Способ идентификации эпитопов т-клеток и его применение для получения молекул со сниженной иммуногенностью

Способ идентификации эпитопов т-клеток и его применение для получения молекул со сниженной иммуногенностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Данное изобретение относится к новому подходу в идентификации эпитопов Т-клеток, которые вызывают иммунную реакцию в живом организме-хозяине, который включает расчет значений потенциальных эпитопов Т-клеток для связывающих сайтов молекул MHC класса II в пептиде, посредством автоматизированных методов. Кроме того, изобретение относится к способам получения биологических молекул, прежде всего белков и антител, которые вызывают иммунный ответ при введении в организм-хозяин, предпочтительно человека. С помощью этого способа могут быть получены молекулы, которые неиммунногенны или имеют сниженную иммунногенность, когда подвергаются иммунной системе определенного вида, и в сравнении с соответствующим немодифицированным объектом путем уменьшения или удаления потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах последовательности указанных изначально иммуногенных молекул. Таким образом, изобретение относится также к новым биологическим молекулам, которые получены способом согласно изобретению.

Предпосылки изобретения

Терапевтическое применение некоторых пептидов, полипептидов и белков ограничено из-за их иммуногенности у млекопитающих, особенно у людей. Например, при применении мышиных антител к пациентам, которые не имеют иммунодепресантов, большинство таких пациентов проявляют иммунные реакции на введенный инородный объект путем вырабатывания антимышиных антител (НАМА) человека (например, Schroff R.W. и др. (1985), Cancer Res. 45: 879-885; Shawler D.L. и др. (1985) J.Immunol. 135: 1530-1535). Существует два серьезных последствия. Во-первых, антимышиное антитело пациента может связать и уничтожить терапевтическое антитело или иммуноконъюгат до того, как у него появиться возможность связать, например, опухоль и проявить свою терапевтическую функцию. Во-вторых, у пациента может развиться аллергическая чувствительность к мышиному антителу и появиться риск анафилактического шока при любом введении мышиного иммуноглобулина в будущем.

Несколько способов было использовано для решения НАМА проблемы и, таким образом, создана возможность использования на людях терапевтических моноклональных антител (см., например, WO-A-8909622; ЕР-А-0239400; ЕР-А-0438310; WO-A-9106667). Эти подходы на основе рекомбинантной ДНК обычно ослабляют мышиную генетическую информацию в конечной конструкции антитела, усиливая тем самым генетическую информацию человека в полученной конструкции. Тем не менее, полученные "гуманизированные" антитела все же вызывают в ряде случаев иммунный ответ у пациентов (Issacs J.D. (1990) Sem.Jmmunol. 2:449, 456; Rebello, P.R. и др. (1999) Transplantation 68:1417-1420).

Общим аспектом в этих методологиях является введение в терапевтическое антитело, обычно по происхождению от грызунов, остатков аминокислот, даже значительных трактов последовательностей аминокислотных остатков, идентичных тем, которые присутствуют в белках антител человека. Для антител такой способ возможен благодаря относительно высокой степени структурного (и функционального) консерватизма среди молекул антител различных видов. Однако для потенциально терапевтических пептидов, полипептидов и белков, где не может существовать структурной гомологии в хозяйских видах (например, человека) для терапевтического белка, такие способы неприменимы. Кроме того, эти способы предполагают, что основное введение последовательности аминокислотного остатка человека будет делать ремоделированное антитело неиммуногенным. Известно, что определенные короткие пептидные последовательности ("эпитопы Т-клеток") могут высвобождаться во время разрушения пептидов, полипептидов или белков внутри клеток и, следовательно, принимать участие в презентации молекулами основного комплекса гистосовместимости (МНС) для того, чтобы инициировать активацию Т-клеток. Для пептидов, представленных МНС класса II, такая активация Т-клеток может затем вызывать, например, ответ антител путем прямой стимуляции В-клеток для получения таких антител. Соответственно было бы желательно устранить потенциальные эпитопы Т-клеток из пептида, полипептида или белка. Даже белки человеческого происхождения и те, которые имеют существующие у человека аминокислотные последовательности, могут индуцировать иммунный ответ у человека. Показательные примеры включают терапевтическое использование колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (Wadhwa М. и др. (1999) Clin. Cancer. Res. 5:1353-1361) и интерферон альфа 2 (Russo D. и др. (1996) Bri. J. Haem. 94:300-305; Stein R. и др. (1998) New Engl. J.Med. 318:1409-1413).

Устранение эпитопов Т-клеток из белка было раскрыто ранее (см., например, WO 98/52976, WO 00/34317). Основные способы, раскрытые в предыдущем уровне техники, включают следующие стадии:

(a) Определение аминокислотной последовательности полипептида или его части.

(b) Идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности белка любым способом, включающим определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов.

(c) Конструирование новых вариантов последовательности с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных таким образом для существенного уменьшения или устранения активности эпитопов Т-клеток, как определено путем связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами. Такие варианты последовательностей разрабатывают таким способом, чтобы избежать образования новых потенциальных эпитопов Т-клеток, путем изменения последовательностей до тех пор, пока такие новые потенциальные эпитопы Т-клеток, в свою очередь, не модифицируют таким способом для существенного снижения или устранения активности эпитопов Т-клеток.

(d) конструирование таких вариантов последовательности с помощью техники рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами.

Другие способы, использующие растворимые комплексы рекомбинантных молекул МНС в комбинации с синтетическими пептидами, которые способны к связыванию с клонами Т-клеток образцов периферической крови человека или экспериментальных животных, применяются в области техники (Kern F. и др. (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W.W. и др. (2001) TRENDS in Immunology 22: 583-588) и могут использоваться в стратегии идентификации эпитопа.

Потенциальные эпитопы Т-клеток обычно определяют как любую последовательность аминокислотных остатков, которая обладает способностью связываться с молекулами МНС класса II. Такие эпитопы Т-клеток можно измерять для установления МНС-связывания. Конечно, "эпитоп Т-клеток" означает эпитоп, который при связывании с молекулами МНС может узнаваться рецептором Т-клеток и который может, по крайней мере, в принципе вызывать активацию этих Т-клеток. Это, однако, обычно понимается как то, что определенные пептиды, которые являются такими, что связываются с молекулами МНС класса II, могут удерживаться в белковой последовательности, поскольку такие пептиды узнаются как "собственные" для организма, в который вводится конечный белок.

Целью настоящего изобретения было побороть практическую реальность, что растворимые белки, введенные в аутологический организм-хозяин с терапевтической целью, могут инициировать иммунный ответ, приводящий к развитию хозяйских антител, которые связывают растворимый белок. Одним среди других примеров является интерферон альфа 2, к которому часть пациентов вырабатывает антитела несмотря на то что этот белок вырабатывается эндогенно [Russo D. и др. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein R. и др. (1998) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413].

Молекулы МНС класса II представляют собой группу высокополиморфных белков, которые играют центральную роль в отборе хелперных Т-клеток и активации. Человеческая лейкоцитарная антигенная группа DR (HLA-DR) представляет собой преобладающий изотип этой группы белков и является базисной точкой данного изобретения. Однако изотипы HLA-DQ и HLA-DP выполняют сходные функции, таким образом, данное изобретение равно применимо к этим двум изотипам. Молекулы МНС класса II DR понимаются как гомодимеры, в которых каждая "половина" является гетеродимером, состоящим из α и β цепей. Каждый гетеродимер обладает лиганд-связывающим доменом, который связывается с пептидами и имеет длину, варьирующую от 9 до 20 аминокислот, несмотря на то что связывающий желобок может включать максимум 9-11 аминокислот. Лиганд-связывающий домен включает аминокислоты с 1 по 85 α цепи, и аминокислоты с 1 по 94 β цепи. DQ-молекулы, как было показано недавно, имеют гомологичную структуру и DP семейство белков, как ожидается, также является очень подобным. У человека известно около 70 различных аллотипов DR изотипа, для DQ известно 30 различных аллотипов, а для DP - 47 различных аллотипов. Каждая особь несет от двух до четырех аллелей DR, два аллеля DQ и два DP аллеля. Структура ряда DR молекул изучена, и эти структуры указывают на связывающий желобок пептида с открытой концевой структурой с рядом гидрофобных карманов, которые вовлекают гидрофобные остатки (остатки кармана) пептида (Brown и др. Nature (1993) 364: 33, Stern и др. (1994) Nature 368: 215). Полиморфизм, идентифицирующий различные аллотипы класса II молекул, вносит свой вклад в широкое разнообразие различных связывающих поверхностей для пептидов в пределах связывающего желобка пептида и на популяционном уровне обеспечивает максимальную гибкость в отношении способности узнавать чужеродные белки и вызывать иммунный ответ к патогенным организмам.

Существует значительный полиморфизм в пределах лиганд-связывающего домена с четкими "семействами" в пределах различных географических популяций и этнических групп. Этот полиморфизм влияет на характеристики связывания пептид-связывающего домена, и таким образом, различные "семейства" DR молекул будут иметь специфичность для пептидов с различными свойствами последовательности, несмотря на то что они могут в некоторой степени перекрываться. Эта специфичность определяет узнавание Th-клеточных эпитопов (класс II Т-клеточного ответа), которые в конечном счете ответственны за стимулирование выработки антител к В-клеточным эпитопам, которые присутствуют в том же белке, из которого происходит Th-клеточный эпитоп. Таким образом, иммунный ответ на белок в индивидуальном человеческом организме в значительной степени находится под влиянием узнавания Т-клеточного эпитопа, что является функцией пептид-связывающей специфичности такого индивидуального HLA-DR аллотипа. Таким образом, для того чтобы идентифицировать Т-клеточные эпитопы в пределах белка или пептида в контексте глобальной популяции, желательно рассматривать связывающие свойства такого широкого набора HLA-DR аллотипов, насколько это возможно, покрывая таким образом настолько высокий процент мировой популяции, насколько это возможно.

Иммунный ответ на терапевтический белок, такой, как белок в соответствии с изобретением, проходит via путь презентации пептида МНС класса II. Таким образом, для того, чтобы устранить или снизить иммуногенность, желательно идентифицировать и удалять эпитопы Т-клеток из белка.

Немодифицированные биологические молекулы могут быть получены рекомбинантным методом, который per se является хорошо известным в уровне техники, используя некоторое количество различных типов хозяйских клеток.

Однако существует потребность в аналогах указанных биологических молекул с улучшенными свойствами. Желательные усовершенствования включают альтернативные схемы и модальности для экспрессии и очистки указанного терапевтического средства, а также в особенности улучшения биологических свойств белка. Существует особая потребность в улучшении in vivo характеристик при назначении человеку. В этой связи особенно желательно обеспечить выбранные биологические молекулы уменьшенным или отсутствующим потенциалом индукции иммунного ответа в человеческом организме. Ожидается, что такие белки будут показывать повышенное время циркуляции в организме человека и будут особенно полезны в лечении хронических или повторяющихся проявлений болезни, таких как в случае некоторых показаний для указанной биологической молекулы.

Краткое изложение и описание изобретения.

Настоящее изобретение поэтому касается двух основных аспектов, таких как:

(a) удобный и эффективный вычислительный метод для идентификации и расчета эпитопов Т-клеток для универсально различных количеств молекул МНС класса II и, основываясь на этих знаниях, для разработки и конструирования новых вариантов последовательностей биологических молекул с улучшенными свойствами, и

(b) новые биологически активные молекулы для применения особенно к людям и, в частности, для терапевтического применения; указанные биологические молекулы являются согласно данному изобретению иммуногенно модифицированными полипептидами, белками и иммуноглобулинами (антителами), полученными согласно способу данного изобретения, в соответствии с чем модификация приводит к уменьшенной склонности биологической молекулы вызывать иммунный ответ при введении человеку.

В частности, изобретение относится к модификации нескольких в основном известных белков и антител с высоким терапевтическим преимуществом человеческого или нечеловеческого происхождения, полученных методом согласно данному изобретению, что приводит к получению белков, которые являются существенно неиммуногенными или менее иммуногенными, чем любой их немодифицированный эквивалент при использовании in vivo. Ожидается, что молекулы, модифицированные согласно новому методу настоящего изобретения, будут показывать повышенное время циркуляции в организме человека и будут особенно полезны в лечении хронических или повторяющихся проявлений болезни, таких как в случае некоторых показаний. Настоящее изобретение обеспечивает как специфическое воплощение и для демонстрации эффективности метода согласно изобретению, модифицированные формы указанных молекул, которые, как ожидается, покажут улучшенные свойства in vivo. Эти молекулы с модифицированной иммуногенностью, то есть со сниженным иммуногенным потенциалом могут использоваться в фармацевтических композициях. Такие модифицированные молекулы в этом описании названы "иммуногенно" модифицированными.

Способ идентификации эпитопов Т-клеток частично посредством вычислительных средств может использоваться для вычисления теоретических значений эпитопов Т-клеток и, таким образом, идентификации потенциальных связывающих пептидов молекулы МНС класса II в пределах белка; где связывающий сайт включает последовательность аминокислотных сайтов в пределах белка. Идентифицированные пептиды после того могут быть модифицированы без существенного снижения и, возможно, увеличения, терапевтическая ценности белка. Этот вычислительный метод включает выбор области белка, имеющей известную последовательность аминокислотного остатка, последовательно пробуя перекрывающиеся сегменты аминокислотных остатков (окон) предварительно определенной постоянной длины и состоящие из, по крайней мере, трех аминокислотных остатков из выбранной области, вычисляя показатель связывания молекулы МНС класса II для каждого выбранного сегмента и идентифицируя, по крайней мере, один из выбранных сегментов, подходящих для модификации, что основано на рассчитанном показателе связывания молекулы МНС класса II для этого сегмента. Полный показатель связывания молекулы МНС класса II для пептида затем может быть изменен, существенно не уменьшая терапевтическую ценность белка.

Показатель связывания молекулы МНС класса II для выбранного сегмента аминокислотного остатка в одном аспекте данного изобретения рассчитывают, суммируя определенные значения для каждого гидрофобного аминокислотного остатка боковой цепи, присутствующего в выбранном сегменте аминокислотного остатка пептида. Чтобы произвести графический обзор, значение этой суммы затем может быть приписано отдельному аминокислотному остатку в приблизительно средней точке сегмента. Эту процедуру повторяют для каждого из перекрывающихся сегментов (окон) в интересующей области или областях пептида. Определенное значение для каждой присутствующей ароматической боковой цепи равняется приблизительно половине определенного значения для каждого гидрофобного аминокислотного остатка боковой цепи. Гидрофобными аминокислотными остатками боковой цепи являются те, которые присутствуют в валине, лейцине, изолейцине и метионине. Ароматическими боковыми цепями являются те, которые присутствуют в фенилаланине, тирозине и триптофане. Предпочтительное определенное значение для ароматической боковой цепи равно приблизительно 1 и для гидрофобного аминокислотного остатка боковой цепи равно приблизительно 2. Однако могут использоваться другие значения.

Таким образом, в первом аспекте изобретение обеспечивает вычислительный способ, подходящий для идентификации одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток пептидов в пределах последовательности аминокислоты биологической молекулы стадиями, включающими определение связывания указанных пептидов с МНС молекулами, используя in vitro или in silico способы или биологические анализы, указанный способ включает следующие стадии:

(а) выбор участка пептида, который имеет известную последовательность аминокислотных остатков;

(b) последовательный отбор перекрывающихся сегментов аминокислотных остатков с предварительно определенным одинаковым размером и состоящих, по крайней мере, из трех аминокислотных остатков выбранного участка;

(c) подсчет показателя связывания молекулы МНС класса II для каждого указанного выбранного сегмента путем суммирования определенных значений для каждого гидрофобного аминокислотного остатка боковой цепи, который присутствует в каждом выбранном сегменте аминокислотного остатка; и

(d) идентификация, по крайней мере, одного из указанных сегментов, подходящих для модификации, основываясь на подсчитанном показателе связывания молекулы МНС класса II этого сегмента, для изменения общего показателя связывания МНС класса II для пептида без существенного уменьшения терапевтической полезности пептида.

В специфическом воплощении изобретение касается способа, в котором стадию (с) выполняют при использовании функции подсчета Вöhm, модифицированной для включения 12-6 составляющей отталкивания энергии комплекса лиганд-белок Ван дер Ваальса и составляющей конформационной энергии лиганда путем:

(1) обеспечения первой базы данных моделей молекулы МНС класса II;

(2) обеспечения второй базы данных возможного пептидного скелета для указанных моделей молекул МНС класса II;

(3) отбора модели из указанной первой базы данных;

(4) отбора возможного пептидного скелета из второй базы данных;

(5) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выбранном сегменте;

(6) определения значения связывающего сродства ко всем боковым цепям, которые присутствуют в каждом выбранном сегменте; и необязательно

(7) повторения стадий от (1) до (5) для каждой указанной модели и каждого указанного скелета.

В следующем воплощении показатель связывания для каждой выбранной последовательности рассчитывают путем (i) обеспечения первой базы данных моделей молекулы МНС класса II; (ii) обеспечения второй базы данных возможного пептидного скелета для моделей молекул указанного МНС класса II; (iii) обеспечения третьей базы данных возможных конформаций аминокислот боковой цепи для каждой из этих двадцати аминокислот в каждом положении каждого скелета; (iv) отбора модели из указанной первой базы данных; (v) отбора возможного пептидного скелета из второй базы данных; (vi) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выбранном сегменте вместе с их возможными конформациями из указанной третьей базы данных; (vii) определения оптимального показателя связывающего сродства ко всем боковым цепям, которые присутствуют в каждом выбранном сегменте в каждой возможной конформаций; (viii) повторения стадий от (v) до (vii) для каждого указанного скелета и определения оптимального показателя связывания; и (ix) повторения стадий от (iv) до (viii) для каждой указанной модели.

Следует понимать, что эти три базы данных, описанные выше, могут быть объединены в одну базу данных, или любые две базы данных могут быть объединены, чтобы обеспечить объединенную базу данных.

Длина сегментов аминокислотного остатка, которые будут выбраны, может изменяться. Предпочтительно выбранные сегменты аминокислотного остатка состоят из приблизительно 10 - приблизительно 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно приблизительно 13 аминокислотных остатков.

Выбранные сегменты аминокислотных остатков могут перекрываться до различной степени. Предпочтительно выбранные сегменты аминокислотных остатков перекрываются существенно. Наиболее предпочтительно последовательно выбранные сегменты аминокислотных остатков перекрываются всеми, кроме одного аминокислотного остатка. То есть в сегменте аминокислотного остатка, имеющем n остатков, n-1 остатки перекрываются следующим последовательно выбранным сегментом аминокислотного остатка.

Таким образом, более подробно изобретение, кроме того, касается следующих далее предпочтительных воплощений:

- соответственно указанному способу, в котором указанное значение для каждой ароматической стороны цепи равно приблизительно половине указанного значения для каждой гидрофобной алифатической стороны цепи;

- соответственно указанному способу, в котором выбранный сегмент аминокислотного остатка составлен из 13 аминокислотных остатков;

- соответственно указанному способу, в котором последовательные выбранные сегменты аминокислотного остатка перекрываются одним - пятью аминокислотными остатками;

- соответственно указанному способу, в котором последовательные выбранные сегменты аминокислотного остатка перекрывают друг друга существенно;

- соответственно указанному способу, в котором все, за исключением одного, из аминокислотных остатков в последовательных выбранных сегментах аминокислотного остатка перекрываются.

Во втором основном аспекте настоящее изобретение обеспечивает, модифицированные формы различных биологических молекул с одним или более удаленными эпитопами Т-клеток, где указанная модификация может быть достигнута способами, описанными выше и в формуле изобретения. Молекулы могут также быть получены способами, как описано в вышеуказанном предшествующем уровне техники, однако молекулы, полученные методами данного изобретения, показывают улучшенные свойства. В способах предшествующего уровня техники спрогнозированные эпитопы Т-клеток вычленяются при использовании целесообразных аминокислотных замен в первичной последовательности терапевтического антитела или белка, который не представляет собой антитела, имеющих происхождение как от человека, так и нечеловеческого происхождения.

Настоящее изобретение обеспечивает модифицированные формы белков и иммуноглобулинов, которые, как ожидается, покажут улучшенные свойства in vivo.

Поэтому целью изобретения является обеспечение способа получения иммуногенно модифицированной биологической молекулы, полученной из родительской молекулы, где модифицированная молекула имеет аминокислотную последовательность, отличную от последовательности указанной родительской молекулы, и показывает сниженную иммуногенность относительно родительской молекулы, когда подвергнута иммунной системе определенного вида; указанный способ включает: (i) определение аминокислотной последовательности родительской биологической молекулы или ее части; (ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности белка любым способом, включающим определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов; (iii) разработку новых вариантов последовательности путем изменения, по крайней мере, одного аминокислотного остатка в пределах исходно идентифицированных последовательностей эпитопов Т-клеток, указанные варианты модифицируют таким способом, что существенно уменьшают или устраняют активность или некоторое число последовательностей эпитопов Т-клеток и / или некоторое число МНС аллотипов, способных связывать пептиды, производные от указанной биологической молекулы, как определено путем связывания пептида с МНС молекулами при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов или связывания пептид-МНС комплексов с Т-клетками, (iv) конструирование таких вариантов последовательности с помощью техники рекомбинантных ДНК и тестирование указанных вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами; и (v) необязательное повторение этапов (ii)-(iv), где идентификация последовательностей эпитопов Т-клеток согласно стадии (ii) достигается способом, как указано выше и ниже.

Специфические воплощения стадии (iii) согласно изобретению касаются следующих суммированных стадий:

- соответственно указанному способу, в котором 1-9 аминокислотных остатков, в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток изменен;

- соответственно указанному способу, в котором один аминокислотный остаток в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток изменен;

- соответственно указанному способу, в котором аминокислотное изменение выполняют в отношении гомологичной последовательности белка и/или в соответствии со способами моделирования in silico.

- соответственно указанному способу, в котором изменение аминокислотных остатков представляет собой замену, делецию или добавление исходно присутствующего(их) аминокислотного(ых) остатка(ов) другим(ми) аминокислотным(ми) остатком(ами) в специфическом(их) положении(ях).

- соответственно указанному способу, в котором дополнительно дальнейшее изменение, предпочтительно заменой, добавлением или делецией определенной(ых) аминокислот(ы), проводится для восстановления биологической активности указанной биологической молекулы.

За исключением стадии (ii) другие стадии раскрытого метода могут быть достигнуты способами и методами, которые являются хорошо известными квалифицированным в данном уровне техники специалистам. Так как модифицированные биологические молекулы получают предпочтительно рекомбинантными способами соответствующих ДНК структур, которые были выведены из последовательности аминокислоты после завершения обмена аминокислотных остатков, идентифицированных способом стадии (i). Рекомбинантные способы, используемые здесь, известны из данного уровня техники (например, Sambrook и другие., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA).

Биологическая молекула, полученная согласно изобретению, является предпочтительно пептидом, белком, антителом, фрагментом антитела или белком слияния. Кроме того, изобретение включает модификации, варианты, мутации, фрагменты, производные, не-, частично или полностью гликозилированные формы указанных молекул, имеющих ту же самую или подобную биологическую и/или фармакологическую активность.

Хотя метод, раскрытый в данном изобретении, не ограничен определенными биологическими молекулами, специфическим воплощением изобретения является обеспечение предпочтительно молекул, которые известны в данном уровне техники, и демонстрация терапевтической полезности и ценности. Таким образом, дополнительной целью изобретения является обеспечение иммуногенно модифицированной биологической молекулы, полученной из родительской молекулы, где модифицированная молекула имеет аминокислотную последовательность, отличную от последовательности указанной родительской молекулы, и показывает сниженную иммуногенность относительно родительской молекулы, когда подвергнута иммунной системе определенного вида, полученная способом согласно изобретению, как подробно раскрыто выше и ниже.

Биологические молекулы, представляющие особый интерес, полученные указанным способом, выбирают из групп:

(а) моноклоналъные антитела:

анти-40kD гликопротеин антиген антитело KS 1/4;

анти-GD2 антитело 14.18;

анти-Неr2 антитело 4D5 (мышиное) и гуманизированная версия (Herceptin®);

анти-Her1 (EGFR) антитело с225 и h425;

анти-IL-2R (анти-Тас) антитело (Zenapax®);

анти-СD52 антитело (САМРАТН®);

анти-СD20 антитела (С2В8, Rituxan®; Bexxar®);

антитело, направленное на С5 комплементный белок человека;

(b) белки человека:

sTNF-R1, sTNF-R2, sTNFR-Fc (Enbrel®);

белок С, асrр30, рицин A, CNTFR лиганды;

субтилизин, GM-CSF, фолликулостимулирующий гормон человека (h-fsh);

β-глюкоцереброзидаза, GLP-1, аполипопротеин А1;

лептин (белок ожирения человека), KGF, GM-CSF;

BDNF, ЕРО, I1-1R антагонист.

Третий основной аспект настоящего изобретения касается последовательностей эпитопов Т-клеток, которые происходят от родительских иммуногенно немодифицированных биологических молекул. Эти эпитопы предпочтительно являются 13-мерными пептидами. В пределах этих пептидов последовательности, имеющие 9 последовательных аминокислотных остатков, являются предпочтительными. Таким образом, другой целью изобретения является обеспечение доступа к таким эпитопам и последовательностям. Более подробно изобретение касается:

- применения потенциального Т-клеточного эпитопа пептида в пределах аминокислотной последовательности родительской иммуногенно немодифицированной биологической молекулы, идентифицированной согласно любому из описанных способов получения биологической молекулы со сниженной иммуногенностью, имеющей ту же самую биологическую активность;

- соответствующего применения потенциального Т-клеточного эпитопа пептида, где указанный эпитоп Т-клеток является 13-мерным пептидом;

- применения последовательности пептида, состоящей, по крайней мере, из 9 последовательных аминокислотных остатков 13-мерного эпитопа Т-клеток, как указано выше, для получения биологической молекулы со сниженной иммуногенностью, имеющей ту же самую биологическую активность по сравнению с родительской немодифицированной молекулой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГУРА 1 представляет блок-схему, иллюстрирующую первый аспект настоящего вычислительного метода;

ФИГУРА 2 представляет блок-схему, иллюстрирующую генерирование базы данных для вычислительного метода, воплощаемого настоящим изобретением;

ФИГУРА 3 представляет блок-схему, иллюстрирующую запрос базы данных для создания шаблона пептида для потенциальных эпитопов Т-клеток;

ФИГУРА 4 представляет дополнительную блок-схему, иллюстрирующую вычислительный метод.

ФИГУРА 5 представляет график индекса вероятности эпитопа Т-клеток versus координат (положений) аминокислотного остатка декарбоксилазы глутаминовой кислоты (MW: 65000) изоформ (GAD 65);

ФИГУРА 6 представляет график индекса вероятности эпитопа Т-клеток versus координат (положений) аминокислотного остатка эритропоэтина (ЕРО);

ФИГУРА 7 представляет график индекса вероятности эпитопа Т-клеток versus координат (положений) аминокислотного остатка легкой цепи гуманизированного анти-А33 моноклонального антитела; и

ФИГУРА 8 является графиком индекса вероятности эпитопа Т-клеток versus координат (положений) аминокислотного остатка тяжелой цепи гуманизированного анти-А33 моноклонального антитела.

На вышеупомянутых ФИГУРАХ 5-8, сплошная линия (―) представляет индекс эпитопа Т-клеток, рассчитанный вычислительным способом в соответствии с блок-схемой, показанной в ФИГУРЕ 1, и пунктирная линия (.....) представляет расчетное количество эпитопов Т-клеток, рассчитанное в соответствии с вычислительным методом в соответствии с блок-схемой, показанной на ФИГУРЕ 3, согласно другому аспекту настоящего изобретения.

Детальное описание изобретения

Термин "эпитоп Т-клеток" означает в соответствии с пониманием данного изобретения аминокислотную последовательность, которая способна связываться с приемлемыми эффективными молекулами МСН класса II (или их эквивалентами в нечеловеческих видах), способна стимулировать Т-клетки и/или также связывать (без неизбежной до определенной степени активации) с Т-клетками в комплексе с МСН класса II.

Термин "пептид", как используется в контексте данной заявки и приложенных пунктах формулы, представляет собой соединение, которое включает две или более аминокислот. Аминокислоты связываются вместе с помощью пептидной связи (определено ниже). Существует 20 различных природных аминокислот, вовлеченных в биологическую продукцию пептидов, и любое их количество может связываться в любом порядке для образования пептидной цепи или кольца. Существующие в природе аминокислоты, используемые в биологическом производстве пептидов, все имеют L-конфигурацию. Синтетические пептиды могут быть получены с применением приемлемых способов синтеза при использовании L-аминокислот, D-аминокислот, различных комбинаций аминокислот двух различных конфигураций. Некоторые пептиды содержат только несколько аминокислотных единиц. Короткие пептиды, например, имеющие менее чем десять аминокислотных единиц, иногда называются "олигопептидами". Другие пептиды содержат большое число аминокислотных остатков, например до 100 или более, и называются "полипептидами". По договоренности "полипептидом" можно считать любую пептидную цепь, которая содержит три или более аминокислот, в то время как "олигопептид" обычно считается частным типом "короткого" полипептида. Таким образом, как используется в контексте данной заявки, понятно, что любое упоминание "пептида" также включает и олигопептид. Кроме того, любая ссылка на "пептид" включает полипептиды, олигопептиды и белки. Каждое различное распределение аминокислот образует различные полипептиды или белки. Число полипептидов и отсюда число различных белков, которые могут быть образованы, является практически неограниченным.

Термин "уменьшенная или сниженная иммуногенность", используемый ранее, и здесь далее является относительным термином и касается иммуногенности соответствующей первоначальной исходной молекулы, когда оно подвергается воздействию in vivo тем же видам по сравнению с молекулой, модифицированной согласно изобретению.

Термин "модифицированный белок", как используется в контексте данного изобретения, описывает белок, который имеет уменьшенное количество эпитопов Т-клеток и поэтому выявляет сниженную иммуногенность по сравнению с родительским белком, когда подвергается иммунной системе определенных видов. Термин "немодифицированный белок", как используется в данном изобретении, описывает "родительский" белок, который в сравнении с "модифицированным белком" имеет большее количество эпитопов Т-клеток и поэтому увеличенную иммуногенность относительно модифицированного белка, когда подвергается иммунной системе определенных видов.

"Альфа углерод (Сα)" представляет собой углеродный атом углеводородного (СН) компонента, который находится в пептидной цепи. "Боковая цепь" представляет собой подвешенную группу к Сα, которая может включать простую или сложную группу или остаток и которая имеет физические размеры, которые могут значительно отличаться по сравнению с размерами пептида.

Эпитопы Т-клеток могут быть идентифицированы вычислительным методом данного изобретения путем рассмотрения аминокислотных остатков, важных для связывания специфического эпитопа Т-клеток с молекулами МНС класса II. После идентификации потенциальные эпитопы Т-клеток могут быть вычленены или удалены из последовательности аминокислотного остатка путем изменения, таким как мутирование, ключевых аминокислотных остатков в этой последовательности. Любая модификация, сделанная в последовательности пептида в области, которая, вероятно, будет содержать эпитопы Т-клеток, путем делеции, добавления или замены, приводящая к относительно более низкому полному показателю связывания, будет приводить к менее иммуногенной последовательности аминокислотного остатка. В некоторых случаях может быть желательно увеличить связывание нек