Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение

Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Данная заявка претендует на приоритет и эффект изобретения в соответствии с предварительной заявкой на патент США с регистрационным номером 60/288,564, поданной 3 мая 2001 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится в целом к рекомбинантным антителам. Более конкретно изобретение относится к рекомбинантным антителам, которые специфически связывают Молекулу Адгезии Эпителиальных Клеток человека (EpCAM), и к их использованию в качестве диагностических, прогностических и лечебных средств.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В течение последних лет достигнут значительный прогресс в разработке лекарственных средств на основе антител. Например, исследователи идентифицировали не только разнообразные маркеры, специфичные по отношению к раковым опухолям, но и разнообразные антитела, специфически связывающиеся с этими маркерами. Антитела можно использовать для доставки некоторых молекул, например токсина или иммуностимулирующей молекулы, например цитокина, к раковой клетке, экспрессирующей маркер, так что раковая клетка избирательно погибает (см., например, Патенты США №№ 5,541,087 и 5,650,150).

Антитело KS-1/4 - это моноклональное антитело мыши, направленное против молекулы адгезии эпителиальных клеток человека (EpCAM). EpCAM экспрессируется с очень низкими уровнями экспрессии на апикальной поверхности некоторых эпителиальных клеток. Например, EpCAM экспрессируется клетками кишечника на поверхности клеток, обращенной к перевариваемой пище и удаленной от кровотока, где эта молекула недоступна для большинства белков и клеток иммунной системы (Balzar et al. [1999] J. Mol. Med. 77:699-712).

Однако при определенных условиях ЕрСАМ экспрессируется на высоком уровне на некоторых клетках, например на опухолевых клетках эпителиального происхождения. В типичном случае эти опухолевые клетки теряют свою полярность, в результате чего ЕрСАМ экспрессируется на всей поверхности клеток. Таким образом, ЕрСАМ является удобным опухолеспецифичным маркером для направления иммуностимулирующих молекул на основе антител к опухолевым клеткам (Simon et al. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2755-2759; Perez et al. [1989] J. Immunol. 142:3662-3667).

Тем не менее антитела могут обладать сопутствующей иммуногенностью для млекопитающего-реципиента. Это с большей вероятностью происходит в том случае, если антитела являются неаутологичными. Вследствие этого эффективность лекарственных средств на основе антител часто бывает снижена из-за иммуногенной реакции, направленной против антитела. Иммуногенная реакция в типичном случае усиливается, если антитело полностью или частично происходит от млекопитающего, отличающегося от млекопитающего-реципиента, например, если антитело получено от мыши, а реципиентом является человек. Соответственно может быть полезным модифицировать антитела, полученные от мыши, таким образом, чтобы они больше походили на антитела человека, с целью снижения или минимизации иммуногенности антитела, полученного от мыши.

Хотя был разработан ряд подходов, включающих, например, химерные антитела, гуманизацию антител и вениринг антител, в данной области техники существует потребность в антителах, связывающихся со специфическими раковыми маркерами и обладающих сниженной иммуногенностью при введении их человеку. Кроме того, в данной области техники существует потребность в антителах, которые доставляли бы токсины или иммуностимулирующие молекулы, например, в виде слитых белков или иммуноконъюгатов, к специфическим раковым маркерам с целью избирательного уничтожения опухолевых клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано частично на идентификации рекомбинантных антител, которые специфически связывают ЕрСАМ человека, но являются менее иммуногенными для людей, по сравнению с исходными антителами мыши к ЕрСАМ. Более конкретно изобретение предусматривает рекомбинантные KS антитела, в которых аминокислотные последовательности, определяющие одну или несколько каркасных областей и/или областей, определяющих комплементарность, модифицированы с целью снижения их иммуногенности для людей.

При использовании в данной работе термины «антитело» и «иммуноглобулин» понимают как обозначающие: (i) интактное антитело (например, моноклональное антитело или поликлональное антитело), (ii) его антигенсвязывающие участки, включающие, например, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент, (Fab')₂-фрагмент, Fv-фрагмент, сайт связывания отдельной цепи антитела, sFv, (iii) биспецифичные антитела и их антигенсвязывающие участки и (iv) мультиспецифичные антитела и их антигенсвязывающие участки.

При использовании в данной работе термины «связывается специфически», «специфически связывается» и «специфическое связывание» понимают как обозначающие то, что антитело обладает сродством связывания с определенным антигеном не менее чем примерно 10⁶ М^-1, более предпочтительно не менее чем примерно 10⁷ М^-1, еще более предпочтительно не менее чем примерно 10⁸ М^-1, и наиболее предпочтительно не менее чем примерно 10¹⁰ М^-1.

При использовании в данной работе термин «области, определяющие комплементарность» (Complementarity-Determining Regions) и соответствующую аббревиатуру «CDRs», понимают как обозначающие гипервариабельные области или петли вариабельной области иммуноглобулина, которые первично взаимодействуют с антигеном. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) содержат по три CDRs, расположенные между каркасными областями, как показано на фигуре 1. Например, в аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:1, CDRs определены последовательностями аминокислот от Ser24 до Leu33 (CDR1), от Asp49 до Ser55 (CDR2) и от His88 до Thr96 (CDR3). В аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:2, CDRs определены последовательностями аминокислот от Gly26 до Asn35 (CDR1), от Trp50 до Gly66 (CDR2) и от Phe99 до Tyr105 (CDR3). Соответствующие CDRs других антител, описанных в данной работе, показаны на фигурах 1А-1С после сопоставления их с соответствующими последовательностями тяжелой или легкой цепей антитела KS-1/4.

При использовании в данной работе термин «каркасные области» (Framework Regions) и соответствующую аббревиатуру «FRs» понимают как обозначающие области вариабельной области иммуноглобулина, прилегающие к областям, определяющим комплементарность. Вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина (V_L) содержат по четыре FRs, как показано на фигуре 1. Например, в аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:1, FRs определены последовательностями аминокислот от Gln1 до Cys23 (FR1), от Trp34 до Phe48 (FR2), от Gly56 до Cys87 (FR3) и от Phe97 до Lys106 (FR4). В аминокислотной последовательности, определяющей вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина в антителе KS-1/4 и изображенной как SEQ ID NO:2, FRs определены последовательностями аминокислот от Gln1 до Ser25 (FR1), от Trp36 до Gly49 (FR2), от Arg67 до Arg98 (FR3) и от Trp106 до Ser116 (FR4). FRs других антител, описанных в данной работе, показаны на фигурах X и Y после сопоставления их с соответствующими последовательностями тяжелой или легкой цепей KS-1/4.

При использовании в данной работе термин «KS антитело» понимают как обозначающий антитело, специфически связывающееся с тем же ЕрСАМ антигеном человека, который связывается KS-1/4 антигеном мыши, экспрессируемым гибридомой (см., например, Cancer Res. 1984, 44(2):681-687). KS антитело предпочтительно содержит: (i) последовательность аминокислот SASSSVSY (аминокислоты 24-31 в SEQ ID NO: 1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR1 последовательности легкой цепи иммуноглобулина, (ii) последовательность аминокислот DTSNLAS (аминокислоты 49-55 в SEQ ID NO:1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR2 последовательности легкой цепи иммуноглобулина, (iii) последовательность аминокислот HQRSGYPYT (аминокислоты 88-96 в SEQ ID NO: 1), определяющую, по меньшей мере, участок CDR3 последовательности иммуноглобулина, (iv) последовательность аминокислот GYTFTNYGMN (аминокислоты 26-35 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR1 последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, (v) последовательность аминокислот WINTYTGEPTYAD (аминокислоты 50-62 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR2 последовательности иммуноглобулина, или (vi) последовательность аминокислот SKGDY (аминокислоты 101-105 в SEQ ID NO: 2), определяющую, по меньшей мере, участок CDR3 последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, или любую комбинацию указанных последовательностей.

В одном из аспектов изобретение предусматривает рекомбинантное антитело, которое специфически связывает ЕрСАМ, причем это антитело содержит последовательность аминокислот, участок которой определяет каркасную область в V_L домене иммуноглобулина. В одной из форм осуществления изобретения каркасная область (FR1) определена остатками аминокислот 1-23 SEQ ID NO: 5, где Xaa1 - это Q или E, Xaa3 - это L или V, Xaa10 - это I или Т, Хаа11 - это M или L, Xaa13 - это A или L, Xaa18 - это K или R, или Хаа 21 - это M или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа1, Хаа3, Хаа10, Хаа11, Хаа13, Хаа18 или Хаа21 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1. Аминокислоты в каждом из положений обозначены стандартным однобуквенным кодом.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR2) определена аминокислотными остатками 34-48 в SEQ ID NO: 5, где Хаа41 - это S или Q, Хаа42 - это S или A, Хаа45 - это P или L, или Хаа46 - это W или L, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа41, Хаа42, Хаа45 или Хаа46 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR3) определена аминокислотными остатками 56-87 в SEQ ID NO:5, где Хаа57 - это F или I, Xaa69 - это S или D, Xaa71 - это S или Т, Хаа73 - это I или Т, Хаа77 - это M или L, Хаа79 - это А или P, Хаа82 - это A или F, или Хаа84 - это Т или V, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа57, Хаа69, Хаа71, Хаа73, Хаа77, Хаа79, Хаа82 или Хаа84 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте изобретение предусматривает рекомбинантное антитело, которое специфически связывает ЕрСАМ, причем данное антитело содержит последовательность аминокислот, участок которой определяет каркасную область в V_L домене иммуноглобулина. В одной из форм осуществления изобретения каркасная область (FR1) определена аминокислотными остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа2 - это I или V, Xaa9 - это P или А, Хаа11 - это L или V, или Хаа17 - это T или S, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа2, Хаа9, Хаа11 или Хаа17 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR2) определена аминокислотными остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа38 - это K или R, Xaa40 - это Т или А, или Хаа46 - это К или Е, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа38, Хаа40, Хаа46 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения каркасная область (FR3) определена аминокислотными остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа68 - это F или V, Xaa69 - это A или T, Хаа70 - это F или I, Xaa73 - это Е или D, Xaa76 - это А или Т, Хаа80 - это F или Y, Xaa83 - это I или L, Xaa84 - это N или S, Xaa85 - это N или S, Xaa88 - это N, A или S, Xaa91 - это M или Т, или Хаа93 - это Т или V, при условии, что, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков в положениях Хаа68, Хаа69, Хаа70, Xaa73, Xaa76, Xaa80, Xaa83, Xaa84, Xaa85, Xaa88, Xaa91 или Хаа93 отличается от аминокислоты в соответствующем положении в SEQ ID NO: 2. В еще одной форме осуществления изобретения каркасная область (FR4) определена аминокислотными остатками 106-116 последовательности SEQ ID NO: 6, где Хаа108 - это Q или Т.

В другой форме осуществления изобретения V_L домен иммуноглобулина содержит FR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (i) аминокислотных остатков 1-23 последовательности SEQ ID NO: 9; и (ii) аминокислотных остатков 1-23 последовательности SEQ ID NO: 8. В другой форме осуществления изобретения V_H домен иммуноглобулина содержит FR-последовательность, определенную аминокислотными остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 18, и/или FR-последовательность, определенную аминокислотными остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 18. Более предпочтительно V_L домен содержит последовательность аминокислот, определенную аминокислотами 1-106 последовательности SEQ ID NO: 9, и/или V_H домен содержит последовательность аминокислот, определенную аминокислотами 1-116 последовательности SEQ ID NO: 18.

Кроме того, антитело может факультативно включать последовательность аминокислот, определяющую, по меньшей мере, участок CDR-последовательности, включающий, например, (i) остатки аминокислот 24-31 последовательности SEQ ID NO: 1; (ii) остатки аминокислот 49-55 последовательности SEQ ID NO:1; и/или (iii) остатки аминокислот 88-96 последовательности SEQ ID NO: 1. Сходным образом антитело может факультативно включать последовательность аминокислот, определяющую, по меньшей мере, участок CDR-последовательности, включающую, например: (i) остатки аминокислот 26-35 последовательности SEQ ID NO: 2; (ii) остатки аминокислот 50-62 последовательности SEQ ID NO: 2; и/или (iii) остатки аминокислот 101-105 последовательности SEQ ID NO: 2.

В другой форме осуществления изобретения антитело содержит ориентированный на антиген участок слитого белка, состоящего из антитела и цитокина. Цитокин предпочтительно является интерлейкином и наиболее предпочтительно является интерлейкином-2.

В следующем аспекте изобретение предусматривает вектор экспрессии, кодирующий, по меньшей мере, участок антитела согласно настоящему изобретению. В предпочтительной форме осуществления изобретения вектор экспрессии содержит последовательность нуклеотидов, изображенную как последовательность SEQ ID NO: 40.

В следующем аспекте изобретение предусматривает способ диагностики, прогнозирования и/или лечения больных людей, имеющих заболевание, связанное с чрезмерной экспрессией ЕрСАМ (например, заболевание, при котором ЕрСАМ присутствует в пораженной болезнью ткани на более высоком уровне, чем в ткани без этого заболевания). Способ включает введение одного из антител согласно настоящему изобретению человеку, нуждающемуся в такой диагностике, прогнозировании или лечении.

Антитело по выбору может содержать присоединенный к нему диагностический и/или терапевтический агент. Агент может быть слит с антителом с образованием слитого белка. Альтернативно агент может быть химически присоединен к антителу с образованием иммуноконъюгата. Предполагается, что агентом может быть, например, токсин, радиоактивная метка, цитокин, визуализирующий агент и т.п. В предпочтительной форме осуществления изобретения антитело согласно настоящему изобретению слито с цитокином с получением слитого белка. Предпочтительные цитокины предпочтительно включают интерлейкины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 и IL-18, гемопоэтические факторы, такие как колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF) и эритропоэтин, факторы некроза опухолей (ФНО, англоязычная аббревиатура - TNF), такие как TNFα, лимфокины, такие как лимфотоксин, регуляторы метаболических процессов, такие как лептин, интерфероны, такие как интерферон α, интерферон β и интерферон γ, и хемокины. Предпочтительно слитый белок типа «антитело-цитокин» проявляет биологическую активность цитокина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1А, В, С изображено:

Фиг. 1А, 1В и 1С демонстрируют линеаризованные варианты легкой и тяжелой цепей и консенсусные последовательности KS антител. Каркасные области иммуноглобулинов (FR1-FR4) обозначены «-». Области, определяющие комплементарность (FR1-FR4), обозначены «*». Отдельные сегменты V области легкой цепи KS антитела обозначены как «VK», где К обозначает то, что легкая цепь является каппа-цепью. Отдельные сегменты V области тяжелой цепи KS антитела обозначены как «V_Н». Аминокислоты, которые можно заменять, в консенсусных последовательностях обозначены как «Х».

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные антитела, которые специфически связывают Молекулу Адгезии Эпителиальных Клеток (ЕрСАМ) человека. Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению имеют измененные вариабельные области, что приводит к снижению их иммуногенности в организме человека. Вариабельные области антител согласно настоящему изобретению особенно целесообразно использовать для нацеливания антител и содержащих антитела слитых белков на опухолевые ткани с избыточной экспрессией ЕрСАМ у больных людей. В предпочтительных формах осуществления изобретения антитело согласно настоящему изобретению соединяют с цитокином с получением иммуноцитокина.

Последовательности белков согласно настоящему изобретению

В настоящем изобретении описано семейство последовательностей вариабельной области (или V области) антител, которые будучи соответствующим образом гетеродимеризованы, связываются с молекулой адгезии эпителиальных клеток человека (ЕрСАМ), также известной как KS антиген (или KSA). Предпочтительные белки согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения больных людей, как описано в данной работе. Соответственно предпочтительные варианты KS антител являются гуманизированными, деиммунизированными или одновременно гуманизированными и деиммунизированными с целью снижения их иммуногенности при введении человеку. Согласно настоящему изобретению, KS антитела мыши можно деиммунизировать или гуманизировать, например, с использованием таких способов деиммунизации, в которых потенциальные Т-клеточные эпитопы устраняют или ослабляют посредством внедрения в них мутаций, снижающих связывание пептидного эпитопа с молекулой МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II (см., например, WO98/52976 и WO00/34317), или с использованием способов, в которых Т-клеточные эпитопы, не происходящие от человека, мутируют таким образом, что они начинают соответствовать собственным эпитопам человека, присутствующим в антителах человека (см., например, Патент США № 5,712,120).

I. Вариабельная область легкой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C- S-A-S-S-S-V-S-T-X-L-W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C-H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-X-E-I-K (SEQ ID NO: 3).

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-23 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-X-X-S-P-G-X-X-X-T-X-T-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Xaa1; L или V в положении Xaa3; I, T или S в положении Xaa10; M или L в положении Xaa11; S или A в положении Xaa12; A, L или V в положении Xaa13; E или Q в положении Xaa17, K или R в положении Xaa18, V или A в положении Xaa19; и M, L или I в положении Xaa21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот в FR1 области: Е в положении Xaa1; V в положении Xaa3; T или S в положении Xaa10; L в положении Xaa11; A в положении Xaa12; L или V в положении Xaa13; Q в положении Xaa17, R в положении Xaa18, A в положении Xaa19; и L или I в положении Xaa21.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 24-33 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно: S-A-S-S-S-V-S-T-X-L. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR1 области одну из следующих аминокислот: M или I в положении Хаа32. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR1 области замену аминокислоты, например, I в положении Хаа32.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 34-48 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно W-Y-X-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-X. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или L в положении Xaa36; S или Q в положении Xaa41; S, A или P в положении Xaa42; P или L в положении Xaa45; W или L в положении Xaa46; и F или Y в положении Xaa48. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот в FR2 области: L в положении Xaa36; Q в положении Xaa41; A или P в положении Xaa42; L в положении Xaa45; L в положении Xaa46; и Y в положении Xaa48.

В следующей форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 56-87 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно G-X-P-X-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-X-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Xaa57; A или S в положении Xaa59; S, D или T в положении Xaa69; I или T в положении Xaa71; I или T в положении Xaa73; S или N в положении Xaa75; M или L в положении Xaa77; A или P в положении Xaa79; A или F в положении Xaa82; и T или V в положении Xaa84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: I в положении Xaa57; S в положении Xaa59; D или T в положении Xaa69; T в положении Xaa71; T в положении Xaa73; N в положении Xaa75; L в положении Xaa77; P в положении Xaa79; F в положении Xaa82; и V в положении Xaa84.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR4 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 97-106 последовательности SEQ ID NO: 3, а именно F-G-G-G-T-K-X-E-I-K. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот, например, L или V в положении Хаа103. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR4 области замененную аминокислоту, например, V в положении Хаа103.

II. Вариабельная область тяжелой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N-W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G-W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-X-S-K-G-D-Y-W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 4)

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-X-X-V-K-I-S-C-K-A-S. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; L или V в положении Xaa11; E или S в положении Xaa16; и T или S в положении Xaa17. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; V в положении Xaa11; S в положении Xaa16; и S в положении Xaa17.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO:4: W-V-X-Q-X-P-G-X-G-L-X-W-M-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: K или R в положении Xaa38; T или A в положении Xaa40; K или Q в положении Xaa43; и K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: R в положении Xaa38; A в положении Xaa40; Q в положении Xaa43; и E в положении Xaa46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR2 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 50-66 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: D или K в положении Xaa63; и K или Q в положении Xaa65. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K в положении Xaa63; и Q в положении Xaa65.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно R-X-X-X-X-X-X-T-S-X-S-T-X-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или V в положении Xaa68, A, T или V в положении Xaa69; F или I в положении Xaa70; S или T в положении Xaa71; L или A в положении Xaa72; E или D в положении Xaa73; A или T в положении Xaa76; A или L в положении Xaa79; F или Y в положении Xaa80; I или L в положении Xaa83; N или S в положении Xaa84; N или S в положении Xaa85; N, A или S в положении Xaa88; M или T в положении Xaa91; и T или V в положении Xaa93. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa68, T или V в положении Xaa69; I в положении Xaa70; T в положении Xaa71; A в положении Xaa72; D в положении Xaa73; T в положении Xaa76; L в положении Xaa79; Y в положении Xaa80; L в положении Xaa83; S в положении Xaa84; S в положении Xaa85; A или S в положении Xaa88; T в положении Xaa91; и V в положении Xaa93.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR3 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 99-105 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно F-X-S-K-G-D-Y. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: например, I или M в положении Xaa100. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR3 области замену аминокислоты, например, М в положении Хаа100.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR4 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 106-116 последовательности SEQ ID NO: 4, а именно W-G-X-G-T-X-V-T-V-S-S. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или T в положении Xaa108; и S или T в положении X111. Более предпочтительно, рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR4 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: T в положении Xaa108; и T в положении X111.

III. Усовершенствованная вариабельная область легкой цепи

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:

X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C-S-A-S-S-S-V-S-Y-M-L-W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F-D-T-S-N-L-A-S-G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C -H-Q-R-S-G-Y-P-Y-T-F-G-G-G-T-K-L-E-I-K (SEQ ID NO: 5)

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-23 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно X-I-X-L-T-Q-S-P-A-X-X-S-X-S-P-G-E-X-V-T-X-T-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Xaa1; L или V в положении Xaa3; I или Т в положении Xaa10; M или L в положении Xaa11; А или L в положении Xaa13; K или R в положении Xaa18, и M или L в положении Xaa21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: E в положении Xaa1; V в положении Xaa3; T в положении Xaa10; L в положении Xaa11; R в положении Xaa18; и L в положении Xaa21.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: Q или E в положении Хаа1; A или L в положении Хаа11; и M или L в положении Хаа21. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: Е в положении Хаа1; L в положении Хаа11; и L в положении Хаа21.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 34-48 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно W-Y-Q-Q-K-P-G-X-X-P-K-X-X-I-F. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: S или Q в положении Xaa41; S или A в положении Xaa42; P или L в положении Xaa45; и W или L в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: Q в положении Xaa41; A в положении Xaa42; L в положении Xaa45; и L в положении Xaa46.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: S или A в положении Хаа42; P или L в положении Хаа45; и W или L в положении Хаа46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: A в положении Хаа42; L в положении Хаа45; и L в положении Хаа46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 56-87 последовательности SEQ ID NO: 5, а именно G-X-P-A-R-F-S-G-S-G-S-G-T-X-Y-X-L-X-I-S-S-X-E-X-E-D-X-A-X-Y-Y-C. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Xaa57; S или D в положении Xaa69; S или T в положении Xaa71; I или T в положении Xaa73; M или L в положении Xaa77; A или P в положении Xaa79; A или F в положении Xaa82; и T или V в положении Xaa84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: I в положении Xaa57; D в положении Xaa69; T в положении Xaa71; T в положении Xaa73; L в положении Xaa77; P в положении Xaa79; F в положении Xaa82; и V в положении Xaa84.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или I в положении Хаа57; S или D в положении Хаа69; А или Р в положении Хаа79; А или F в положении Хаа82; и Т или V в положении Хаа84. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 легкой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: I в положении Хаа57; D в положении Хаа69; Р в положении Хаа79; F в положении Хаа82; и V в положении Хаа84.

IV. Усовершенствованная вариабельная область тяжелой цепи

Рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую следующую последовательность аминокислот:Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S-G-Y-T-F-T-N-Y-G-M-N- W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G- W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G-R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R-F-I-S-K-G-D-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S (SEQ ID NO: 6).

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 1-25 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно Q-X-Q-L-V-Q-S-G-X-E-X-K-K-P-G-E-X-V-K-I-S-C-K-A-S. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; L или V в положении Xaa11; и T или S в положении Xaa17. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; V в положении Xaa11; и S в положении Xaa17.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: I или V в положении Xaa2; P или A в положении Xaa9; и L или V в положении Xaa11. Соответственно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую FR1 тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит в FR1 области, по меньшей мере, одну из следующих замен: V в положении Xaa2; A в положении Xaa9; и V в положении Xaa11.

В другой форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 36-49 последовательности SEQ ID NO:6, а именно W-V-X-Q-X-P-G-K-G-L-X-W-M-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K или R в положении Xaa38; T или A в положении Xaa40; и K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в FR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: R в положении Xaa38; A в положении Xaa40; и E в положении Xaa46.

В другой предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области следующие аминокислоты, например, K или E в положении Xaa46. Более предпочтительно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую в FR2 области замену аминокислоты, например, E в положении Xaa46.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую CDR2 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 50-66 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно W-I-N-T-Y-T-G-E-P-T-Y-A-D-X-F-X-G. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: D или K в положении Xaa63; и K или Q в положении Xaa65. Более предпочтительно, рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит в CDR2 области, по меньшей мере, одну из следующих замен аминокислот: K в положении Xaa63; и Q в положении Xaa65.

В предпочтительной форме осуществления изобретения рекомбинантное антитело к ЕрСАМ содержит последовательность аминокислот, определяющую FR3 область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая представлена остатками 67-98 последовательности SEQ ID NO: 6, а именно R-X-X-X-S-L-X-T-S-X-S-T-A-X-L-Q-X-X-X-L-R-X-E-D-X-A-X-Y-F-C-V-R. Более конкретно рекомбинантное антитело к ЕрСАМ согласно настоящему изобретению содержит в FR3 области, по меньшей мере, одну из следующих аминокислот: F или V в положении Xaa68, A или T в положении Xaa69; F или I в положении Xaa70; E или D в положении Xaa73; A или T в положении Xaa76; F или Y в положении Xaa80; I или L в положении Xaa83; N или S в положении Xaa84; N или S в положении Xaa85; N, A или S в положении Xaa88; M или T в положени