Ячмень с измененной активностью ветвящего фермента и крахмал и крахмалсодержащие продукты с повышенным содержанием амилозы

Ячмень с измененной активностью ветвящего фермента и крахмал и крахмалсодержащие продукты с повышенным содержанием амилозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к растению ячменя с пониженной активностью ветвящего крахмал фермента (SBE, starch branching enzyme), IIa (SBEIIa) в эндосперме, приводящей к повышению относительного содержания амилозы в зерновом крахмале. Изобретение также относится к зерну и к крахмалу, а также к пищевым и непищевым продуктам, полученным из них.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

У зерновых культур крахмал составляет примерно до 45-65% массы зрелого зерна. Крахмал состоит из двух типов молекул, амилозы и амилопектина. Амилоза представляет собой по существу линейную молекулу, состоящую из α-1,4-сшитых гликозидных цепей, тогда как амилопектин является высокоразветвленной молекулой с α-1,6-гликозидными связями, сшивающими линейные цепи.

Синтез крахмала в эндосперме высших растений осуществляется группой ферментов, катализирующих четыре ключевые стадии. Во-первых, АДФ-глюкозофосфорилаза активирует мономерный предшественник крахмала посредством синтеза АДФ-глюкозы из G-1-P (глюкозо-1-фосфата) и АТФ. Во-вторых, активированный донор гликозила, АДФ-глюкоза, переносится синтазами крахмала к не восстанавливающему концу уже существующей связи α-1-4. В-третьих, ферменты, ветвящие крахмал, вводят точки ветвления посредством расщепления района α-1,4-сшитого глюкана с последующим переносом расщепленной цепи на акцепторную цепь с образованием новой α-1,6-связи. Ферменты, ветвящие крахмал, являются единственными ферментами, которые могут вводить α-1,6-сшивки в α-полиглюканы и, следовательно, играют существенную роль в образовании амилопектина. Наконец, ферменты, удаляющие разветвление крахмала, удаляют некоторые разветвляющие связи, хотя механизм, посредством которого они действуют, не выяснен (Myers et al., 2000).

Хотя ясно, что по меньшей мере эти четыре активности необходимы для нормального синтеза крахмальной гранулы у высших растений, в эндосперме высших растений обнаружены множественные изоформы каждой из этих четырех активностей, и для индивидуальных изоформ предложены конкретные роли на основании мутационного анализа (Wang et al., 1998, Buleon et al., 1998) или посредством модификации уровней экспрессии гена с использованием трансгенных подходов (Abel et al., 1996, Jobling et al., 1999, Scwall et al., 2000). Однако точный вклад каждой изоформы каждой активности в биосинтез крахмала до сих пор неизвестен, и не известно, имеются ли существенные различия в этих вкладах между видами. В эндосперме зерновых присутствует две формы АДФ-глюкозофосфорилазы, одна форма внутри амилопласта и одна форма в цитоплазме (Denyer et al., 1996, Thorbjomsen et al., 1996). Каждая форма состоит из двух типов субъединиц. Морщинистый (sh2) и ломкий (bt2) мутанты у кукурузы представляют собой повреждения в большой и малой субъединицах соответственно (Girouz and Hannah, 1994). В эндосперме зерновых обнаружено четыре класса синтазы крахмала, одна изоформа, которая локализована исключительно внутри крахмальной гранулы, гранулосвязанная синтаза крахмала (GBSS), две формы, которые распределены между гранулой и растворимой фракцией (SSI, Li et al., 1999a, SSII, Li et al., 1999b), и четвертая форма, которая полностью локализована в растворимой фракции (SSIII, Сао et al., 2000, Li et al., 1999b, Li et al., 2000). Показано, что GBSS является существенной для синтеза амилозы (Shure et al., 1983), и показано, что мутации в SSII и SSIII изменяют структуру амилопектина (Gao et al., 1998, Craig et al., 1998). Мутации, определяющие роль активности SSI, не описаны.

В эндосперме зерновых экспрессируется три формы ветвящего фермента: ветвящий фермент I (SBEI), ветвящий фермент IIa (SBEIIa) и ветвящий фермент IIb (SBEIIb) (Hedman and Boyer, 1982, Boyerand Preiss, 1978, Mizuno et al., 1992, Sun et al., 1997). Показано, что у кукурузы и риса высокоамилозные фенотипы являются результатом повреждений в гене SBEIIb, также известном как ген amylose extender (ae) (Boyer and Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993, Nishi et al., 2001). У этих мутантов по SBEIIb крахмальные гранулы эндосперма проявляли аномальную морфологию, содержание амилозы было в значительной степени повышено, частота разветвлений остаточного амилопектина была снижена, и доля коротких цепей (<DP17, особенно DP8-12) была низкой. Кроме того, температура клейстеризации крахмала была повышена. В дополнение к этому присутствовал значительный объем вещества, которое определили как «промежуточное» между амилозой и амилопектином (Boyer et al., 1980, Takeda et al., 1993b). Напротив, мутанты растений кукурузы по гену SBEIIa вследствие мутаторного (Mu) инсерционного элемента и, следовательно, с недостаточной экспрессией белка SBEIIa были неотличимы от растений дикого типа по разветвлению крахмала эндосперма (Blauth et al., 2001), хотя у них был изменен крахмал листьев. Подобным образом растения риса с дефицитом активности SBEIIa не проявляли значительного изменения профиля цепей амилопектина в эндосперме (Nakamura, 2002).

У кукурузы мутация dull1 вызывает пониженное содержание крахмала и повышенные уровни амилозы в эндосперме со степенью изменения в зависимости от генетического фона, а также повышенную степень разветвления остаточного амилопектина (Shannon and Garwood, 1984). Ген, соответствующий этой мутации, был идентифицирован и выделен путем стратегии мечения транспозоном с использованием транспозона-мутатора (Mu), и показано, что он кодирует фермент, обозначенный как синтаза крахмала II (SSII) (Gao et al., 1998). В настоящее время этот фермент признают членом семейства SSIII у зерновых. Мутантный эндосперм имеет пониженные уровни активности SBEIIa, ассоциированные с мутацией dull1. У других зерновых соответствующая мутация не описана. Неизвестно, имеют ли отношение эти открытия к другим зерновым, например к ячменю.

В WO 94/09144 предложено использование смысловых и антисмысловых генов для изменения природных соотношений синтазы крахмала (SS) и SBE у кукурузы. Однако не представлены данные, подтверждающие предложенные молекулярные стратегии, и отсутствует предложение по специфичному снижению активности SBEIIa.

У картофеля негативная регуляция одного SBEI оказывает минимальные воздействия на структуру крахмала (Filpse et al., 1996), хотя в следующей работе идентифицированы качественные изменения (Safford et al., 1998).

Однако у картофеля негативная регуляция SBEI и SBEII в сочетании повышала относительное содержание амилозы значительно больше, чем негативная регуляция одного SBEII (Schwall et al., 2000).

У высших растений присутствует два типа ферментов, удаляющих разветвление, и они определены на основании их субстратной специфичности как ферменты, удаляющие разветвление, типа изоамилазы, и ферменты, удаляющие разветвление, типа пуллуланазы (Myers et al., 2000). Мутации Sugary-1 у кукурузы и риса ассоциированы с недостаточностью обоих ферментов, удаляющих разветвление (James et al., 1995, Kubo et al., 1999), однако причинная мутация картируется в той же локализации, что и ген фермента, удаляющего разветвление, типа изоамилазы. У мутанта sta-7 Chlamydomonas (Mouille, 1996), аналога мутации sugary-1 кукурузы, негативно регулируется только изоамилазная активность. Гены биосинтеза крахмала, которые клонированы из зерновых, перечислены в таблице 1.

Крахмал широко используют в пищевой, бумажной и химической промышленности. Физическая структура крахмала может оказывать существенное влияние на питательные и технологические свойства крахмала для пищевых или непищевых промышленных продуктов. В качестве показателя структуры крахмала можно рассматривать несколько характеристик, включая распределение цепей амилопектина по длине, степень кристалличности и наличие форм кристалличности, таких как V-комплексная форма кристалличности крахмала. Длина цепи амилопектина может быть показателем измененной кристалличности и измененной клейстеризации, и также считают, что она коррелирует с пониженной ретроградацией амилопектина. Кроме того, считают, что измененное распределение цепей амилопектина по длине отражает органолептические свойства пищевых продуктов, в которые этот крахмал включен в значительных количествах. Пониженная кристалличность крахмала может также быть показателем пониженной температуры клейстеризации крахмала, и считают, что она связана с улучшенными органолептическими свойствами.

Относительно высокая температура клейстеризации большинства высокоамилозных крахмалов является недостатком для некоторых пищевых применений. Температура клейстеризации отражает энергию измельчения, необходимую для обработки таких пищевых продуктов. Для обработки зерна или муки для производства пищевых продуктов из таких зерен или крахмалов обычно необходимы более высокие температуры. Поэтому продукты, содержащие высокоамилозные крахмалы, являются, как правило, более дорогостоящими. Кроме того, для приготовления этих произведенных пищевых продуктов или для приготовления пищи из муки, содержащей высокоамилозные крахмалы, потребителю может понадобиться затратить больше времени и использовать более высокие температуры. Высокоамилозные крахмалы, имеющие пониженные или нормальные температуры клейстеризации, имели бы преимущество во многих пищевых применениях.

Состав крахмала, в частности, в форме, называемой устойчивым крахмалом, весьма важен для здоровья кишечника, в частности для здоровья толстого кишечника. Соответственно, у некоторых хлебных злаков, таких как кукуруза, разработаны высокоамилозные крахмалы для использования в пищевых продуктах как средства, способствующие здоровью кишечника. Благоприятные эффекты устойчивого крахмала являются результатом обеспечения питания толстого кишечника, где кишечная микрофлора получает источник энергии, который подвергается ферментации с образованием среди прочего жирных кислот с короткой цепью. Эти жирные кислоты с короткой цепью обеспечивают питательные вещества для колоноцитов, усиливают захват некоторых питательных веществ через толстый кишечник и способствуют физиологической активности ободочной кишки. Как правило, если не обеспечивать устойчивые крахмалы или другое диетическое волокно, ободочная кишка относительно неактивна в метаболизме.

Другим питательным компонентом хлебных злаков и, в частности, ячменя является β-глюкан. β-Глюкан состоит из глюкозных единиц, связанных β (1-4) и/или β (1-3) гликозидными сшивками, и не разрушается человеческими пищеварительными ферментами, что делает его пригодным в качестве источника диетического волокна. β-Глюканы могут частично подвергаться ферментативному гидролизу эндогенными бактериями ободочной кишки, в процессе ферментации которых образуются жирные кислоты с короткой цепью (преимущественно ацетат, пропионат и бутират), которые полезны для клеток слизистой оболочки, выстилающих тонкий кишечник и ободочную кишку (Sakata and Engelhard, 1983). Поглощение β-глюкана также обладает эффектом повышения выделения желчных кислот, приводящим к снижению суммарного сывороточного холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), что уменьшает риск ишемической болезни сердца. Подобным образом β-глюкан действуют посредством ослабления сдвигов концентрации глюкозы в крови после приема пищи. Считают, что эти эффекты могут быть также основаны на повышении вязкости содержимого желудка и тонкого кишечника.

Хотя модифицированные крахмалы или β-глюканы, например, можно использовать в пищевых продуктах, которые обеспечивают функционирование, в норме не обеспечиваемое немодифицированными источниками, такая обработка имеет тенденцию либо изменять другие важные компоненты, либо является нежелательной вследствие процессов, вовлеченных в модификацию. Следовательно, предпочтительно обеспечить источники составных частей, которые можно использовать в пищевых продуктах в немодифицированной форме.

Ячмень (Hordeum vulgare) является четвертой из наиболее широко распространенных зерновых культур, культивируемой во всем мире и относительно недостаточно используемой в плане потребления человеком, кроме использования в производстве алкогольного пива. В среднем зерно ячменя содержит примерно 64% крахмала, 11% белка и 5% β-глюкана (обычно 3-6%). Остальные 20% включают влагу, волокно и другие минорные компоненты.

Известные вариации в структуре крахмала ячменя ограничены относительно вариаций, доступных у кукурузы. Мутанты по SBEIIb, соответствующие фенотипам amylose extender у кукурузы или риса, у ячменя не охарактеризованы. Фенотип, придаваемый мутациями SBEIIa или SBEIIb, у ячменя неизвестен. Наиболее хорошо охарактеризованными мутациями являются мутация waxy и высокоамилозная мутация, идентифицированная как АС38. High Amylose Glacier (AC38) имеет относительно умеренное повышение содержания амилозы до максимума примерно 45% от суммарного крахмала. Двойные мутанты с фенотипом waxy также сконструированы и охарактеризованы (Schondelmaier et al., 1992; Fujita et al., 1999).

Идентифицированы другие мутанты ячменя, имеющие высокое содержание амилозы в крахмале. Химически индуцированные мутанты по гену SSIIa имели более высокие уровни амилозы в зерновом крахмале, примерно до 65-70% (WO 02/37955 А1). Мутанты М292 и М342 также показали существенно сниженную среднюю массу зерна как следствие пониженного синтеза крахмала от средней массы примерно 51 мг для родительской линии Himalaya до 32 и 35 мг для М292 и М342 соответственно. Хотя эти мутанты сохранили длину и толщину зерна дикого типа, они были выровнены от 2,8 мм средней толщины для Himalaya до 1,6-1,8 мм и имели центральную по существу незаполненную область, что привело в результате к худшим характеристикам измельчения. Обнаружено, что отношение длины зерна (L) к толщине (Т) является полезным диагностическим параметром для мутантных аллелей, причем мутантные семена и семена дикого типа имеют отношение LT более 3,5 и менее 3,5 соответственно. Содержание крахмала мутантных линий было снижено от 49,0% для Himalaya до 17,7 и 21,9% для М292 и М342 соответственно. Было показано, что хотя имело место снижение содержания амилозы на зерно от 6,2 мг на зерновку до 4,0 и 4,8 мг у М292 и М342 соответственно, но при этом имело место резкое снижение содержания амилопектина на зерновку от 18,7 у Himalaya до 1,6 и 2,9 мг у мутантов. Это показывает, что относительно высокий уровень амилозы был результатом сниженного продуцирования амилопектина. Уровни зернового β-глюкана были повышены у мутантов более чем до 10%. Крахмал проявлял пониженные температуры клейстеризации. Мутанты SBEIIa имели измененное распределение активностей SBEIIa и SBEIIb между крахмальной гранулой и растворимыми фракциями эндосперма, однако они были по существу не изменены по уровню активностей в эндосперме в целом (WO 02/37955; Morell et al., 2003).

Хотя крахмалы с повышенным содержанием амилозы этих типов полезны, крахмал ячменя с более высоким содержанием амилозы предпочтителен, в частности, если это связано с улучшенным синтезом крахмала и другими характеристиками, например меньшей необходимостью в модификации после сбора. Такие крахмальные продукты также относительно устойчивы к перевариванию и приносят большую пользу здоровью.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что изобретение, описанное здесь, является предметом вариаций и модификаций, иных, чем описанные конкретно. Должно быть понятно, что изобретение, описанное здесь, включает все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все такие стадии, признаки, композиции и соединения, относящиеся к данному описанию или указанные в нем, индивидуально или в совокупности, а также все и любые комбинации любых двух или более чем двух указанных стадий или признаков.

На протяжении всего описания, если в контексте не требуется иное, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», следует понимать как подразумевающее включение определенного целого или стадии либо группы неких целых или стадий, но не исключение любого другого целого или стадии либо любой другой группы целых или стадий. Настоящее изобретение не следует ограничивать в объеме конкретными воплощениями, описанными здесь, которые предназначены только в целях приведения примеров. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы явно находятся в пределах объема изобретения, как описано здесь.

Библиографические детали публикаций, на которые ссылается автор в данном описании, представлены в конце описания. Ссылки, упомянутые здесь, включены здесь путем ссылки в их полных объемах. Сделанные здесь ссылки на уровень техники, включая любой один или более чем один документ уровня техники, не следует понимать как подтверждение или предположение, что указанный уровень техники является общеизвестным в Австралии или образует часть общеизвестного в Австралии.

Как его используют здесь, термин «получен (происходит) от» следует понимать как указание на то, что конкретное целое или группа целых имеют происхождение от указанных видов, но они не обязательно были получены непосредственно из указанного источника.

Обозначение нуклеотидных остатков, относящееся сюда, является таким, как рекомендовано Биохимической Номенклатурной Комиссией IUPAC-IUB, где А представляет собой аденин, С представляет собой цитозин, G представляет собой гуанин, Т представляет собой тимидин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения касается зерна, полученного от растения ячменя, которое имеет пониженный уровень активности фермента SBEIIa в эндосперме, причем крахмал указанного зерна имеет относительное содержание амилозы по меньшей мере 40% (мас./мас.). Относительное содержание амилозы может предпочтительно быть выше, чем 50% или 75%, и предпочтительно зерно является неморщинистым.

Второй аспект изобретения касается зерна ячменя, содержащего крахмал, имеющий относительное содержание амилозы по меньшей мере 75% (мас./мас.).

В третьем аспекте изобретение относится к муке или муке из цельного зерна, полученной из зерна первого или второго аспектов изобретения, или к пищевым продуктам, включающим такую муку или муку из цельного зерна.

В четвертом аспекте изобретение относится к крахмалу, полученному из зерна растения ячменя, которое имеет пониженный уровень активности фермента SBEIIa в эндосперме, причем указанный крахмал является немодифицированным и имеет относительное содержание амилозы по меньшей мере 40% (мас./мас.). В конкретной форме четвертого аспекта растение ячменя дополнительно имеет пониженный уровень активности фермента SBEIIb в эндосперме.

В пятом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей крахмал согласно четвертому аспекту изобретения и другой пищевой ингредиент или воду.

В шестом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей крахмальные гранулы эндосперма ячменя и другой пищевой ингредиент или воду, где крахмал этих крахмальных гранул содержит по меньшей мере 75% (мас./мас.) амилозы.

В седьмом аспекте изобретение относится к растению ячменя, имеющему пониженный уровень активности фермента SBEIIa, где крахмал в зерне этого растения ячменя имеет относительное содержание амилозы по меньшей мере 40% (мас./мас.) или предпочтительно по меньшей мере 50% или по меньшей мере 75%.

В восьмом аспекте изобретение относится к способу получения растения ячменя с пониженным уровнем активности фермента SBEIIa в эндосперме, причем крахмал зерна этого растения ячменя имеет содержание амилозы по меньшей мере 40% (мас./мас.), включающему стадии (а) введения генетической вариации в родительское растение ячменя и (б) идентификации растений или семян-потомков этого родительского растения ячменя, которые имеют пониженную активность SBEIIa.

В девятом аспекте изобретение относится к способу получения растения ячменя, имеющего пониженную активность ферментативных активностей как SBEIIa, так и SBEIIb в эндосперме, включающему: (а) мутагенез семян от растения, имеющего пониженную активность ферментативной активности SBEIIa; или (б) мутагенез семян от растения, имеющего пониженную активность ферментативной активности SBEIIb; или (в) скрещивание растения, имеющего пониженную активность фермента SBEIIa, с растением, имеющим пониженную активность фермента SBEIIb; и идентификацию растения ячменя, имеющего пониженную активность и SBEIIa, и SBEIIb.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1. Нуклеотидная последовательность кДНК SBEIIa ячменя (SEQ ID No. 1).

Фиг.2. Нуклеотидная последовательность кДНК SBEIIb ячменя (SEQ ID No. 2).

Фиг.3. Последовательность гена разветвляющего крахмал фермента IIa (SEQID No. 3) (wSBEII-D1) из A. tauschii, соответствующего гену SBEIIa генома D гексаплоидной пшеницы (Т. aestivum).

Фиг.4. Частичная последовательность гена SBEIIb пшеницы (SEQ ID No. 4) (wbe2b геномный).

Фиг.5. Схематические конструкции дуплекс-РНК. А. Использованный порядок элементов гена: промотор, последовательность гена SBEIIa или SBEIIb (экзоны 1, 2 и 3) в смысловой ориентации, интрон (интрон 3), последовательность гена SBEIIa или SBEIIb (экзоны 1, 2, 3 и 4) в антисмысловой ориентации и последовательность терминатора транскрипции/полиаденилирования. Б. Транскрипт генов ds-SBEIIa и ds-SBEIIb образует «шпилечную» структуру РНК с двунитевым районом, образованным в результате гибридизации между смысловой и антисмысловой последовательностями. Интронная последовательность, ограниченная нуклеотидами G и AG, подвергнута сплайсингу.

Фиг.6. ПЦР анализ линий ячменя, трансгенных по ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. Для идентификации положительных трансгенных линий использовали пары праймеров BX17F/AR2bkpnR для SBEIIb и BX17F/AR2akpnR для SBEIIa, которые амплифицируют первый и второй фрагменты соответствующих конструкций, которые включают экзоны 1, 2, 3 и интрон 3 (смысловая ориентация). GP означает нетрансформированный Golden Promise. Центральная дорожка показывает маркеры молекулярного размера.

Фиг.7. Саузерн-блот-анализ линий ячменя, трансгенных по ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. А. Положительные трансгены ячменя ds-SBEIIa, как показано с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Ожидаемый размер полосы составляет 1836 п.о. Б. Положительные трансгены ячменя ds-SBEIIb, как показано способом Саузерна. Ожидаемый размер полосы - 1907 п.о. GP означает Golden Promise (отрицательный контроль).

Фиг.8. Вестерн-блот-анализ линий ячменя, трансгенных по ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. Десять семян Т1 (семена от растений ТО) линий IIb 4.3 и IIb 4.4 анализировали на экспрессию SBEIIb с помощью Вестерн-блот-анализа, используя электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях и специфичное антитело к SBEIIb. Дорожка 1 (+) представляет собой положительный контроль, сорт Glacier.

Фиг.9. Вестерн-блот-анализ линий ячменя, трансгенных по ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. Десять семян Т1 (семена от растений Т0) линии IIa 4.1 анализировали на экспрессию A. SBEIIa или Б. SBEIIb с помощью Вестерн-блот-анализа, используя электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях и специфичные антитела к SBEIIa или к SBEIIb. Дорожки на обоих гелях представляют одни и те же семена. Дорожка 1 (+) на каждой панели представляет собой положительный контроль, сорт Glacier.

Фиг.10. Вестерн-блот-анализ трансгенных линий ячменя ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. Десять семян Т1 (семена от растений ТО) линии IIb 4.1 анализировали на экспрессию А. SBEIIb или Б. SBEIIa с помощью Вестерн-блот-анализа, используя электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях и специфичные антитела к SBEIIb или к SBEIIa. Дорожки на обоих гелях представляют одни и те же семена. Дорожка 1 (+) на каждой панели представляет собой положительный контроль, сорт Glacier.

Фиг.11. Морфология крахмальных гранул трансгенного ячменя ds-SBEIIa. Крахмальные гранулы из отдельных семян визуализировали посредством световой микроскопии из обоих трансгенных семян, ds-SBEIIa и ds-SBEIIb. Фиг.11А, семя с экспрессией SBEIIa дикого типа (дорожка IIa 4.2.3). Фиг.11Б, семя с отсутствием экспрессии SBEIIa (дорожка IIa 4.2.5). Наблюдали значительные морфологические изменения в крахмале из семян с отсутствием SBEIIa, но не SBEIIb.

Фиг.12. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) крахмальных гранул. А. крахмальные гранулы дикого типа (дорожка IIa 4.2.3), Б. и В. - из трансгенного эндосперма ds-SBEIIa (дорожка IIa 4.2.5). Крахмальные гранулы из семени ds-SBEIIb (SBEIIb инактивирован) не кажутся морфологически измененными по сравнению с диким типом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изменение SBEIIa у ячменя

Изобретение основано на открытии того, что снижение активности SBEIIa в эндосперме ячменя приводит в результате к модифицированному продуцированию крахмала, в частности к высокой аккумуляции амилозы в зерне ячменя. Этот неожиданный результат противоречит открытиям у кукурузы и риса, где мутация в SBEIIa не изменяет профиль амилопектина (Blauth et al., 2001, Nakamura, 2000). Предпочтительно существует изменение в одной или более чем одной дополнительной ферментативной активности биосинтеза крахмала, и более предпочтительно снижение как в SBEIIb, так и в SBEIIa. Также предпочтительно зерно этого растения ячменя является неморщинистым.

Способ получения растения ячменя

В одном аспекте в изобретении предложен способ снижения активности ветвящего крахмал фермента IIa (SBEIIa) в эндосперме ячменя. Снижение активности может быть по меньшей мере на 40% или, возможно, предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с уровнем активности в эндосперме немодифицированного (контрольного) ячменя, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, и даже более предпочтительно по меньшей мере на 90% или 95%. Этот способ может включать изменение экспрессии гена SBEIIa ячменя либо он может включать мутацию гена SBEIIa ячменя, где активность SBEIIa в эндосперме понижена.

Этот способ может включать стадию определения активности SBEIIa в эндосперме ячменя предпочтительно путем измерения уровня белка, например путем иммунологического обнаружения, или уровня его соответствующей мРНК способами, хорошо известными в данной области техники, такими как блот-гибридизационный анализ по Норзерну или полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Этот способ может дополнительно включать стадию отбора или скрининга на растение ячменя или зерно, имеющее пониженную активность SBEIIa в его эндосперме. Стадия отбора может быть основана на пониженном уровне активности SBEIIa или белка, либо она может быть основана на фенотипе зерна растения ячменя, таком как повышенное содержание амилозы или пониженное содержание амилопектина, либо на визуальном фенотипе, например морщинистом зерне.

Активность SBE можно измерить с помощью ферментативного анализа, например с помощью анализа фосфорилазной стимуляции (Boyer and Preiss, 1978). Этот анализ измеряет стимуляцию посредством SBE включения глюкозо-1-фосфата в нерастворимый в метаноле полимер (α-D-глюкан) фосфорилазой а. Активность SBE можно измерить с помощью анализа йодного окрашивания, который измеряет снижение поглощения комплекса глюкан-полийод, образующегося в результате разветвления глюкановых полимеров. Активность SBE можно также оценивать с помощью анализа связи разветвлений, который измеряет образование восстанавливающих концов из восстановленной амилозы в качестве субстрата после ферментативного гидролиза изоамилазой (Takeda et al., 1993a). Предпочтительно активность измеряют в отсутствие активности SBEI или SBEIIb. Изоформы SBE показывают различные субстратные специфичности, например SBEI проявляет более высокую активность в разветвлении амилозы, тогда как SBEIIa и SBEIIb показывает более высокие скорости разветвления с амилопектиновым субстратом. Эти изоформы можно также различить на основании длины глюкановой цепи, которая переносится.

В следующем аспекте в изобретении предложен способ снижения активности множественных ферментативных активностей биосинтеза крахмала в эндосперме ячменя, где одной из активностей является SBEIIa. Предпочтительно понижены активности как SBEIIa, так и SBEIIb, и даже более предпочтительно активность SBEI также понижена. Другими ферментативными активностями биосинтеза крахмала, которые могут быть понижены в комбинации с SBEIIa, являются: SSI, SSII, SSIII. Также могут быть изменены ферменты, удаляющие разветвление крахмала, например, активность изоамилазы или пуллуланазы. В следующем воплощении активности ферментативных активностей биосинтеза крахмала могут быть изменены у растения в тканях, иных, чем эндосперм, например активность SBEI или SBEII может быть повышена в листьях для компенсации некоторой потери активности, вызванной трансгеном, кодирующим SBEIIa-ингибиторную молекулу, предназначенным, прежде всего, для экспрессии в эндосперме. Альтернативно синтез крахмала может быть дополнительно улучшен путем сверхэкспрессии одного или более чем одного фермента биосинтеза крахмала в комбинации с понижением SBEIIa. Гены, кодирующие такие ферменты, могут происходить из любых источников, например из бактериальных или других источников, иных, нежели ячмень, и они могут быть модифицированы в направлении изменения каталитических свойств, например изменения температурной зависимости ферментов (WO 94/09144).

В следующем аспекте в изобретении предложен способ повышения уровня амилозы (в виде процента от крахмала) в зерне ячменя, включающий стадию понижения активности SBEIIa в эндосперме ячменя. Содержание амилозы предпочтительно составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60% и даже более предпочтительно - по меньшей мере 65, 75% или 70%. В следующих предпочтительных воплощениях изобретения этот способ, пример которого приведен здесь, обеспечивает содержание амилозы по меньшей мере 80% или 90%.

Высокоамилозный фенотип может быть достигнут с помощью частичного или полного прерывания экспрессии гена SBEIIa или генов SBEIIa и SBEIIb. Степень, в которой этот ген ингибирован, будет в некоторой степени определять характеристики крахмала, полученного из зерна ячменя. Любая из ряда методик гель-электрофореза, проводимого на белках, экстрагированных из модифицированного эндосперма ячменя, выявит природу и степень модификации в отношении активности SBEIIa и/или SBEIIb. Модификация может проявляться как понижение активности SBEIIa и/или SBEIIb, полное прекращение ферментативной активности или изменение в распределении SBEIIb или других ферментов внутри эндосперма. Для проведения этих тестов крахмал можно экстрагировать из эндосперма ячменя и анализировать белки, например, как описано в Rahman et al., 1995. Методики, хорошо известные в данной области техники, такие как ДСН-ПААГ электрофорез (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и иммуноблоттинг, проводят на растворимой фракции и фракции крахмальных гранул и идентифицируют растения ячменя, где произошли модификации в отношении ферментов SBEIIa и/или SBEIIb.

Растения ячменя

В следующем аспекте в изобретении предложено растение ячменя (Hordeum vulgare) с пониженным уровнем активности SBEIIa в эндосперме во время по меньшей мере некоторого развития зерна, причем это растение ячменя способно давать зерно, крахмал которого имеет высокое относительное содержание амилозы. Предпочтительно уровень SBEIIa понижен в эндосперме по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 75% и наиболее предпочтительно - по меньшей мере на 90% или на 95% по сравнению с диким типом. Термин «дикий тип» имеет свое обычное значение в области генетики и включает сорта или генотипы ячменя, которые не модифицированы так, как описано здесь.

В изобретении также предложены растения и зерно потомства, которые обладают желаемыми характеристиками родителей.

Изобретение также охватывает растения ячменя, которые имеют измененную активность SBEIIb или другие ферментативные активности биосинтеза крахмала в дополнение к пониженной активности SBEIIa. Растения, имеющие пониженные активности SBEIIa и SBEIIb, могут быть получены путем скрещивания растения, пониженного по SBEIIa, с растением, пониженным по SBEIIb, либо путем введения трансгена, кодирующего молекулу, которая ингибирует экспрессию генов как SBEIIa, так и SBEIIb. Изобретение также охватывает мутацию(и) в других генетических фонах. Исходные измененные (мутантные) растения можно скрещивать с растениями, содержащими более желательный генетический фон. После исходного скрещивания можно провести подходящее число обратных скрещиваний для удаления менее желательного генетического фона. Желаемый генетический фон может включать подходящую комбинацию генов, обеспечивающих коммерческий выход и другие характеристики, такие как агротехника, устойчивость к абиотическому стрессу или зерно без пленки. Этот генетический фон может также включать другие измененные гены биосинтеза или модификации крахмала, например фенотип amylose extender или мутацию amo1 в ячмене High Amylose Glacier (ген неизвестен), мутацию waxy (обнаруженную, например, в сорте Waxiro), мутантный ген в высокоамилозном сорте МК6827 (доступен от USDA ARS National Small Grain Germplasm Research Facility Aberdeen, Idaho 831290 USA) или в высокоамилозных разновидностях М292 и М342 (мутация в гене SSIIa), либо гены-модификаторы. Кроме того, желательным может быть объединение других двойных и тройных мутаций с комбинациями вышеуказанных линий и в скрещиваниях с другими линиями ячменя, которые имеют морщинистый эндосперм, где причинный ген неизвестен.

Зерно

В изобретении также предложено зерно ячменя, содержащее крахмал, измененный по сравнению с диким типом. Этот измененный крахмал по меньшей мере частично является следствием пониженной активности SBEIIa во время развития эндосперма зерна ячменя. Это зерно содержит повышенные уровни амилозы в виде процента от суммарного крахмала и пониженное содержание амилопектина по сравнению с диким типом, который имеет примерно 25% амилозы и 75% амилопектина. Предпочтительно обе активности, SBEIIa и SBEIIb, понижены во время развития эндосперма. Еще более предпочтительно активность SBEI также понижена. Уровни амилозы, измеренные способами, хорошо известными в данной области техники, предпочтительно составляют по меньшей мере 50% от суммарного крахмала, более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно - по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80% или 90%. О повышенных уровнях амилозы может свидетельствовать аномальная морфология крахмальной гранулы, или потеря двойного лучепреломления гранул при наблюдении в световой микроскоп, или другими способами. Предпочтительно уровень амилозы измеряют йодометрическим способом, который может представлять собой спектрофотометрический способ (например, Morrison and Laignelet, 1983) или высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ, например, Batey and Curtin, 1996).

Зерно растения ячменя может иметь повышенный уровень β-глюкана, который может быть связан с повышенным притоком углерода в синтез этого полимера, а не в синтез амилопектина. Альтернативно это зерно может иметь нормальные уровни β-глюкана, например в диапазоне 3,0-6,0% от массы зрелого зерна. Более предпочтительно зерно содержит как повышенные уровни амилозы, так и нормальные уровни β-глюкана. Такая комбинация является неожиданной, основанной на составе крахмала в зерне из ячменя, мутантного по SSIIa (WO 02/37955). Зерно может содержать крахмал, который имеет измененные температуры клейстеризации и/или измененные характеристики набухания во время и после клейстеризации. Это зерно также предпочтительно имеет неморщинистый фенотип.

В изобретении также предложена мука или мука простого помола, полученная из этого зерна. Она может быть необработанной или обработанной, например, путем фракционирования или отбеливания. В изобретении далее предложено зерно ячменя, пригодное для производства пищевых продуктов, полученное от растения ячменя, имеющего измененный уровень активности SBEIIa в эндосперме, причем крахмал указанного зерна имеет высокое содержание амилозы и пониженное содержание амилопектина. Кроме того, изобретение охватывает зерно, которое было обработано иными путями, так что это зерно может быть молотым, размельченным, обрушенным, плющеным или дробленым.

Крахмал

В другом аспекте в изобретении предложен крахмал, полученный из зерна растения ячменя, как описано выше, имеющего пониженный уровень активности SBEIIa в эндосперме, причем этот крахмал имеет повышенное содержание амилозы и пониженное содержание амилопектина. Предпочтительно понижены активности как SBEIIa, так и SBEIIb, и более предпочтительно активность SBEI также понижена. В другом аспекте в изобретении предложен крахмал, полученный из зерна растения ячменя, содержащий по меньшей мере 50% амилозы, предпочтительно по меньшей мере 60% амилозы и еще более предпочтительно - по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80% или 90% амилозы. Очищенный крахмал может быть получен из зерна способом размалывания, например способом влажного размалывания, который включает отделение крахмала от белка, жира и волокна. Исходным продуктом процесса размалывания является смесь или композиция крахмальных гранул, и изобретение, таким образом, охватывает такие гранулы. Крахмал этих гранул содержит по меньшей мере 50% амилозы, предпочтительно 70%, 75% или 80% амилоз