорода. Имеется пять предполагаемых мест гликозилирования по кислороду, доступных в пределах каждого VNTR-мономера MUC1. В соответствии с нижеприведенной системой нумерации, ими являются Thr-4, Ser-10, Thr-11, Thr-19 и Ser-20.

VNTR можно характеризовать как типичные или полные повторы, имеющие последовательность, показанную ниже, или минорные отклонения от этого полного повтора, содержащие два или три отличия на 20 аминокислот.

Нижеследующее представляет собой последовательность полного повтора:

Подчеркнутые аминокислоты могут быть заменены показанными аминокислотными остатками.

Неполные повторы имеют разные аминокислотные замены в консенсусной последовательности при идентичности 55-90% на уровне аминокислот. Четыре неполных повтора показаны ниже, причем замены подчеркнуты:

Неполные повторы в MUC1 дикого типа фланкируют область полных повторов. В злокачественных карциномах, возникающих при неопластической трансформации этих эпителиальных клеток, несколько изменений влияют на экспрессию MUC1. Поляризованная экспрессия протеина теряется, и его находят распространенным по всей поверхности трансформированной клетки. Суммарное количество MUC1 также увеличено, часто в 10 раз или больше, чем в 10 раз (Strous&Dekker, 1992, Crit Rev Biochem Mol Biol 27:57-92). Самое важное, заметно меняется количество и качество присоединенных по кислороду углеводородных цепей. Гликозилировано меньше остатков серина и треонина. Те углеводородные цепи, которые находят, анормально укорочены, что создает опухолеассоциированный углеводный антиген STn (Lloyd et al., 1996, J Biol Chem, 271:33325-33334). В результате этих изменений гликозилирования различные эпитопы на пептидной цепи MUC1, которые ранее экранировали углеводные цепи, становятся доступными. Один из эпитопов, который становится доступным таким путем, образован последовательностью APDTR (Ala 8 - Arg 12 на Фиг.2), присутствующей в каждом полностью повторяющемся мономере VNTR, состоящем из 20 аминокислот (Burchell et al., 1989, IntJ Cancer 44:691-696).

Очевидно, что эти изменения в MUC1 означают, что вакцина, которая может активировать иммунную систему против этой формы MUC1, экспрессирующейся на опухолях, может быть эффективной против опухолей из эпителиальных клеток и, на самом деле, клеток других типов, у которых найдены MUC1, таких как Т-клеточные лимфоциты. Одним из главных эффекторных механизмов, используемых иммунной системой для уничтожения клеток, экспрессирующих ненормальные белки, является иммунный ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, и этот ответ желателен в вакцине для лечения опухолей так же, как и антительный ответ. Хорошая вакцина должна активировать все стороны иммунного ответа. Однако существующие углеводные и пептидные вакцины, такие как Theratope или BLP25 (Biomira Inc, Эдмонтон, Канада), предпочтительно активируют одну сторону иммунного ответа - гуморальный и клеточный ответ, соответственно, и для генерирования более сбалансированного ответа желателен более хороший дизайн вакцины.

Нуклеиновокислотные вакцины дают множество преимуществ над общепринятой вакцинацией белками в том отношении, что их просто получать в большом количестве. Сообщалось, что даже при малых дозах они индуцируют сильные иммунные ответы и могут индуцировать иммунный ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, а также антительный ответ.

С полноразмерным MUC1, однако, очень трудно работать из-за сильно повторяющейся последовательности, поскольку она сильно подвержена рекомбинации, причем такие случаи рекомбинации причиняют значительные трудности в биофармацевтической разработке. Дополнительно, обогащенность VNTR-области ОС-парами затрудняет секвенирование. Далее по юридическим причинам необходимо полностью охарактеризовать ДНК-конструкт. Весьма проблематично секвенировать молекулу со структурой, имеющей такую высокую частоту повторности. В такой ситуации неизвестно в точности, как много повторяющихся блоков имеется в MUC1 дикого типа, причем эта неспособность точно охарактеризовать полноразмерный MUC1 делает его неприемлемым для юридического одобрения.

Считается, что VNTR-области MUC1 содержат иммунодоминантные эпитопы. К удивлению, данные изобретатели нашли, что можно снизить число VNTR с получением иммуногенного конструкта, который имеет эквивалентную противоопухолевую активность при сравнении с полноразмерным MUC1 дикого типа. Конструкт по настоящему изобретению стабилен. В частности, эти конструкты стабильны в смысле ростовых характеристик, удержания плазмиды и качества плазмиды при выращивании в виде культур E.Coli в течение 9 пересевов, каждый длительностью 10-14 часов.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую антиген MUC1, который способен вызывать иммунный ответ in vivo и является стабильным и имеет сниженную подверженность рекомбинации в сравнении с полноразмерным MUC1. Стабильность представляет собой меру количества плазмиды в определенной форме. Предпочтительным является то, что загрязнение рекомбиногенной формой после крупномасштабного выращивания составляет менее чем 2,0% при определении на агарозном или полиакриламидном геле с визуализацией на глаз. Крупномасштабное в типичных случаях означает выращивание в масштабе больше, чем один литр. Отдельной мерой стабильности является то, что копия плазмиды остается стабильной в течение периода пересевов. Предпочтительно, число копий плазмиды увеличивается с числом пересевов, особенно от пересева 1 до пересева 9. Предпочтительно, число копий плазмиды увеличивается на около 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, наиболее предпочтительно на около 50%, в течение 9 пересевов. В конкретных воплощениях это изобретение предлагает конструкты, имеющие от 1 до 15, предпочтительно между 1 и 10, полных повторов VNTR-блоков. Предпочтительным является то, что имеется менее чем 8 полных повторов. Предпочтительные воплощения предлагают ДНК-конструкты с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью и семью повторами, соответственно. В определенных воплощениях этого изобретения, область неполного повтора сохранена. Предпочтительными являются конструкты, содержащие один или семь полных повторов. Белки, кодируемые такими конструктами, являются новыми и образуют аспект этого изобретения.

В еще одном аспекте этого изобретения нуклеиновокислотная последовательность представляет собой последовательность ДНК в форме плазмиды. Предпочтительно, плазмида является сверхскрученной.

В еще одном аспекте этого изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновокислотную последовательность, какая раскрыта здесь, и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

Предпочтительно, носитель представляет собой гранулу золота, и фармацевтическая композиция поддается доставке путем доставки лекарственного средства посредством частиц.

И в еще одном дополнительном воплощении это изобретение предлагает фармацевтическую композицию и нуклеиновокислотные конструкты для применения в медицине. В частности, предложен нуклеиновокислотный конструкт по этому изобретению в изготовлении медикамента для применения в лечении или профилактике опухолей, экспрессирующих MUC1.

Это изобретение дополнительно предлагает способы лечения пациента, страдающего от или подверженного опухоли, экспрессирующей MUC1, особенно от карциномы груди, легких, яичников, простаты (особенно немелкоклеточной карциномы легких), желудка и других желудочно-кишечных локализаций, введением безопасного и эффективного количества композиции или нуклеиновой кислоты, какая описана здесь.

И в еще одном дополнительном воплощении это изобретение предлагает способ получения фармацевтической композиции, какая описана здесь, смешиванием нуклеиновокислотного конструкта или протеина по этому изобретению с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.

Подробное описание изобретения

Как описано здесь, нуклеиновокислотные конструкты по этому изобретению в типичных случаях имеют меньше чем 15, в более типичных случаях менее чем 10, полных повторов. Молекула MUC1 дикого типа (см. Фиг.1) содержит сигнальную последовательность, лидерную последовательность, неполный или нетипичный VNTR, область полных VNTR, дополнительный нетипичный VNTR, внеклеточный домен, не относящийся к VNTR, трансмембранный домен и цитоплазматический домен.

Предпочтительные воплощения этого изобретения имеют менее чем 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 повторов. Особенно предпочтительные конструкты имеют 1, 2 или 7 полных повторов.

Внеклеточный домен, не относящийся к VNTR, состоит из приблизительно 80 аминокислот с 5'-конца VNTR и 190-200 аминокислот с 3'-конца VNTR. Все конструкты по этому изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп из этой области. Эпитоп в типичных случаях образован последовательностью по меньшей мере семи аминокислот. Соответственно, конструкты по настоящему изобретению включают в себя по меньшей мере один эпитоп внеклеточного домена, не относящегося к VNTR. Предпочтительно, они включают в себя по существу все или, более предпочтительно, все из доменов, не относящихся к VNTR. Особенно предпочтительным является то, что этот конструкт содержит по меньшей мере один эпитоп, содержащийся в последовательности FLSFHISNL, NSSLEDPSTDYYQELQRDISE или NLTISDVSV. Более предпочтительным является то, что в конструкт инкорпорированы две, предпочтительно три, эпитопных последовательности.

В предпочтительном воплощении конструкты содержат N-концевую лидерную последовательность. Сигнальная последовательность, трансмембранный домен и цитоплазматический домен каждый индивидуально являются необязательными в конструкте. Все они могут присутствовать или один или более чем один из них могут быть исключены.

Предпочтительные конструкты в соответствии с этим изобретением представляют собой:

1) 7 VNTR MUC1 (т.е. полный Muс1 только с 7 полными повторами);

2) 7 VNTR MUC1 Δss (такой же, как и 1, но к тому же лишен сигнальной последовательности);

3) 7 VNTR MUC1 ΔТМ ΔCYT (такой же, как и 1, но лишенный трансмембранного и цитоплазматического доменов);

4) 7 VNTR MUC1 Δss ΔТМ ΔCYT (такой же, как и 3, но к тому же лишенный сигнальной последовательности).

Также предпочтительными являются конструкты, эквивалентные вышеописанным от 1 до 4, но содержащие только 2 VNTR или 1 VNTR. VNTR в таких конструктах имеют последовательность полного повтора, какая описана здесь ранее. В одном из воплощений один или более чем один из VNTR-блоков мутированы для снижения потенциала гликозилирования изменением участка гликозилирования. Эта мутация представляет собой предпочтительно замену, но может быть вставкой или делецией. В типичных случаях по меньшей мере один треонин или серин заменен валином, изолейцином, аланином, аспарагином, фенилаланином или триптофаном. В мономере VNTR дикого типа имеется 5 предполагаемых участков гликозилирования по кислороду, доступных в пределах каждого VNTR-мономера MUC1. Ими являются (см. нумерацию) Thr-4, Ser-10, Thr-11, Thr-19 и Ser-20. Таким образом, предпочтительным является то, что по меньшей мере один, предпочтительно 2 или 3 или более чем три, предпочтительно по меньшей мере четыре, остаток заменен аминокислотой, как отмечено выше.

Предпочтительные замены включают в себя:

Thr 4 → Val

Ser 10 → Ala

Thr 11 → lle или Val

Thr 19 → Val

Ser 20 → Ala

В еще одном воплощении конструкты MUC1 снабжены нуклеиновокислотной последовательностью, кодирующей гетерологичный Т-клеточный эпитоп. Такие эпитопы включают в себя Т-клеточные эпитопы из бактериальных белков и токсинов, таких как столбнячный и дифтерийный токсины, например эпитопы Р2 и Р30 из столбнячного токсина. Такие эпитопы могут быть частью более длинной последовательности. Эти эпитопы могут быть инкорпорированными в молекуле нуклеиновой кислоты на 3' - или 5'-конце последовательности в соответствии с этим изобретением.

Можно иметь в виду другие партнеры по слиянию, такие как те, что происходят из корового антигена гепатита В или из туберкулеза. В одном из воплощений партнер по слиянию происходит из Mycobacterium tuberculosis, RA12, подпоследовательности МТВ32А (аминокислоты от 192 до 323) (Skeiky et al., Infection and Immunity (1999) 67:3998-4007).

Другие иммунологические партнеры по слиянию включают в себя, например, протеин D из Haemophilus influenza В (WO 91/18926) или часть (в типичных случаях С-концевую часть) LYTA из Streptococcus pneumoniae (Biotechnology 10:795-798, 1992).

В соответствии с еще одним аспектом этого изобретения предложен экспрессионный вектор, который содержит полинуклеотидную последовательность в соответствии с этим изобретением и способен направлять ее экспрессию. Этот вектор может быть подходящим для управления экспрессией гетерологичной ДНК в клетках бактерии, насекомого или млекопитающего, конкретно в клетках человека.

В соответствии с еще одним аспектом этого изобретения предложена хозяйская клетка, содержащая полинуклеотидную последовательность в соответствии с этим изобретением или экспрессионный вектор в соответствии с этим изобретением. Эти хозяйские клетки могут быть бактериальными, например E.coli, клетками млекопитающего, например человека, или могут быть клетками насекомого. Клетки млекопитающего, содержащие вектор в соответствии с настоящим изобретением, могут быть клетками к культуре, трансфицированными in vitro или могут быть трансфицированными in vivo введением вектора млекопитающему.

Настоящее изобретение дополнительно предлагает фармацевтическую композицию, содержащую полинуклеотидную последовательность в соответствии с этим изобретением. Предпочтительно, эта композиция содержит ДНК-вектор. В предпочтительном воплощении эта композиция содержит совокупность частиц, предпочтительно частиц золота, покрытых ДНК, содержащей вектор, кодирующий полинуклеотидную последовательность по этому изобретению, причем эта последовательность кодирует аминокислотную последовательность MUC1, какая описана здесь. В альтернативных воплощениях композиция содержит фармацевтически приемлемый эксципиент и ДНК-вектор в соответствии с настоящим изобретением.

Композиция может также включать в себя адъювант или быть вводимой либо одновременно, либо последовательно с адъювантом или иммуностимулирующим агентом.

Таким образом, в этом воплощении этого изобретения векторы по этому изобретению должны быть использованы с иммуностимулирующим агентом. Предпочтительно, этот иммуностимулирующий агент вводят в то же время, что и нуклеиновокислотный вектор по этому изобретению, и в предпочтительных воплощениях их вводят в состав препарата вместе. Такие иммуностимулирующие агенты включают в себя (но этот список ни коим образом не является исчерпывающим и не исключает другие агенты): синтетические имидазохинолины, такие как имиквимод [S-26308, R-837], (Harrison, et al. Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with glycoprotein vaccine', Vaccine 19:1820-1826, (2001)); и резиквимод [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al. «Adjuvant activites of immune response modifier» R-84 8: Comparison with CpG ODN⁵, Cellular Immunology 204:64-74 (2000)), шиффовы основания карбонилов и аминов, которые конститутивно экспрессированы на поверхностях антиген-представляющих клеток и Т-клеток, такие как тукаресол (Rhodes, J. et al. «Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs». Nature 377:71-75 (1995)), цитокиновые, хемокиновые и костимулирующие молекулы как протеиновые, так и пептидные, что должно включать в себя провоспалительные цитокины, такие как интерфероны, в частности интерфероны и GM-CSF, IL-1a, IL-1p, TGFα и TGFβ, ТМ-индукторы, такие как интерферон-у, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21, Тh2-индукторы, такие как IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13, и другие гены хемокинов и костимуляторов, таких как МСР-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, ТСА-3, CD80, CD86 и CD40L, другие иммуностимулирующие нацеливающие лиганды, такие как CTLA-4 и L-селектин, белки и пептиды, стимулирующие апопотоз, такие как Fas, (49), адъюванты на основе синтетических липидов, такие как ваксфектин (Reyes et al., «Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization». Vaccine 19; 3778-3786), сквален, α-токоферол, полисорбат 80, DOPC и холестерин, эндотоксин [LPS], Beutler, В., Endotoxin, Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity'. Current Opinion in Microbiology 3:23-30 (2000)); олиго- и динуклеотиды CpG, Sato, Y. et al., «Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization». Science 273 (5273):352-354 (1996). Hemmi, H. et al., «A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA», Nature 408:740-745, (2000) и другие потенциальные лиганды, которые включают Toll-рецепторы для продукции Th1-индуцирующих цитокинов, такие как синтетические микобактериальные липопротеины, микобактериальный протеин р19, пептидогликан, тейхоевая кислота и липид А. Другие бактериальные иммуностимулирующие белки включают в себя холерный токсин, токсин E.Coli и их мутантные токсоиды.

Конкретные предпочтительные адъюванты для того, чтобы вызывать преимущественно ответ Th1-типа, включают в себя, например, производное Липида А, такое как монофосфорил липида А, или, предпочтительно, 3-дез-O-ацилированный монофосфорил липида А. Адъюванты MPL® доступны от Corixa Corporation (Seattle, WA; см., например, Патенты США №№ 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). CpG-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG не метилирован) также индуцируют преимущественно Тh1-ответ. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и раскрыты, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и Патентах США №№ 6008200 и 5856462. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описаны, например, в Sato et al., Science 275:352, 1996. Другой предпочтительный адъювант содержит сапонин, такой как Quil А или его производные, в том числе QS21 и QS7 (Aquila BioPharmaceuticals Inc., Framingharn, MA); Эсцин, Дигитонин; или сапонины Gypsophila или Chenopodium quinoa.

Также предложено применение полинуклеотида или протеина в соответствии с этим изобретением или вектора в соответствии с этим изобретением в лечении или профилактике опухоли или метастазов, экспрессирующих MUC1.

Настоящее изобретение также предлагает способы лечения или предотвращения опухолей, экспрессирующих MUC1, любых симптомов или заболеваний, ассоциированных с ними, в том числе метастазов, причем при этих способах вводят эффективное количество полинуклеотида, вектора или фармацевтической композиции в соответствии с этим изобретением. Введение фармацевтической композиции может приобретать форму одной или более чем одной из индивидуальных доз, например в режиме терапевтической вакцинации «первичная вакцинация - поддерживающая вакцинация». В определенных случаях «первичная вакцинация» может быть осуществлена опосредованной частицами для доставки ДНК доставкой полинуклеотида в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно инкорпорированного в производимый из плазмиды вектор, а «поддерживающая вакцинация» может быть осуществлена введением рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ту же полинуклеотидную последовательность, или осуществлением поддерживающей вакцинации протеином в адъюванте. Или же первичная вакцинация может быть осуществлена вирусным вектором или протеиновым препаратом, в типичных случаях протеиновый препарат выполнен с адъювантом, а поддерживающая - ДНК-вакциной по настоящему изобретению.

Как обсуждено выше, настоящее изобретение включает в себя экспрессионные векторы, которые содержат нуклеотидные последовательности по этому изобретению. В области молекулярной биологии такие экспрессионные векторы конструируют рутинным образом, и это может, например, включать в себя применение плазмидной ДНК и надлежащих инициаторов, промоторов, энхансеров и других элементов, таких как, например, сигналы полиаденилирования, которые могут быть необходимыми и которые позиционируют в правильной ориентации, чтобы сделать возможной экспрессию протеина. Другие подходящие векторы должны быть очевидными специалистам. За дополнительными примерами в связи с этим мы отсылаем к Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd Edition. CSH Laboratory Press, (1989).

Предпочтительно, полинуклеотид по этому изобретению или для применения в этом изобретении в векторе является работоспособным образом связанным с контрольной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию кодирующей последовательности хозяйской клеткой, то есть вектор представляет собой экспрессионный вектор. Термин «работоспособным образом связанный» относится к юкстапозиции, в которой описанные компоненты находятся во взаимоотношении, позволяющем им функционировать предназначенным образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, «работоспособным образом связанный» с кодирующей последовательностью, позиционирована таким образом, что этим достигают экспрессию кодирующей последовательности в условиях, совместимых с регуляторной последовательностью.

Векторами могут быть, например, плазмиды, искусственные хромосомы (например, ВАС, РАС, YAC), вирусные или фаговые векторы, снабженные нулевыми точками репликации, возможно промотором для экспрессии полинуклеотида и возможно регулятором промотора. Векторы могут содержать один или более чем один из селектируемых маркерных генов, например ген устойчивости к ампициллину или канамицину в случае бактериальной плазмиды или ген устойчивости для грибкового вектора. Векторы можно применять in vitro, например для продукции ДНК или РНК или применять для трансфекции или трансформации хозяйской клетки, например, хозяйской клетки млекопитающего, например, для продукции протеина, кодируемого вектором. Векторы можно также адаптировать для применения in vivo, например, в способе ДНК-вакцинации или генной терапии.

Промоторы и другие сигналы регуляции экспрессии можно выбирать так, чтобы они были совместимы с хозяйской клеткой, для которой предназначена экспрессия. Например, промоторы млекопитающих включают в себя промотор металлотионеина, который можно индуцировать в ответ на тяжелые металлы, такие как кадмий, и промотор β-актина. Также можно использовать вирусные промоторы, такие как промотор большого Т-антигена SV40, немедленный ранний (immediate early, IE) промотор цитомегаловируса (CMV) человека, промотор длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса, промотор аденовируса или промотор вируса папилломы человека (HPV), особенно вышележащую регуляторную область HPV (URR). Все эти промоторы хорошо описаны и легко доступны в данной области техники.

Предпочтительным промоторным элементом является немедленный ранний промотор CMV, лишенный интрона А, но включающий в себя экзон 1. Соответственно, предложен вектор, содержащий полинуклеотид по этому изобретению под контролем IE-промотора HCMV.

Примеры подходящих вирусных векторов включают в себя вирусные векторы, представляющие собой вирус простого герпеса, вирус осповакцины, альфа-вирусные векторы и ретровирусы, в том числе лентивирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы. Методики переноса генов при использовании этих вирусов известны специалистам. Ретровирусные векторы, например, можно использовать для стабильной интеграции полинуклеотида по этому изобретению в хозяйский геном, хотя такая гекомбинация не является предпочтительной. Дефективные по репликации аденовирусные векторы, напротив, остаются эписомальными и поэтому делают возможной преходящую экспрессию. Векторы, способные управлять экспрессией в клетках насекомого (например, бакуловирсные векторы), в клетках человека или в бактериях, можно использовать для получения некоторых количеств протеина ВИЧ, кодируемого полинуклеотидами по настоящему изобретению, например, для применения в качестве субъединичных вакцин или в иммунных анализах. Полинуклеотиды по этому изобретению имеют особое применение в вирусных вакцинах, поскольку прежние попытки генерировать полноразмерные конструкты вируса осповакцины были безуспешными.

Полинуклеотиды в соответствии с этим изобретением имеют применение в продукции кодируемых белков экспрессией, которая может иметь место in vitro, in vivo или ex vivo. Поэтому эти нуклеотиды можно вовлекать в синтез рекомбинантных протеинов, например, для увеличения выхода или они в сущности могут найти применение в качестве терапевтических агентов в своем роде, используемых в методиках ДНК-вакцинации. В случаях, когда полинуклеотиды по настоящему изобретению используют в получении кодируемых белков in vitro или ex vivo, клетки, например клетки в культуре, надо модифицировать включением в них полинуклеотида, подлежащего экспрессированию. Такие клетки включают в себя нестабильные или предпочтительно стабильные линии клеток млекопитающего. Конкретные примеры клеток, которые можно модифицировать вставкой векторов, кодирующих полипептид в соответствии с этим изобретением, включают в себя клетки млекопитающего НЕК293Т, СНО, HeLa, 293 и COS. Предпочтительно, выбранная клеточная линия должна быть такой, которая является не только стабильной, но также позволяющей полноценное гликозилирование полипептида и его экспрессию на клеточной поверхности. Экспрессию можно достигать в трансформированных ооцитах. Полипептид можно экспрессировать с полинуклеотида по настоящему изобретению в клетках трансгенного животного, которое не является человеком, предпочтительно мыши. Трансгенное животное, которое не является человеком, экспрессирующее полипептид с полинуклеотида по этому изобретению, включено в объем этого изобретения.

Это изобретение предлагает еще и способ вакцинации млекопитающего субъекта, причем ему вводят эффективное количество такой вакцины или вакцинной композиции. Наиболее предпочтительно то, что экспрессионные векторы для применения в ДНК-вакцинах, вакцинных композициях и иммунотерапевтических средствах должны быть плазмидными векторами.

ДНК-вакцины можно вводить в форме «голой ДНК», например, в жидком препарате, вводимом при использовании шприца или струи высокого давления, или в форме ДНК, введенной в состав липосом или раздражающего агента для улучшения трансфекции, или доставкой ДНК с помощью частиц (particle mediated DNA delivery, PMDD). Все эти системы доставки хорошо известны в данной области. Вектор можно внедрить млекопитающему, например, системой доставки, представляющей собой вирусный вектор.

Композиции по настоящему изобретению можно доставлять множеством путей, таких как внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный или внутривенный.

В предпочтительном воплощении композицию доставляют в кожу. В частности, композицию доставляют методиками введения генным пистолетом (особенно бомбардировкой частицами), при которых наносят вектор на гранулу (например, золотую), которую затем вводят под высоким давлением в эпидермис, например, так, как описано в Haynes et al., J Biotechnology 44:37-42 (1996).

В одном иллюстративном примере ускорение частиц под действием газа можно достигать устройствами, такими как те, что производит Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) и Powderject Vaccines Inc. (Madison, W1), некоторые примеры которых описаны в Патентах США №№ 5846796, 6010478, 5865796, 5584807 и в Европейском Патенте №0500799. Этот подход делает возможной доставку без использования игл, причем препарат микроскопических частиц, таких как полинуклеотидные, представляющий собой сухой порошок, ускоряют до высокой скорости в струе газа гелия, которую генерируют устройством, которое держат в руке, внедряющим эти частицы в целевую ткань, представляющую интерес, в типичных случаях в кожу. Эти частицы представляют собой предпочтительно гранулы золота с диаметром 0,4-4,0 мкм, более предпочтительно 0,6-2,0 мкм, с нанесенным на них конъюгатом ДНК, которые заключают в картридж или кассету для помещения в «генный пистолет».

В родственном воплощении другие устройства и способы, которые могут быть полезными для инъекции композиции по настоящему изобретению под действием газа и без иглы, включают в себя те, которыми снабжает Bioject, Inc. (Portland, OR), некоторые примеры которых описаны в Патентах США №№ 4790824, 5064413, 5312335, 5383851, 5399163, 5520639 и 5993412.

Векторы, которые содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антигенные пептиды, вводят в таком количестве, которое должно быть профилактически или терапевтически эффективным. Количество нуклеотида на дозу для введения находится, в общем, в диапазоне от одного пикограмма до 1 миллиграмма, предпочтительно от 1 пикограмма до 10 микрограмм для доставки посредством частиц и от 10 микрограмм до 1 миллиграмма для других путей. Точное количество может значительно варьировать в зависимости от массы пациента, которого иммунизируют, и от пути введения.

Можно вводить иммуногенный компонент, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный пептид, однократно или многократно, например от 1 до 7 раз, предпочтительно от 1 и 4 раз, при интервалах между около 1 дня и около 18 месяцев. Однако опять же этот режим лечения должен значительно варьировать в зависимости от размера пациента, заболевания, от которого лечат/защищают, количества вводимой нуклеотидной последовательности пути введения и других факторов, которые должны быть очевидными опытному практикующему медику. Пациент может получать один или более чем один из других противораковых лекарственных средств в качестве части их общего режима лечения.

Подходящие методики для введения голого полинуклеотида или вектора в пациента также включают в себя местное нанесение с надлежащим носителем. Нуклеиновую кислоту можно вводить местным образом на кожу или на слизистые поверхности, например введением в нос, пероральным путем, в вагину или в прямую кишку. Голый полинуклеотид или вектор можно давать вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как забуференный фосфатами физраствор (phosphate buffered saline, PBS). Поглощению ДНК можно дополнительно способствовать способствующими агентами, такими как бупивакаин, либо в отдельности, либо при включении в препарат ДНК. Другие способы введения нуклеиновой кислоты прямо реципиенту включают в себя ультразвук, электрическую стимуляцию, электропорацию и микропосев, который описан в Патенте США 5697901.

Поглощению конструктов нуклеиновой кислоты можно способствовать несколькими известными методиками трансфекции, например теми, которые включают в себя применение агентов трансфекции. Примеры этих агентов включает в себя катионные агенты, например фосфат кальция и ДЭАЭ-декстран, и липофектанты, например липофектам и трансфектам. Дозировку нуклеиновой кислоты для введения можно изменять.

Нуклеиновокислотную последовательность по настоящему изобретению можно также вводить трансформированными клетками. Такие клетки включают в себя клетки, полученные из субъекта. Голый полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению можно интродуцировать в такие клетки in vitro, и эти трансформированные клетки можно позже возвращать субъекту. Полинуклеотид по этому изобретению можно интегрировать в нуклеиновую кислоту, уже присутствующую в клетке, в результате событий, представляющих собой гомологичную рекомбинацию. Трансформированные клетки можно, если это желательно, выращивать in vitro, и одну или более чем одну из получившихся клеток можно использовать в данном изобретении. Клетки можно доставлять в надлежащее место в пациенте известными хирургическими или микрохирургическими методиками (например, трансплантацией, микроинъекцией и т.д.).

Примеры

1.1 Генерирование конструктов

Схему соотношений между всеми конструктами, детализированными ниже, можно найти на Фиг.1.

1.2 Конструирование кассеты экспрессии полноразмерного MUC1

Начальной точкой для конструирования кассеты экспрессии MUC1 была плазмида pcDNA3-FL-MUC1 (ICRF, Лондон). Эта плазмида имеет скелет pcDNA3 (Invitrogen), содержащий кДНК-вую кассету полноразмерного MUC1 (FL-MUC1), клонированную в BamHI-сайте. На основании рестрикционного картирования, выполненного в ICRF, ген MUC1 имеет приблизительно 32 блока VNTR (варьирующее число тандемных повторов). Присутствие MUC1 подтвердили флуоресцентным секвенированием при использовании праймеров 2004MUC1-2014MUC1 (Приложение А). Последовательность MUC1, на которой основана последовательность FL-MUC1, показана на Фиг.2. На первой стадии этого способа клонирования BamHI-фрагмент, содержащий кДНК-вую последовательность полноразмерного MUC1, изолировали и клонировали в BamHI-сайт экспрессионного вектора pcDNA3.1(+)/Hygro (Invitrogen), генерируя плазмиду JNW278. Корректную ориентацию фрагмента относительно промотора CMV подтвердили методом ПЦР и флуоресцентным секвенированием.

На следующей стадии клонирования удаляли 3'-нетранслируемую область (UTRs) и заменяли улучшенными сайтами для рестрикционных ферментов для облегчения будущих процедур клонирования. Фрагмент MUC1 амплифицировали в ПЦР с праймерами 2062MUC1 и 2063MUC1 (Приложение А) при использовании JNW278 в качестве матрицы и подвергали рестрикции при использовании BstXI и Xhol. Параллельно плазмиду JNW278 подвергали рестрикции при использовании BstXI и Xhol. Очищенный векторный скелет лигировали с ПЦР-фрагментом, генерируя плазмиду JNW314. Рестрикционный анализ и флуоресцентное секвенирование подтвердили присутствие корректного фрагмента.

Параллельно удаляли 5'-UTR и заменяли оптимальной Kozak-последовательностью и улучшенными сайтами для рестрикционных ферментов. JNW278 подвергали действию рестриктаз Nhel и Xhol, удаляя целиком последовательность кДНК MUC1. Фрагмент MUC1 амплифицировали в ПЦР с ПЦР-праймерами 2060MUC1 и 2061 MUC1 (Приложение А), подвергали рестрикции рестриктазами Nhel и Xhol и лигировали в скелет вектора, генерируя плазмиду JNW294.

На следующей стадии клонирования подвергали JNW294 действию рестриктазы BsaMI, высвобождая два фрагмента (приблизительно 2,3 тысяч пар оснований и 3,2 тысяч пар оснований). Больший из этих двух фрагментов (Фрагмент А) изолировали и очищали. Параллельно подвергали JNW314 действию рестриктазы BsaMI и больший из двух фрагментов (Фрагмент В, размером приблизительно 7 тысяч пар оснований), изолировали и очищали. Фрагменты А и В лигировали вместе, генерируя плазмиду JNW340. Корректную ориентацию подтвердили рестрикционным картированием при использовании Nhe-Xhol и, отдельно, Xbal.

На конечной стадии клонирования экспрессионную кассету изолировали из JNW340 расщеплением рестриктазами Nhel и Xhol, высвобождая фрагмент приблизительно в 4 тысячи пар оснований. Экспрессионную плазмиду pVAC1 (Thomson Immunology 95: 510Р106, 1998) подвергали действию рестриктаз Nhel и Xhol и лигировали с кассетой MUC1, генерируя плазмиду JNW358 для экспрессии полноразмерного MUC1. Корректную ориентацию последовательности MUC1 относительно промотора CMV подтвердили рестрикционным расщеплением и флуоресцентным секвенированием. Последовательность кассеты экспрессии MUC1 показана на Фиг.3.

1.3 Конструирование вектора MUC1, содержащего один VNTR-блок

Начальной точкой для конструирования кассеты для экспрессии MUC1, содержащего один VNTR-блок, является JNW278. Уникальным свойством последовательности ДНК с высоким числом VNTR-повторов является присутствие сайта для рестриктазы Fsel в каждом из повт