Композиции и способы улучшения состояния сосудистой системы

Композиции и способы улучшения состояния сосудистой системы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к композициям, содержащим полифенолы, например полифенолы какао, такие как процианидины, в комбинации, по крайней мере, с одним реагентом, снижающим уровень холестерина, и к способам улучшения состояния сосудистой системы, включая лечение и профилактику атеросклероза и сердечно-сосудистого заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заболевание коронарных артерий, первичная форма сердечно-сосудистого заболевания (CVD), является главной причиной смертности в Соединенных Штатах на сегодняшний день. На третьем месте находится цереброваскулярное заболевание. Этиологию заболевания коронарных артерий и цереброваскулярных заболеваний связывают с атеросклерозом. На основании клинических проявлений установлено, что атеросклероз является главной причиной более одного миллиона сердечных приступов, приблизительно 400000 инсультов, которые происходят каждый год, и причиной многочисленных проблем, связанных с кровообращением. Многие больные страдают от гипертензии.

На основании значительного количества доказательств установлена причинная взаимосвязь между гиперхолестеринемией и ранним атеросклерозом; чем выше уровень холестерина в плазме крови, тем больше риск последующего сердечного приступа (см., например, Steinberg, D., JAMA 264: 3047 (1990)). Полагают, что в цепи событий, приводящих к атеросклерозу, инициирующим событием является образование "прожилок жира" в сонных, венечных и церебральных артериях и в аорте. Указанные патологические изменения включают в себя жировые отложения холестерина и холестерилового эфира, которые обнаружены в основном в гладкомышечных клетках и макрофагах слоя интимы. Миграция и пролиферация гладкомышечных клеток сосудов играет решающую роль в патогенезе атеросклероза после первоначального отложения липида.

Кроме того, развитие атеросклероза и сердечно-сосудистого заболевания модулируется и/или связано с окислением ЛПНП (LDL), активностью циклооксигеназы (СОХ), активностью липоксигеназы (LOX), синтезом оксида азота (NO) и активностью синтазы оксида азота (NOS). Связи между различными путями и процессами, вовлеченными в данную патологию, представлены на фиг.1 и детально описаны в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как международная патентная заявка WO 97/36497, соответствующие части которой включены в данный текст в виде ссылки. Кратко, окисление LDL является критической стадией в появлении повреждений (атеросклеротических бляшек), которые возникают тогда, когда макрофаги поглощают модифицированные окислением LDL и превращаются в так называемые «пенистые клетки». Ферменты СОХ и LOX включаются в путь метаболизма арахидоновой кислоты, что приводит к продукции простагландинов и тромбоксана А2, причем последний, как известно, вызывает сужение кровеносных сосудов и агрегацию тромбоцитов, и, следовательно, прогрессирование атеросклероза. Известно, что оксид азота ингибирует агрегацию тромбоцитов, адгезию/хемотаксис моноцитов и пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов, причем все указанные факторы, как полагают, ответственны за прогрессирование атеросклероза. Было показано, что полифенолы какао оказывают благоприятное воздействие на вышеописанные процессы путем ингибирования окисления LDL, увеличения активности NO/NOS и ингибирования активности COX/LOX. Указанные эффекты продемонстрированы, например, в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как международная патентная заявка WO97/36497, и в примерах, приведенных в заявке. Полифенолы какао могут быть использованы для лечения или профилактики состояний, на которые, как известно, воздействуют введением нестероидных противовоспалительных средств, например аспирина.

Несмотря на благоприятное воздействие полифенолов какао на ряд путей метаболизма и состояний, связанных с индукцией и прогрессированием атеросклероза и CHD (ишемической болезни сердца), было показано, что указанные соединения не оказывают заметного холестеринснижающего эффекта. Таким образом, заявители приготовили улучшенную композицию, содержащую полифенолы в комбинации, по крайней мере, с одним реагентом, снижающим уровень холестерина. Композиция обладает усиленным воздействием на состояние сосудистой системы млекопитающего, в частности человека, по сравнению с ранее известными композициями, содержащими полифенол или холестеринснижающие реагенты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композициям и способам улучшения общего состояния сосудистой системы у млекопитающего, в частности человека или животного.

В одном аспекте изобретение относится к композиции, такой как пищевой продукт, пищевая добавка, дополнение к пищевому рациону или фармацевтический препарат, содержащий полифенол какао и реагент, снижающий уровень холестерина. Необязательно композиция может содержать L-аргинин.

В другом аспекте изобретение относится к кондитерскому изделию, снижающему уровень холестерина, наиболее предпочтительно к холестеринснижающему шоколаду (например, темному шоколаду) и к кондитерскому изделию, содержащему холестеринснижающий шоколад.

В другом аспекте изобретение относится к способу улучшения общего состояния сосудистой системы, включая профилактику или лечение атеросклероза и сердечно-сосудистого заболевания у млекопитающего, такого как человек или домашнее животное, путем введения композиции, содержащей полифенол какао и холестеринснижающее соединение и, необязательно, L-аргинин. Полифенолы из других источников, обладающие такими же свойствами, как и полифенолы какао, также могут быть использованы в композициях и способах согласно изобретению в комбинации с реагентами, снижающими уровень холестерина, такими как холестеринснижающие реагенты на основе стерина и/или станола.

Кроме того, в других аспектах изобретение относится к способу увеличения всасывания полифенола, например флаванола или флавонола, путем введения млекопитающему полифенола в комбинации с фитостерином и/или фитостанолом. Также представлены композиции и продукты промышленного производства для использования в способе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 представляет собой схему, в которую включены основные факторы, которые вносят вклад в развитие ишемической болезни сердца (CHD), показывающую, как полифенолы какао способствуют предотвращению развития заболевания.

На фиг.2 A-D показано действие фитосоединений на синтез базальными эндотелиальными клетками простаноидов и эндотелинов в BAECS. (*= значительно отличается от контроля при р<0,05).

На фиг.3 А-В показано влияние типов клеток на вызванные процианидином изменения в высвобождении эндотелиальными клетками простациклина и эндотелина.

На фиг.4 А-С показано влияние потребления напитка какао на экспрессию на поверхности тромбоцитов активированного GPIIb-IIIa со стимуляцией слабыми агонистами или без нее.

На фиг.5 А-С показано влияние потребления напитка какао на экспрессию на поверхности тромбоцитов активированного Р-селектина со стимуляцией слабыми агонистами или без нее.

На фиг.6 показано влияние фитостеринов, процианидинов какао и их комбинации на всасывание эпикатехина в плазму крови.

На фиг.7 показано влияние фитостеринов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение ДНК.

На фиг.8 показано влияние фитостеринов, процианидинов какао и их комбинации на окислительное повреждение липидов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все патенты, патентные заявки и справки, процитированные в данной заявке, включены в текст посредством ссылки. В случае какого-либо несоответствия в настоящем описании оно урегулировано.

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полифенол какао в комбинации с холестеринснижающим реагентом, например холестеринснижающим реагентом на основе стерина и/или станола, причем композицию применяют для улучшения или поддержания здорового состояния сосудистой системы у млекопитающего. Необязательно, композиция может содержать L-аргинин, кальций, калий, магний, витамин Е, витамин С, любой из витаминов комплекса В, каротиноид, гуаровую смолу или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту). Композиции, содержащие полифенолы из других источников, которые обладают свойствами, подобными свойствам полифенолов из какао, также могут быть использованы в композициях и способах согласно изобретению в комбинации с холестеринснижающими реагентами, например холестеринснижающими реагентами на основе стерина и/или станола, и они также находятся в объеме притязаний изобретения.

Употребляемый в данном тексте термин «полифенол какао» (СР) относится к полифенольному веществу, включая проантоцианидин, особенно процианидин, присутствующий в бобах какао или экстрагированный из бобов какао или ингредиентов из какао. Термин «процианидин» включает в себя как мономеры, так и олигомеры катехина и эпикатехина. Следует учесть, что любая употребляемая в данном тексте ссылка на полифенол из какао также применима к процианидину из какао. Термин "ингредиент какао" относится к материалу из какао, содержащему твердые вещества, полученному из освобожденных от оболочек плодов какао, такому как шоколадная жидкая масса и частично или полностью обезжиренное твердое вещество какао (например, брикет или порошок). Фраза «холестеринснижающий реагент» означает любое соединение, комбинацию соединений, экстракт или растительный компонент, природного происхождения или синтезированный, который обладает способностью снижать уровень холестерина у млекопитающего при введении его в эффективном количестве. Когда таким холестеринснижающим реагентом является соединение или комбинация соединений, т.е. типа стерина или станола, включая производные и изомерные формы, холестеринснижающий реагент называют «холестеринснижающий реагент на основе стерина и/или станола». Когда фразу употребляют при ссылке на композицию, например, "холестеринснижающий темный шоколад", то это означает, что композиция обладает способностью снижать уровень холестерина. Как можно понять специалисту в данной области, что употребляемый в тексте термин «сосудистый» относится ко всей сосудистой системе, т.е. он охватывает сердце, и термин «здоровое состояние сосудистой системы» включает в себя здоровое состояние сердечно-сосудистой системы и/или здоровое состояние коронарных сосудов. «Поддержание здорового состояния сосудов» относится к достижению благоприятных результатов в отношении состояния сосудов, описанных в данном тексте.

Полифенолы какао могут быть природного происхождения, т.е. получены из бобов какао, или синтезированы. Специалист в данной области может выбирать природный или синтетический полифенол какао на основании доступности или стоимости. Полифенолы какао могут быть включены в композицию в качестве ингредиента какао, содержащего полифенолы какао, например шоколадной, жидкой массы в шоколаде, или могут быть добавлены независимо от ингредиентов из какао, например, в виде экстракта, фракции экстракта, объединенных фракций экстракта или в виде синтезированного соединения. Полифенолы какао включают в себя процианидины какао, которые представляют собой мономеры и/или олигомеры эпикатехина и катехина. Мономеры процианидина включают в себя (+)-катехин, (-)-эпикатехин и их соответствующие эпимеры (например, (-)-катехин и (+) -эпикатехин) и имеют структуру

Олигомеры процианидина могут иметь от 2 до приблизительно 18, предпочтительно от 2 до приблизительно 12 и самое предпочтительное от 2 до приблизительно 10, мономерных единиц. Например, олигомеры могут быть димерами, тримерами, тетрамерами, пентамерами, гексамерами, септамерами, октамерами, нонамерами и декамерами. В олигомере мономеры соединены посредством межфлавановых связей (4→6) и/или (4→8). Олигомеры с исключительно (4→8) связями являются линейными, в то время как присутствие, по крайней мере, одной (4→6) связи приводит к разветвленному олигомеру.

Полифенол какао может быть получен путем экстракции из бобов какао, плодов какао (очищенных от шелухи) или ингредиентов какао, таких как шоколадная жидкая масса, частично обезжиренные твердые частицы из какао и/или полностью обезжиренные твердые вещества какао. Предпочтительно, экстракт получают из полностью или частично обезжиренного порошка какао. Бобы из любых видов Theobroma, Herrania или из их межвидовых или внутривидовых скрещиваний могут быть использованы. Экстракт может быть получен из ферментированных, неполностью ферментированных или неферментированных бобов, ферментированных бобов с наименьшим содержанием полифенолов какао и не ферментированных с наибольшим количеством полифенолов. Выбор бобов может быть сделан на основе фактора ферментации бобов, например, экстракт может быть получен из бобов с фактором ферментации 275 или меньше. Оптимизация уровня полифенолов в ингредиенте какао и его экстракте может быть сделана путем регуляции степени ферментации, как это описано в международной заявке № PCT/US97/15893, опубликованной как международная патентная заявка WO 98/09533, соответствующие части которой включены в данный текст в виде ссылки.

Полифенолы какао можно экстрагировать из ингредиентов какао, которые были получены традиционными способами обработки какао (описанными, например, в Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T., Blackie Acad. & Professional, New York, 1997, в разделах 1, 5 и 6) или улучшенным способом обработки, описанным в патенте США № 6015913 на имя Kealey et al., с помощью которого сохраняются полифенолы (путем предотвращения их деструкции) в ингредиентах какао по сравнению с традиционными способами. Улучшенный способ обработки какао исключает традиционную стадию обжаривания. Таким образом, могут быть использованы ингредиенты какао, получаемые путем (а) нагревания бобов какао в течение времени и при температуре, достаточными для освобождения от какаовеллы без обжаривания зерен какао; (b) отделения зерен какао от какаовеллы веянием; (с) отжима зерен какао с помощью винтового пресса и (d) извлечения масла какао и частично обезжиренных твердых частиц, которые содержат полифенолы какао на сохраненном уровне. Указанный способ позволяет сохранять уровень высших олигомеров процианидина намного выше, чем традиционный способ. Полученные указанным способом твердые частицы какао могут содержать больше чем 20000 мкг всех процианидинов на грамм необезжиренных твердых частиц, предпочтительно более чем 25000 мкг/г, более предпочтительно выше чем 28000 мкг/г и наиболее предпочтительное выше чем 30000 мкг/г. Для целей настоящего изобретения общее количество процианидина определяют, как описано в примере 3.

Полифенолы какао можно экстрагировать из указанных выше источников, используя растворители, в которых полифенолы растворяются. Подходящие растворители включают в себя воду или органический растворитель, такой как метанол, этанол, ацетон, изопропиловый спирт и этилацетат. Также можно использовать смеси растворителей. Когда воду используют в качестве растворителя, то предпочтительно, чтобы она была слегка подкислена, например, уксусной кислотой. Предпочтительными растворителями являются смеси воды и органического растворителя, например водный метанол, этанол или ацетон. Водноорганические растворители могут содержать, например, приблизительно от 50% до 95% органического растворителя. Таким образом, может быть использован 50%, 60%, 70%, 80% и 90%-ный органический растворитель в воде. Кроме того, растворитель может содержать небольшое количество кислоты, такой как уксусная кислота, например, в количестве приблизительно от 0,5% до 1,0%. Композиция из экстрактов, т.е. представительность (т.е. профиль олигомеров) и количество олигомеров процианидина, будет зависеть от выбора растворителей. Например, водный экстракт содержит главным образом мономеры, этилацетатный экстракт содержит мономеры и низшие олигомеры, в основном, димеры и тримеры, и воднометанольный, водноэтанольный и водноацетоновый экстракт содержит мономеры и ряд высокомолекулярных олигомеров. Одним из предпочтительных растворителей для экстракции мономера, а также высокомолекулярных олигомеров является 70%-ный ацетон. Однако в изобретении применяют любой экстракт, содержащий полифенолы. Способы экстракции полифенола какао известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 5554645 на имя Romanczyk et al. и в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как международная патентная заявка WO 97/36497. Таким образом, в одном аспекте, экстракт какао получают путем измельчения бобов какао до порошка какао, обезжиривания порошка, экстрагирования полифенолов какао и очистки экстракта. Порошок какао можно получить путем сублимационной сушки бобов какао и пульпы, дробления пульпы и лущения бобов какао, высушенных сублимационно, и измельчения лущеных бобов.

Экстракт полифенолов какао можно очистить, например, путем удаления кофеина и/или теобромина и далее очисткой с помощью гель-фильтрации и/или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Гель-фильтрацию (например, на Сефадексе LH-20) можно использовать для обогащения экстракта высшими олигомерами процианидина. Например, элюат, содержащий мономеры и низшие олигомеры, можно не собирать до тех пор, пока с колонки не начнет элюироваться выбранный олигомер (олигомеры). Пример такого экстракта известен в данной области и описан в примере 5 международной заявки № PCT/US97/05693, опубликованной как международная патентная заявка WO 97/36497, соответствующие разделы которой включены в данный текст в виде ссылки. С помощью препаративной ВЭЖХ, например нормально-фазовой ВЭЖХ, экстракт можно фракционировать, например, на фракции мономеров и олигомеров, содержащие, по меньшей мере, 50 мас.% мономера или специфического олигомера (олигомеров). Когда фракции содержат мономеры и низшие олигомеры (вплоть до и включая тетрамер), фракции содержат приблизительно от 90 до 95 мас.% отдельной олигомерной фракции. Желаемые фракции можно объединить после разделения с получением комбинации олигомеров по выбору, например, с содержанием олигомеров 3-10 или 5-10. Специалист в данной области может регулировать условия хроматографии для достижения желаемого профиля процианидинов с учетом указаний, описанных в данном тексте, знаний в данной области и, например, руководств, описанных в патенте США № 5554645 заявителем Romanczyk et al., и в международной заявке № PCT/US97/05693, опубликованной как международная патентная заявка WO 97/36497.

Полифенол какао может быть представлен в композиции согласно изобретению путем включения ингредиентов какао, содержащих полифенолы, или путем включения шоколада, который может быть молочным, сладким и полусладким, и предпочтительным является темный шоколад и шоколад с низким содержанием жира. Ингредиенты какао могут быть получены традиционными способами обработки какао, но предпочтительным является способ, описанный в патенте США № 6015913 заявителем Kealey et al. В качестве альтернативы, для повышения уровня полифенолов какао может быть использована шоколадная, жидкая масса и твердые частицы какао, полученные из бобов какао с фактором ферментации 275 или менее. Указанные ингредиенты имеют такое содержание полифенола какао, которое выше, чем содержание полифенола, полученного при использовании традиционных способов обработки какао (например, с обжариванием) и из полностью ферментированных бобов. Шоколад может быть получен обычными методами из описанных выше ингредиентов и улучшенным способом для сохранения полифенолов какао при изготовлении шоколада, как описано в международной заявке № PCT/US99/05414, опубликованной как международная патентная заявка WO 99/45788, соответствующие разделы которой включены в данный текст в виде ссылки. Шоколад, полученный, по крайней мере, одним из следующих нетрадиционных способов, называют в тексте как «шоколад, содержащий сохраненное количество полифенолов какао»: (i) получение ингредиентов какао из не полностью ферментированных или неферментированных бобов какао; (ii) сохранение полифенола какао при способе промышленного производства ингредиента какао и (iii) сохранение полифенола какао при способе промышленного производства шоколада.

Также могут быть использованы синтетические процианидины, и их получают способами, известными в данной области и описанными, например, в международной заявке № PCT/US98/21392, опубликованной как международная патентная заявка WO 99/19319, соответствующие разделы которой включены в данный текст в виде ссылки. Также могут быть использованы производные полифенола какао. Указанные производные включают в себя галлатированные мономеры и олигомеры, гликозилированные мономеры и олигомеры и их смеси; метаболиты мономеров и олигомеров процианидина, такие как сульфированные, глюкуронидированные и метилированные формы, и продукты ферментативного расщепления процианидинов, образованные в процессе метаболизма микрофлоры кишечника или в результате обменных процессов в организме млекопитающего. Производные могут быть получены из природных источников или синтезированы.

Кроме того, композиция содержит холестеринснижающий реагент. Любой холестеринснижающий реагент может быть использован независимо от его способа действия. Подходящие реагенты могут воздействовать путем снижения поглощения холестерина в желчь млекопитающего или путем снижения синтеза холестерина. Примерами подходящих реагентов являются фитостерины, фитостанолы и их производные и изомеры; соевый белок; растворимые волокна, например бета-глюкан из, например, овса и псилиума, орехов, масла из рисовых отрубей, каждый из которых является особенно подходящим для включения в композиции на основе пищевого продукта, дополнения к рациону и пищевой добавки. Также могут быть использованы известные лекарственные средства, снижающие уровень холестерина, но они являются менее предпочтительными для включения в пищевые композиции и композиции с пищевыми добавками, однако они могут быть использованы в фармацевтической промышленности. Специалисту в данной области будет очевидно, что выбор холестеринснижающего реагента зависит от предполагаемого средства доставки (например, пищевой продукт, добавка, фармацевтический препарат) и способа введения. Таким образом, реагент, который снижает всасывание холестерина в желчь, не является предпочтительным для внутривенного введения. Аналогично, если средством доставки является пищевой продукт, холестеринснижающий реагент с резким вкусом и запахом не может быть желаемым.

Фитостерины являются растительными стеринами, которые не растворяются в воде и имеют молекулярный вес и структуру, подобные холестерину. Фитостерин снижает степень всасывания холестерина в желчь (как эндогенного, так и холестерина из пищи), а также уровни холестерина в сыворотке (общего или LDL) без его поглощения. Свыше сорока растительных стеринов идентифицировано, но бета-ситостерин, кампестерин и стигмастерин являются самыми распространенными. Другими примерами полезных стеринов являются брассикастерин, десмостерин, чалиностерин, пориферастерин, клионастерин. Индивидуальные стерины или смеси стеринов, выделенные из природных источников или синтезированные, и изомеры и их производные могут быть использованы. Особенно пригодными являются насыщенные производные стеринов, известные как станолы, у которых все углерод-углеродные связи в кольцах являются насыщенными. Подходящие для использования станолы имеют 28 или 29 атомов углерода и включают в себя бета-ситостанол, клионастанол, 22,23-дигидробрассикастанол и кампестанол. Фитостерины могут быть в твердом (например, порошок, гранулы) или жидком (например, масло) состоянии.

Стерины и станолы обнаружены в некоторых растительных материалах, как описано, например, в международной заявке № РСТ/ЕР96/02344. Примерами источников стеринов/станолов являются кора сосны, соевое масло, талловое масло, экстракт из побегов бамбука (описаны в международной заявке № PCT/US98/12556, опубликованной как международная патентная заявка WO 98/57545), оболочки какао и масло какао, и масло рисовых отрубей. Талловое масло, побочный продукт целлюлозной и бумажной промышленности, является хорошим источником станола, т.е. бета-станола.

Растительный стерин может быть получен из природных источников, таких как растительные масла, осадок растительного масла, дистилляты растительного масла и другие источники растительного масла, такие как талловое масло, с помощью относительно простых и недорогих способов. Например, получение стеринов из осадка растительного масла с помощью растворителей, таких как метанол, описано в патенте США № 4420427 заявителем Hamunen. Станолы обнаружены в небольших количествах в природных источниках, но легко могут быть получены из стеринов гидрированием стеринов любым из нескольких способов, известных специалистам в данной области. Когда исходный стериновый материал получают из растительного материала, он содержит смесь нескольких различных стеринов, таким образом, после гидрирования образовавшийся станол будет также представлять собой смесь различных станолов. Указанные смеси являются подходящими для их использования в настоящем изобретении. Однако чистые специальные препараты стерина могут быть также гидрированы для получения чистых станолов, которые также могут быть использованы.

Масло какао, экстрагированное из оболочек какао, является хорошим источником фитостерина. Фитостерины какао представляют собой смесь свободных и связанных стеринов, причем содержание свободных стеринов составляет вплоть до приблизительно 90% от присутствующих фитостеринов. Фитостерины включают в себя кампестерин, β-ситостерин, стигмастерин, циклоартеноил, 24-метиленциклоартеноил, а также минорные количества других фитостеринов. Связанные фитостерины включают в себя сложные эфиры жирных кислот или ферулатные производные фитостеринов. Масло какао также содержит токолы, которые включают в себя токоферолы (которые обладают антиоксидантными свойствами) и токотриенолы (которые могут обладать холестеринснижающей способностью). Масло какао получают способом, который включает в себя стадии: (i) измельчение оболочек какао; (ii) экстрагирование измельченных оболочек какао растворителем для фитостеринов; (iii) удаление растворителя, и (iv) извлечение масла какао. Оболочки какао, представляющие собой побочный продукт при обжаривании бобов какао, могут быть получены из высушенных ферментированных бобов какао, тонкоизмельченных бобов какао, обжаренных бобов какао и предпочтительно из высушенных неферментированных бобов, которые имеют самое высокое содержание всех стеринов. Предпочтительными бобами какао являются бобы из вида Theobroma cacao. Предпочтительными растворителями являются петролейный эфир, гексан, пентан и этилацетат. Растворитель может быть удален вакуумной дистилляцией. В одном аспекте высушенные при температуре ниже 0°С оболочки измельчают до тонкого порошка с помощью устройства Tekmat Mill (Cincinatti, ОН) и измельченную массу подвергают экстрагированию в течение ночи дважды перегнанным петролейным эфиром (точка кипения 38-39,6°С) в аппарате Сокслета (Fisher Scientific, Springfield, NJ). На следующее утро растворитель осторожно удаляют путем медленного выпаривания в токе азота и полученный экстракт хранят при -40°С. Затем фитостерины могут быть очищены препаративной ВЭЖХ или колоночной хроматографией.

Этерифицированные формы как стеринов, так и станолов могут быть использованы. Этерификация стеринов/станолов приводит к лучшему растворению в жирах и маслах, что может, в некоторых случаях, помочь их включению в пищевые продукты или другие средства доставки. Например, стерины могут быть этерифицированы сложными эфирами жирных кислот. Примеры таких этерифицированных стеринов включают в себя ситостерина ацетат, ситостерина олеат и стигмастерина олеат. Сложные эфиры станола могут быть получены способами, известными в данной области, и, например, описаны в патенте США № 6031118 заявителем van Amerongen et al, в патенте США № 5892068 заявителем Higgins, в патенте США № 5502045 заявителем Miettenen et al и в международной заявке № РСТ/СА99/00655 (опубликованной как международная патентная заявка WO 00/04887). В одном аспекте применяемые сложные эфиры станола получают путем этерификации, по крайней мере, одного стерина с помощью сложного эфира С₂-С₂₂ жирной кислоты, как описано в патенте США № 5958913 заявителем Miettenen et al. Другие способы, известные в данной области, могут быть использованы для увеличения растворимости стеринов/станолов при введении млекопитающему. Один такой способ описан в патенте США № 5932562 заявителем Ostlund, в котором стерин/станол смешивают с лецитином с получением водорастворимого порошка.

Стерины/станолы могут быть добавлены к композиции в виде порошка путем перемешивания с другими ингредиентами. В случае пищевой композиции стерины/станолы, а также другие холестеринснижающие реагенты подходящим образом добавляют на стадии смешивания. В процессе приготовления холестеринснижающего шоколада, например, стерины/станолы могут быть добавлены к сухой смеси, содержащей сахар, мягкое масло, плоды до измельчения или к расплавленному шоколаду, который является менее предпочтительным. Чтобы облегчить перемешивание, стерины/станолы могут быть вначале растворены в солюбилизирующем реагенте, таком как жир, растительное масло, моноглицериды, диглицериды, триглицериды, токоферолы и их смеси. Эффективными носителями для получения суспензий и эмульсий стеринов/станолов являются вода, спирт, полиол, другие пищевые соединения, например шоколадная жидкая масса, в которой стерины/станолы, по крайней мере, частично растворимы, и их смеси.

Соевый белок может быть добавлен к композиции в любом известном виде, например, он может быть в виде выделенного белка сои, белкового концентрата сои, структурированного белка сои или соевой муки, хлопьев и круп. Целое зерно или его фрагмент могут быть использованы, как описано, например, в примере 5. Различные виды соевого белка хорошо известны в данной области и являются коммерчески доступными. Свойства соевого белка и способы его получения описаны, например, в публикации Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke et al., eds., Acad. Press, NY, 1979. Соевый белок может быть использован в комбинации с любым холестеринснижающим реагентом на основе стерина и/или станола.

Растворимые волокна растения, например бета-глюкан, проявляют способность снижать уровень холестерина плазмы. Волокна для применения в настоящем изобретении могут быть получены из любого источника бета-глюкана, предпочтительно из зерен овса и овсяных отрубей. Волокна могут быть получены и добавлены к композиции способами, известными в данной области. Особенно они являются подходящими для композиций, доставляемых пероральным путем, таких как пищевые продукты и дополнения к рациону. Бета-глюкан и другие растворимые растительные волокна могут быть использованы в комбинации с любым холестеринснижающим реагентом, основанным на стерине и/или станоле.

Композиция согласно изобретению также может содержать L-аргинин, который может присутствовать в композиции согласно изобретению в различном виде, например в виде очищенного соединения, экстракта из L-аргининсодержащего растения или в качестве ингредиента семени/ореха, например ореховой муки, или в качестве цельного семени/ореха. Любой источник L-аргинина может быть использован, синтетический или природный. Предпочтительными источниками L-аргинина являются соевые бобы и ядра орехов, таких как земляные орехи, грецкие орехи, миндальные орехи и лесные орехи. Могут быть использованы обезжиренные или частично обезжиренные ядра орехов. Они могут быть измельчены и называются ореховой мукой.

Композиция может также содержать кальций, калий, магний, витамин Е, витамин С и любой из витаминов комплекса В, каротиноид, гуаровую смолу или моно- или полиненасыщенную жирную кислоту (например, омега-3 жирную кислоту), которая может быть получена способами, известными в данной области. Моно- или полиненасыщенные жирные кислоты могут быть применены как оливковое масло, рыбий жир или орех. Подходящими для такого применения примерами орехов являются земляные орехи, миндальные орехи и грецкие орехи.

Также в сфере изобретения находится композиция, содержащая полифенол, который проявляет, по крайней мере, одно из следующих свойств: снижение тонуса сосудов (релаксации), ингибирование активности СОХ, ингибирование активности LOX, ингибирование окисления LDL, увеличение активности NOS, повышение уровня NO, ингибирование агрегации тромбоцитов, адгезии моноцитов и пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, снижение кровяного давления, снижение тромбоза и регуляция окислительного стресса, а также холестеринснижающий реагент. Любой холестеринснижающий реагент, например, холестеринснижающий реагент на основе стерина и/или станола может быть использован. В такой композиции холестеринснижающий реагент на основе стерина и/или станола усиливает биодоступность полифенола. Примерами таких полифенолов являются флаванолы (например, катехин, эпикатехин и их галлатированные производные), флавонол (например, кверцетин, кемпсерол, мирицетин и их гликозилированные производные) и процианидины (например, димер процианидина, который может быть получен из какао).

Композицию изобретения применяют в качестве пищевого продукта, пищевой добавки, дополнения к рациону или фармацевтического препарата. Композиции могут содержать носитель, разбавитель или наполнитель. В зависимости от предназначения, носитель, разбавитель или наполнитель могут быть выбраны таким образом, чтобы быть подходящими для употребления человеком или в ветеринарии в качестве пищи, добавки, дополнения или фармацевтического препарата.

Употребляемый в тексте термин «пищевой продукт» означает материал, состоящий в основном из белка, углевода и/или жира, который употребляется организмом для того, чтобы поддержать процессы роста, восстановления и жизненно важные процессы и поставлять энергию. Пищевые продукты могут также содержать дополнительные вещества, такие как минералы, витамины и приправы. См. Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10^th Edition, 1993. Термин «пищевой продукт» включает в себя напиток, приспособленный для потребления человеком или животным. Употребляемый в тексте термин «пищевая добавка» имеет значение, определенное FDA in 21 C.F.R. 170.3 (е) (1) и включает в себя прямые и непрямые добавки. Употребляемый в тексте термин «фармацевтический препарат» означает лекарственное средство. См. Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10^th Edition, 1993. Фармацевтический препарат может называться лекарственным препаратом. Употребляемый в тексте термин «дополнение к рациону» означает продукт (отличный от табака), который предназначен для пополнения рациона, который вносит или содержит один или более пищевых ингредиентов: витамин, минерал, растение или другой ботанический материал, аминокислоту, диетическое вещество для употребления человеком, чтобы дополнить рацион путем увеличения общего ежедневного потребления, или концентрат, метаболит, составную часть, экстракт или комбинацию указанных ингредиентов.

Любой обычный пищевой продукт, включающий любой напиток, который улучшен добавлением холестеринснижающего реагента в комбинации с полифенолом, таким как полифенол какао, или его производным, и необязательно в комбинации с L-аргинином, кальцием, калием, магнием, витамином Е, витамином С, любым из витаминов комплекса В, каротиноидом, гуаровой смолой и/или моно- или полиненасыщенной жирной кислотой (например, омега-3), находится в сфере изобретения.

В случае полифенола какао, улучшение достигается либо (i) путем добавления полифенола какао или его производного к пищевому продукту, который не содержит полифенола какао, либо (ii) когда пищевой продукт традиционно содержит полифенолы какао, такой как, например, шоколад, то улучшение достигается путем увеличения уровня полифенола выше того уровня, который находится в пищевом продукте, приготовленном традиционным образом. Указанное увеличение уровня полифенола может быть достигнуто путем добавления дополнительных полифенолов какао, например, в виде экстракт