Производные 4-амино-5-фенил-7- циклобутилпирроло[2,3-d]пиримидина

Производные 4-амино-5-фенил-7- циклобутилпирроло[2,3-d]пиримидина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новым 4-амино-5-фенил-7-циклобутилпирроло[2,3-d]пиримидиновым производным, способам их получения, к их применению в процессе лечения организма человека или животного, их применению - самостоятельно или в сочетании с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями - для лечения заболевания, в частности пролиферативного заболевания, такого как опухоль, к способу лечения таких болезней у млекопитающих, в частности у людей, и к применению такого соединения - самостоятельно или в сочетании с одним или несколькими другими фармацевтически действующими соединениями - при приготовлении фармацевтической композиции (лекарственного средства) для лечения, в частности, пролиферативного заболевания, такого как опухоль.

В заявке WO 98/41525, опубликованной 24 сентября 1998 г., описаны замещенные 4-амино-7Н-пирроло[2,3-d]пиримидины, обладающие терапевтическим действием как ингибиторы протеин-тирозин-киназы.

Было установлено, что соединения формулы I, описанные ниже, являются сильнодействующими ингибиторами активности тирозинкиназы рецептора инсулинподобного фактора роста I (IGF-IR) и ингибируют IGF-IR-зависимую пролиферацию клеток. Присутствие заместителей, предпочтительно бензилоксизаместителей, присоединенных в положении 3 фенильной группы 4-амино-5-фенил-7-циклобутилпирроло[2,3-d]пиримидина вместе с наличием заместителя R₂ имеет, как указано в настоящем описании ниже, решающее значение для проявления эффективности и/или специфичности соединений по настоящему изобретению в качестве IGF-IR ингибиторов тирозинкиназы и их способности и/или селективности ингибировать IGF-IR-зависимую пролиферацию клеток.

Соединения формулы I неожиданно создают, например, возможность нового терапевтического подхода, в частности в случаях болезней, при лечении которых, а также при профилактике которых ингибирование IGF-IR тирозинкиназы и/или IGF-IR-зависимой пролиферации клеток оказывает благотворное воздействие. Такие заболевания включают пролиферативные заболевания, такие как опухоли, например опухоли груди, почек, предстательной железы, колоректальные, щитовидной железы, нейронные, легких, матки, желудочно-кишечные, а также остеогенную саркому и меланому.

Объектом изобретения являются соединения формулы I

в которой

n обозначает число от 0 до 4,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный низший алкил (здесь и далее обозначен как (низш.) алкил), или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный гидроксилом, незамещенной, моно- или дизамещенной аминогруппой или гетероциклическим радикалом;

радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу, гетероциклический радикал или свободный или этерифицированный гидроксил, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, a Z либо отсутствует, либо обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил; или радикал R₆-сульфониламино(низш.)алкил, в котором R₆ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу или фенил, необязательно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкокси или нитрогруппой, при условии, что R₂ не обозначает карбокси, (низш.)алкоксикарбонил или (низш.)алкил, замещенный гидроксилом, если n обозначает О, R₁ обозначает водородный атом, R₄ обозначает бензил, а Х обозначает -О-,

R₃ обозначает (низш.)алкил, гидрокси-, амино- или галоидзамещенный (низш.)алкил, гидроксил, цианогруппу, (низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алканоилокси, амино-, моно- или ди(низш.)алкиламино-, (низш.)алканоиламиногруппу, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил или атом галогена, где заместители R₃ могут быть выбраны независимо друг от друга, если n>1,

R₄ обозначает радикал R₇-CR₈(R₉)-, в котором R₇ обозначает циклобутил, циклопентил, циклогексил, фенил, фурил, пирролил, тиенил или пиридил, причем заместители R₇ необязательно замещены одним или несколькими радикалами, выбранными из (низш.)алкила и атомов галогена, каждый из R₈ и R₉ независимо друг от друга обозначает водородный атом, (низш.)алкил или атом галогена, а

Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-,

или их соли.

Использованные в настоящем описании выше и ниже общие понятия в предпочтительном варианте в контексте описания во всех случаях, если не указано иное, имеют следующие значения.

Когда упомянуты соединения формулы I, это означает, что при этом охватываются также таутомеры и N-оксиды соединений формулы I.

Когда при упоминании соединений, солей и т.п. использована форма множественного числа, подразумевается также одно соединение, соль или т.п.

Асимметрические углеродные атомы соединения формулы I, которые необязательно содержатся, могут находиться в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации. Заместители при двойной связи или в кольце, могут находиться в цис- (т.е. Z-) или транс- (т.е. Е-) форме. Таким образом, соединения могут находиться в виде смесей изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно в виде энантиомерно чистых диастерео изомеров.

Префиксом "низш." обозначен радикал, содержащий до и включительно максимум 7, преимущественно до и включительно максимум 4, углеродных атома, причем радикалы, о которых идет речь, являются либо неразветвленными, либо разветвленными с одной или несколькими боковыми группами.

Радикал (низш.)алкил представляет собой, например, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил или н-гептил.

Радикал (низш.)алкилен представляет собой, например, метилен (-СН₂-), этилен (-СН₂-СН₂-), пропилен (-СН₂-СН₂-СН₂-) или тетраметилен (-СН₂-СН₂-СН₂-СН₂-).

C₁-С₆алкил или С₁-С₅алкил представляет собой либо неразветвленный, либо разветвленный (с одной или несколькими боковыми группами) алкильный радикал, содержащий соответственно от 1 до 6 или от 1 до 5 углеродных атомов: к ним относятся метил, этил, н-пропил, 2-пропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил и т.п.

В радикале R₂, который представляет собой (низш.)алкил, замещенный незамещенной, моно- или дизамещенной аминогруппой или гетероциклическим радикалом, предпочтительным (низш.)алкилом является метил.

Предпочтительный (низш.)алкил R₅ представляет собой метил, изопропил или трет-бутил.

Предпочтительный амино(низш.)алкил Z представляет собой аминометил.

В радикале R₆-сульфониламино(низш.)алкил (низш.)алкил представляет собой метил.

Предпочтительный (низш.)алкил R₆ представляет собой метил, этил или изопропил.

Замещенный (низш.)алкил представляет собой (низш.)алкил, как он описан выше, у которого может содержаться один или несколько, предпочтительно один заместитель, такой как амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(низш.)алканоиламино-, N,N-ди(низш.)алканоиламиногруппа, гидроксил, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алканоилокси, циано-, нитрогруппа, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, амидиновая группа, гуанидино, уреидо, меркаптогруппа, (низш.)алкилтио, атом галогена и гетероциклический радикал.

Предпочтительный замещенный (низш.)алкил R₅ представляет собой (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси или, что наиболее предпочтительно, гетероциклическим радикалом.

Атом галогена представляет собой главным образом атом фтора, хлора, брома или иода, преимущественно атом фтора, хлора или брома.

Моно- или дизамещенная аминогруппа представляет собой аминогруппу, замещенную одним или двумя радикалами, выбранными независимо друг от друга из, например, незамещенного или замещенного (низш.)алкила; фенила или фенил(низш.)алкила, у которого фенильный радикал необязательно замещен, например, незамещенным или замещенным (низш.)алкилом, амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(низш.)алканоиламино-, N,N-ди(низш.)алканоиламиногруппой, гидроксилом, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алканоилом, (низш.)алканоилокси, циано-, нитрогруппой, карбокси, (низш.)алкоксикарбонилом, карбамоилом, амидиновой группой, гуанидино, уреидо, меркаптогруппой, (низш.)алкилтио или атомом галогена; адамантанила и гетероциклического радикала.

В радикале R₂, который представляет собой (низш.)алкил, замещенный моно- или дизамещенной аминогруппой, предпочтительная моно- или дизамещенная аминогруппа представляет собой соответственно N-(низш.)алкиламино- или N,N-ди(низш.)алкиламиногруппу.

Предпочтительная моно- или дизамещенная аминогруппа R₅ представляет собой соответственно N-(низш.)алкиламино- или N,N-ди(низш.)алкиламиногруппу, в которой (низш.)алкильный остаток необязательно замещен фенилом, (низш.)алкилфенилом, (низш.)алкоксифенилом, морфолинилом или N,N-ди(низш.)алкиламиногруппой.

Предпочтительная моно- или дизамещенная аминогруппа R₆ представляет собой N,N-ди(низш.)алкиламиногруппу.

Гетероциклический радикал содержит преимущественно до 20 углеродных атомов и в предпочтительном варианте представляет собой насыщенный или ненасыщенный моноциклический радикал, содержащий от 4 до 8 кольцевых членов и от 1 до 3 гетероатомов, которые в предпочтительном варианте выбраны из атомов азота, кислорода и серы, или би- или трициклический радикал, в котором, например, один или два бензольных радикала аннелированы (конденсированы) с упомянутым моноциклическим радикалом. Самый предпочтительный гетероциклический радикал содержит по меньшей мере один азотный кольцевой атом, благодаря чему присоединение гетероциклического радикала к радикалу молекулы формулы I осуществляется через азотный кольцевой атом. Этот гетероциклический радикал необязательно замещен одними или несколькими, предпочтительно одним или двумя, радикалами, такими как, например, незамещенный или замещенный (низш.)алкил, амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(низш.)алканоиламино-, N,N-ди(низш.)алканоиламиногруппа, гидроксил, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алканоилокси, циано-, нитрогруппа, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, амидиновая группа, гуанидино, уреидо, меркаптогруппа, (низш.)алкилтио, атом галогена, фенил или пиридил.

Наиболее предпочтительный гетероциклический радикал представляет собой азетидинил, пирролидинил, пиперидил, азепанил, пиперазинил, тетрагидропиранил, морфолинил или тиоморфолинил, причем упомянутые радикалы необязательно замещены одним или несколькими, предпочтительно одним или двумя радикалами, выбранными независимо друг от друга из группы, включающей (низш.)алкил, гидрокси(низш.)алкил, свободный или этерифицированный гидроксил, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, фенил и пиридил, и присоединение гетероциклического радикала к радикалу молекулы формулы I осуществляется через азотный кольцевой атом.

В радикале R₂, который представляет собой (низш.)алкил, замещенный гетероциклическим радикалом, предпочтительный гетероциклический радикал представляет собой азетидинил, пирролидинил, ди(низш.)алкилпирролидинил, аминокарбонилпирролидинил, пиперидил, гидроксипиперидил, аминокарбонилпиперидил, азепанил, (низш.)алкилпиперазинил, (низш.)алкоксикарбонилпиперазинил, фенилпиперазинил, пиридилпиперазинил, морфолинил, ди(низш.)алкилморфолинил или тиоморфолинил.

В радикале R₅, который представляет собой (низш.)алкил, замещенный гетероциклическим радикалом, предпочтительным гетероциклическим радикалом является пиперидил, (низш.)алкилпиперазинил или морфолинил.

Предпочтительный гетероциклический радикал R₅ представляет собой пирролидинил, пиперидил, (низш.)алкилпиперазинил или морфолинил.

Этерифицированный гидроксил представляет собой, например, алкокси, преимущественно (низш.)алкокси. (Низш.)алкильный остаток у (низш.) алкокси необязательно замещен одним или несколькими, предпочтительно одним радикалом, таким как, например, амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(низш.)алканоиламино-, N,N-ди(низш.)алканоиламиногруппа, гидроксил, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алканоилокси, циано-, нитрогруппа, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, амидиновая группа, гуанидино, уреидо, меркапто, (низш.)алкилтио, атом галогена или гетероциклический радикал.

Предпочтительный этерифицированный гидроксил R₅ представляет собой (низш.)алкокси, в котором (низш.)алкильный остаток необязательно замещен (низш.)алкокси, N,N-ди(низш.)алкиламино группой, (низш.)алкилпиперазинилом или морфолинилом.

n в предпочтительном варианте обозначает 0.

R₁ в предпочтительном варианте обозначает водородный атом, (низш.)алкил или атом галогена, наиболее предпочтительно водородный атом или (низш.)алкил.

R₄ в предпочтительном варианте обозначает бензил.

Х в предпочтительном варианте обозначает -О-.

Y в предпочтительном варианте обозначает атом кислорода.

Солями являются преимущественно фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I (или их N-оксиды).

Такие соли образуются, например, в виде кислотно-аддитивных солей, предпочтительно с органическими или неорганическими кислотами, из соединений формулы I (или их N-оксидов) с основным атомом азота, преимущественно фармацевтически приемлемые соли.

В присутствии отрицательно заряженных радикалов, таких как карбокси и сульфогруппа, соли могут также образовываться с основаниями, например соли металлов или аммония, такие как соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов или аммониевые соли аммиака или приемлемых органических аминов, таких как третичные моноамины.

В присутствии основной группы и кислотной группы в одной и той же молекуле соединение формулы I (или его N-оксид) может также образовывать внутренние соли.

В целях выделения или очистки возможно также применение фармацевтически неприемлемых солей, например пикратов или перхлоратов. Терапевтическое применение находят только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (если возникают благоприятные обстоятельства, в форме фармацевтических композиций с ними), вследствие чего они предпочтительны.

Принимая во внимание близкое родство между новыми соединениями в свободной форме и в форме их солей, включая те соли, которые можно использовать в качестве промежуточных продуктов, например при очистке или идентификации новых соединений, в настоящем описании выше и в дальнейшем любую ссылку на свободные соединения следует воспринимать также как ссылку на соответствующие соли как на приемлемые и целесообразные.

Соединения формулы I обладают, как изложено в настоящем описании выше и в дальнейшем, ценными фармакологическими свойствами.

В общем объектом изобретения является также применение соединения формулы I для ингибирования IGF-IR тирозинкиназы.

Эффективность соединений по изобретению в качестве ингибиторов активности IGF-IR тирозинкиназы может быть продемонстрирована с использованием клеточного теста "Capture ELISA". В ходе проведения этого испытания определяют активность соединений по изобретению по отношению к инсулинподобному фактору роста I (IGF-I), индуцирующему аутофосфорилирование IGF-IR. Испытания проводили следующим образом: в опыте использовали фибробласты мыши линии NIH-3T3, трансфектированные IGF-IR c-DNA человека (полноразмерная IGF-IR c-DNA человека: GenBank Acc. № NM 000875), полученные так, как описано в работе Kato и др., J.Biol.Chem. 268. 2655-61, 1993. Клетки с суперэкспрессией IGF-IR человека культивировали в минимально незаменимой среде Дульбекко (DMEM), содержавшей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). В эксперименте в 96-луночный планшет (фирмы Costar #3595) в нормальной среде для роста на 1 день помещали 5 000 клеток/лунку и инкубировали в течение 2 дней в инкубаторе клеток при 37°С и стандартных СО₂ условиях. Плотность клеток на 3-й день не превышала 70-80%. На 3-й день среду выливали и клетки инкубировали в течение 24 ч в минимальной среде (DMEM, содержавшей 0,5% FCS). Для определения значения ИК₅₀ соединения формулы I [начиная с исходного раствора, содержавшего 10 мМ диметилсульфоксид (ДМСО)] добавляли с таким расчетом, чтобы конечная концентрация составляла 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 и 10 нМ. В присутствии соединения формулы I клетки инкубировали в течение 90 мин. После этого клетки стимулировали 50 мкл IGF-I (конечная концентрация IGF-I в клетке равнялась 10 нг/мл; IGF-I получали от фирмы Sigma; Код продукта: I 3769) и инкубировали в течение 10 мин при 37°С.

Среду удаляли и клетки дважды промывали PBS/O (фосфатно-буферный физиологический раствор без CaCl₂) и в течение 15 мин на льду лизировали с 50 мкл/лунку буфера RIPA [50 мМ Трис-HCl, рН: 7,2, 120 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 6 мМ EGTA, 1% NP-40, 20 мМ NaF, 1 мМ бензамидин, 15 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) и 0,5 мМ Na₃VO₄] и встряхивали на шейкере для 96-луночного планшета (клеточные экстракты) в течение 10 мин.

На поверхность лунок 96-луночных черных планшетов (фирмы Packard HTRF) в течение ночи при 4°С наносили 50 мкл IGF-IR моноклональных антител (mAB) (фирмы Santa Cruz; Cat. № SC-462) в концентрации 5 мкг/мл. Планшеты дважды промывали 0,05 об.% Tween-20 в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и один раз наночистой H₂O. В течение 2 ч при комнатной температуре (КТ) проводили блокировку 3%-ным бычьим сывороточным альбумином (BSA) в TBS-T буфере (20 мМ Трис-HCl, рН: 7,6, 137 мМ NaCl, 0,05% Tween-20). После блокировки планшеты один раз промывали наночистой Н₂O.

Клеточные экстракты (40 мкл/лунку) пипетировали в предварительно обработанные планшеты фирмы Packard совместно с 40 мкл антифосфотиразина мыши mAB PY-20, конъюгированного с алкалинфосфатазой (АР) (1:1000 разбавленная в буфере RIPA; антитела получены от фирмы Transduction Labs; Cat. №: P11120).

После инкубирования экстрактов и вторичных антител в течение 2 ч при 4°С экстракты выливали, планшеты дважды промывали 0,05 об.% Tween-20 в PBS и один раз наночистой водой.

Далее добавляли 90 мкл/лунку АР субстрата (фирмы CDP-Star; получали от фирмы Tropix; Cat. № MC100RY) и планшеты инкубировали в течение 45 мин при КТ в темноте с последующим измерением АР активности на сцинтилляционном счетчике Packard Top Count Microplate. Значение ИК₅₀ для соединений формулы I рассчитывали по методу анализа линейной регрессии с использованием программы GraphPad Instat (GraphPad программное обеспечение, США). Значения ИК₅₀, как было установлено, находились в интервале от 5 нМ до 1 мкМ, преимущественно в интервале от 5 нМ до 300 нМ.

Активность in vivo определяли, используя в качестве ксенотрансплантатной модели голую мышь: самок голой мыши линии BALB/c (8-12-недельного возраста, фирмы Novartis Animal Farm, Sissein, Швейцария) содержали на пище и воде ad libitum в стерильных условиях. Образование опухоли у мыши вызывали подкожной инъекцией опухолевых клеток (эпителиальные клетки человека линии А-431; American Type Culture Collection (ATCC), Роквилл, шт.Мэриленд, США, каталожный номер ATCC CRL 1555; клетки линии 85-летней женщины; линии клеток плоско-клеточного рака). До начала лечения образовавшиеся опухоли проводили по меньшей мере через три последовательные трансплантации. Фрагменты опухолей (примерно 25 мг) имплантировали подкожно в левый бок животных с использованием иглы троакара номер 13 и анестезии Forene® (фирмы Abbott, Швейцария). Лечение тестируемым соединением начинали, как только опухоль достигала в среднем объема в 100 мм³. Рост опухоли измеряли от двух до трех раз в неделю и через 24 ч после последнего введения лекарства определяли ее длину в двух перпендикулярных направлениях. Объемы опухолей рассчитывали в соответствии с опубликованными методиками (см. Evans и др., Brit. J. Cancer 45, 466-8, 1982). Противоопухолевую эффективность определяли делением среднего увеличения объема опухоли пролеченных животных на среднее увеличение объема опухоли нелеченых животных (контрольные животные) и умножением на 100. Эту эффективность выражали как Т/С%. Опухолевую регрессию (указывали в процентах) обозначали как наименьшее среднее значение объема опухоли по отношению к среднему значению объема опухоли в начале лечения. Тестируемые соединения ежедневно вводили посредством желудочного зонда.

В качестве альтернативы клеткам линии А-431 по такому же методу можно использовать клетки других линий, например клетки аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 (АТСС № НТВ 22; см.также J.Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 51, 1409-16, 1973) и клетки рака простаты DU 145 линии DU 145 (АТСС № НТВ 81; см.также Cancer Res. 37, 4049-58, 1978).

На основании этих исследований был сделан вывод, что соединение формулы I в соответствии с изобретением показывает терапевтическую эффективность преимущественно по отношению к пролиферативным заболеваниям, чувствительным к ингибированию IGF-IR тирозинкиназы.

В общем объектом изобретения является также применение соединения формулы I для ингибирования IGF-IR тирозинкиназы.

В дополнение к ингибированию IGF-IR тирозинкиназы соединения формулы I ингибируют также активность тирозинкиназы рецептора Flt-3 тирозинкиназы. Кроме того, соединения формулы I эффективны также при лечении пролиферативных заболеваний, преимущественно опухолевых заболеваний, чувствительных к ингибированию рецептора Flt-3 тирозинкиназы. Такие опухолевые болезни включают, например, лейкозы и миелодиспластический синдром. Аберрантная экспрессия гена FLt-3 обнаружена при лейкемии как взрослых, так и детей, включая острый миелоидный лейкоз (AML), AML совместно с миелодиспластическим синдромом (trilineage миелодиспластическим синдромом AML/TMDS), острый лимфобластный лейкоз (ALL) и миелодиспластический синдром (MDS). Следовательно, соединения формулы I пригодны для лечения этих заболеваний, преимущественно при лечении AML, поскольку активирующие мутации рецептора Flt-3 были обнаружены примерно у 35% пациентов с AML и ассоциируются с плохим прогнозом.

Flt-3 ингибирующее действие соединения формулы I может быть показано в экспериментах по ингибированию тирозинкиназы с использованием цитоплазматического домена киназы Flt-3. Опыты проводили следующим образом. Для генерации рекомбинантного бацилловируса, который экспрессирует область аминокислотной последовательности 563-993 внутрицитоплазматического домена киназы человека Flt-3, использовали вектор pFbacGOl (GIBCO) донора бацилловируса. Кодирующую последовательность для цитоплазматического домена Flt-3 амплифицировали по методу ПЦР из библиотеки c-DNA человека (Clontech). Обработкой рестриктазами BamHl и Hindlll амплифицированным фрагментам DNA и вектору pFbacGOl придавали совместимость для лигирования. Лигирование этих фрагментов DNA приводило к образованию плазмиды донора бацилловируса Fit-3 (1,1). Получение вируса, экспрессию белков в клетках Sf9 и очистку GST-слитых белков выполняли следующим образом.

Получение вируса. Трансферный вектор (pFbacGOl-Flt-3), содержавший домен киназы Flt-3, трансфектировали в клетки линии DHIOBac (GIBCO) и клетки высевали на агаровые чашки с селективной средой. Колонии без вставки слитой последовательности в вирусном геноме (содержался в бактерии) имели голубой цвет. Отбирали одиночные белые колонии и по стандартным методикам очистки плазмид из бактерий выделяли вирусную DNA (бактимиды). Затем с использованием реагента селфектин клетки Sf9 или Sf21 (American Type Culture Collection) трансфектировали вирусной DNA в сосудах площадью по 25 см².

Определение маломасштабной экспрессии белка в клетках Sf9. Из культуры трансфектированных клеток собирали среду, содержавшую вирус, и использовали для инфицирования, чтобы увеличить его титр. Среду, содержавшую вирус, полученную после двух циклов инфикцирования, использовали для крупномасштабной экспрессии белка. Для крупномасштабной экспрессии белка круглые чашки для культуры тканей площадью по 100 см² засевали 5×10⁷ клеток/чашку и инфицировали 1 мл среды, содержавшей вирус (приблизит. 5 MOIs). Через 3 дня клетки соскабливали с чашки и центрифугировали в течение 5 мин при 500 об/мин. Осадки клеток от 10 до 20 (чашки по 100 см²) ресуспендировали в 50 мл охлажденного льдом буфера для лизиса [25 мМ Трис-HCl, рН: 7,5, 2 мМ EDTA, 1% NP-40, 1 мМ DTT(дитиотрейтол), 1 мМ PMSF (дифенилметилсульфонилфторид)]. Клетки перемешивали на льду в течение 15 мин, а затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Очистка GST-меченных белков. Центрифугированные лизаты клеток наносили на колонку с глутатион-сефарозой (фирмы Pharmacia) объемом 2 мл и три раза промывали 10 мл 25 мМ Трис-HCl с рН 7,5, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 200 мМ NaCl. Затем GST-меченный белок элюировали 10 порциями (1 мл каждая) 25 мМ Трис-HCl (рН: 7,5), 10 мМ восстановленного глутатиона, 100 мМ NaCI, 1 мМ DTT и 10% глицерина и хранили при -70°С.

Измерение ферментативной активности. Испытания тирозин-протеин-киназы с очищенным GST-Flt-3 проводили в конечном объеме 30 мкл при содержании 200-1800 нг фермента (в зависимости от его удельной активности), 20 мМ Трис-HCI с рН 7,6, 3 мМ MnCl₂, 3 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 10 мкМ Na₃VO₄, 3 мкг/мл поли(Glu, Tyr) в соотношении 4:1, 1% ДМСО, 8,0 мкМ АТР и 0,1 мкCi [γ³³Р] АТР. Активность определяли в присутствии или отсутствии ингибиторов, измеряя включение ³³Р из [γ³³Р] АТР в поли(Glu,Tyr)субстрат. Реакцию (30 мкл) проводили в 96-луночном планшете при комнатной температуре в течение 20 мин в условиях, описанных ниже, и затем останавливали добавлением 20 мкл 125 мМ EDTA. В дальнейшем 40 мкл реакционной смеси переносили на Immobilon-PVDF мембрану (фирмы Millipore, Бедфорд, шт. Миннесота, США), предварительно вымоченную в метаноле в течение 5 мин, промытую водой, затем вновь вымоченную в течение 5 мин в 0,5%-ной НзР04, и ее помещали на вакуумную установку, отключенную от источника вакуума. После прокрашивания всех образцов установку подсоединяли к источнику вакуума и каждую лунку промывали 200 мкл 0,5% Н₃PO₄. Затем мембраны снимали и промывали на шейкере 4 раза 1,0%-ной Н₃PO₄ и один раз этанолом. После высушивания при комнатной температуре проводили считывание с мембран, устанавливая их на каркасе 96-луночного планшета Packard Top-Count и добавляя 10 мкл/лунку Microscint TM (фирмы Packard). Значение ИК₅₀ (в процентах) рассчитывали согласно методу анализа линейной регрессии данных по ингибированию каждым соединением в 2-х повторах для 4-х концентраций (обычно 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ). Единицу активности протеинкиназы определяли как 1 нмоль ³³Р АТР, перенесенного от [γ³³Р] АТР к белковому субстрату в минуту на грамм белка при 37°С.

В дополнение к действенности при заболеваниях, упомянутых выше, соединения формулы I могут быть также полезны при лечении ожирения и к тому же пригодны для лечения ишемической ретинопатии, такой как, например, диабетическая ретинопатия и ретинопатия недоношенных (ROP). Эффективность соединений формулы I при лечении этих заболеваний может быть показана экспериментами in vitro- или in vivo, известными в данной области техники.

Соединения формулы I могут быть также использованы для профилактики или борьбы с болезнями трансплантированных сосудов, например при алло- или ксенотрансплантации пораженных сосудов, в частности при атеросклерозе трансплантированных сосудов или при хроническом отторжении трансплантата, например трансплантата органа, ткани или клеток, например трансплантатов сердца, легкого, совместно сердца и легкого, печени, почек или поджелудочной железы (в частности, клеток панкреатического островка), или для профилактики или лечения стеноза трансплантата вен, повторного стеноза и/или окклюзии сосуда в результате повреждения сосуда, например вызванного процедурой катетеризации или процедурой соскоба с вены, при таких операциях, как чрескожная внутрипросветная ангиопластика, лазерное лечение или другие инвазивные процедуры, которые нарушают целостность внутренней оболочки сосуда или эндотелия.

Что касается групп предпочтительных соединений формулы I, упомянутых в настоящем описании в дальнейшем, то определения заместителей из общих определений, упомянутых в настоящем описании выше, вполне могут быть использованы, например, для замены более общих определений более конкретными определениями или преимущественно определениями, которые характеризуются как предпочтительные.

Предпочтение отдают соединению формулы I, в которой

n обозначает число от 0 до 4,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный (низш.)алкил или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный гидроксилом, незамещенной, моно- или дизамещенной аминогруппой или гетероциклическим радикалом; радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу, гетероциклический радикал или свободный или этерифицированный гидроксил, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, a Z либо отсутствует, либо обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил; или радикал R₆-сульфониламино(низш.)алкил, в котором R₆ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу или фенил, необязательно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкокси или нитрогруппой, при условии, что R₂ не обозначает карбокси, (низш.)алкоксикарбонил или (низш.)алкил, замещенный гидроксилом, если n обозначает О, R₁ обозначает водородный атом, R₄ обозначает бензил, а Х обозначает -О-,

R₃ обозначает (низш.)алкил или (низш.)алкокси, где заместители R₃ могут быть выбраны независимо друг от друга, если n>1,

R₄ обозначает радикал R₇-CR₈(R₉)-, в котором R₇ обозначает циклобутил, циклопентил, циклогексил, фенил, фурил, пирролил, тиенил, пиридил или фенил, замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из (низш.)алкила и атомов галогена, каждый из R₈ и R₉ независимо друг от друга обозначает водородный атом, (низш.)алкил или атом галогена, а Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-, или его соли.

Особое предпочтение отдают соединению формулы I, в которой n обозначает 0,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный (низш.)алкил или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный незамещенной, моно- или дизамещенной аминогруппой или гетероциклическим радикалом; радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу, гетероциклический радикал или, если Z содержится, обозначает также свободный или этерифицированный гидроксил, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, а Z либо отсутствует, либо обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил; или радикал R₆-сульфониламино(низш.)алкил, в котором R₆ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу или фенил, необязательно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкокси или нитрогруппой,

R₄ обозначает бензил, а

Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-,

или его соли.

Особое предпочтение, кроме того, отдают соединению формулы I, в которой n обозначает 0,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный (низш.)алкил или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный замещенным гетероциклическим радикалом; радикал R₅-(C=Y)-Z-, в котором R₅ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу, гетероциклический радикал или, если Z содержится, обозначает также свободный или этерифицированный гидроксил, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, а Z либо отсутствует, либо обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил, при условии, что Z не содержится, или обозначает (низш.)алкил, если R₅ обозначает (низш.)алкил, а Z обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил, если R₅ обозначает моно- или дизамещенную аминогруппу или гетероциклический радикал; или радикал R₆-сульфониламино(низш.)алкил, в котором R₆ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу или фенил, необязательно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкокси или нитрогруппой,

R₄ обозначает бензил, а

Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-,

или его соли.

Предпочтение преимущественно отдают соединению формулы I, в которой n обозначает 0,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный (низш.)алкил или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный амино-, Н-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламиногруппой или незамещенным гетероциклическим радикалом; или радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает (низш.)алкил, моно- или дизамещенную аминогруппу или гетероциклический радикал, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, a Z обозначает амино(низш.)алкил, если R₅ обозначает (низш.)алкил, и отсутствует, если R₅ обозначает гетероциклический радикал или моно- или дизамещенную аминогруппу,

R₄ обозначает бензил, а

Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-,

или его соли.

Особое предпочтение, кроме того, отдают соединению формулы I, в которой

n обозначает 0,

R₁ обозначает водородный атом, незамещенный или замещенный (низш.)алкил или атом галогена,

R₂ обозначает (низш.)алкил, замещенный незамещенной, моно- или дизамещенной аминогруппой или гетероциклическим радикалом, содержащим от 4 до 8 кольцевых членов и от 1 до 3 гетероатомов, вследствие чего по меньшей мере одним гетероатомом является атом азота и присоединение гетероциклического радикала к (низш.)алкилу осуществляется через азотный кольцевой атом; радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу, гетероциклический радикал, содержащий от 4 до 8 кольцевых членов и от 1 до 3 гетероатомов, вследствие чего по меньшей мере одним гетероатомом является атом азота и присоединение гетероциклического радикала осуществляется через азотный кольцевой атом, (низш.)алкил, замещенный упомянутым гетероциклическим радикалом или одним или несколькими радикалами, выбранными независимо друг от друга из ряда, включающего амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(низш.)алканоиламино-, N,N-ди(низш.)алканоиламиногруппу, гидроксил, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алканоил, (низш.)алканоилокси, циано-, нитрогруппу, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, амидиновую группу, гуанидино, уреидо, меркаптогруппу, (низш.)алкилтио и атом галогена, или, если Z содержится, обозначает также свободный или этерифицированный гидроксил, Y обозначает атом кислорода или серы или иминогруппу, а Z либо отсутствует, либо обозначает (низш.)алкил или амино(низш.)алкил; или радикал R₆-сульфониламино(низш.)алкил, в котором R₆ обозначает незамещенный или замещенный (низш.)алкил, незамещенную, моно- или дизамещенную аминогруппу или фенил, необязательно замещенный (низш.)алкилом, (низш.)алкокси или нитрогруппой,

R₄ обозначает бензил, а

Х имеет значения, выбранные из -О-, -NH- и -S-,

или его соли.

Особенно предпочтительным является соединение формулы I, в которой

n обозначает 0,

R₁ обозначает водородный атом,

R₂ обозначает амино(низш.)алкил, N-(низш-)алкиламино(низш.)алкил, N,N-ди(низш.)алкиламино(низш.)алкил, морфолинил(низш.)алкил, пиперидил(низш.)алкил, пирролидинил(низш. )алкил, (низш.)алкилпиперазинил(низш.)алкил, адамантаниламино(низш.)алкил, гидроксипиперидил(низш.)алкил, азепанил(низш.)алкил, ди(низш.) алкилпирролидинил(низш.)алкил, азетидинил(низш.)алкил, аминокарбонилпиперидил(низш.)алкил, пиридилпиперазинил(низш.)алкил, тиоморфолинил(низш.)алкил, ди(низш.)алкилморфолинил(низш.)алкил, аминокарбонилпирролидинил(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонилпиперазинил(низш.) алкил или фенилпиперазинил(низш.)алкил; радикал формулы R₅-(C=Y)-Z-, в которой R₅ обозначает (низш.)алкил, амино-, N-(низш.)алкиламино-, N,N-ди(низш.)алкиламино-, N-(фенил(низш.)алкил)амино-, N-((низш.)алкилфенил(низш.)алкил)амино-, N-((низш.)алкоксифенил(низш.)алкил)амино-, N-(морфолинил(низш.)алкил)амино-, N,N-ди(низш.)алкиламино(низш.)алкиламиногруппу, пирролидинил, пиперидил, морфолинил, (низш.)алкилпиперазинил, пиперидил(низш.)алкил, морфолинил(низш.)алкил, (низш.)алкилпиперазинил(низш.)алкил, (низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкокси, (низш.)алкокси(низш.)алкил, (низш.)алкокси(низш.)алкокси(низш.)алкил, N,N-ди(низш.) алкиламино(низш.)алкокси, морфолинил(низш.) алкокси