Непрерывный способ экстрагирования процианидинов какао и экстракт какао, полученный этим способом

Непрерывный способ экстрагирования процианидинов какао и экстракт какао, полученный этим способом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к усовершенствованным способам экстракции полифенолов какао, в том числе катехина, эпикатехина и олигомеров процианидина какао из сухого вещества какао.

Известно, что регулярное потребление пищевых полифенолов, которые обычно присутствуют в различных фруктах и овощах, является полезным. Установлено, что красное вино, зеленый чай и какао богаты полифенолами, и было показано, что регулярное потребление как красного вина, так и зеленого чая, снижают риск смерти от заболеваний сердца в промышленно развитых странах.

Хорошо известно, что значительный вклад в развитие аромата ферментированных и жареных какао-бобов вносят полифенолы какао. Терпкий и горький вкус какао традиционно связывают с присутствием в какао-бобах алкалоидов ксантина и полифенолов. По этой причине за многие годы были разработаны различные способы экстракции полифенолов какао для определения их присутствия, количественной оценки и идентификации. Полифенолами какао являются прежде всего процианидины какао. Однако до сих пор ни один из экстракционных способов не позволял получить экстракты с высоким содержанием процианидов какао.

В настоящее время известно, что между структурой и функцией процианидиновых олигомеров какао имеется очевидная взаимосвязь, означающая, что отдельные олигомеры или фракции, содержащие несколько олигомеров сходного размера, демонстрируют специфичные биологические функции, на которые не влияют другие олигомеры. Таким образом, важно обеспечить, чтобы используемый способ экстрагирования приводил не только к максимальному растворению полифенолов какао, но также эффективно экстрагировал все олигомеры полифенолов какао, присутствующие в какао-бобах.

Экстрагирование какао-бобов водой или органическим растворителем, или смесью воды и органического растворителя использовалось для удаления алкалоидов ксантина (преимущественно кофеина и теобромина) и других растворимых компонентов какао- бобов, которые придают горький, неприятный привкус. К числу этих растворимых компонентов, придающих горький привкус, относятся и процианидины.

В патенте США № 1750795 (выдан Дефрену в 1926) описан способ удаления «большей части растворимых компонентов бобов, придающих горький привкус», который заключается в вымачивании бобов в воде при 60°С, удалении воды и обжаривании бобов.

Для удаления ксантинов с целью получения бобов какао без стимулирующих веществ использовалась обработка горячей водой, см. патент США № 4407834 («удаление теоброминов из какао»)(выданный Chiovini и др. 28 июня 1983) и патент США № 4755391 «удаление метилксантинов из какао» (выданный Chiovini и др. 5 июля 1988).

Экстракты какао получали экстрагированием порошка, полученного из ферментированных, обжаренных обычным способом какао-бобов, водой и/или спиртами. Osakabe и др. использовал для получения сырого экстракта полифенола обычный спирт (этанол) абсолютный либо в водном растворе с более 40% об/об деионизированной воды при температуре окружающей среды, см. JP-94-64717 «Пищевые продукты или напитки для предотвращения язвы желудка (4 октября 1995).

Zieglader и др. для экстракции полифенолов из какао-бобов использовали метанол при температуре окружающей среды, см.«Antioxidative Effects of Cocoa» («Антиокислительное действие какао») (Rev.Choc. Confect Bak, 8:3-6, 1983), в котором описано получение метанольного экстракта. Этот экстракт содержал «мономерные предшественники танина (катехины, антоцианидины и их растворимые конденсаты)» и использовался в качестве добавки к маслу для предотвращения его окисления. Griffiths и др. использовали метанольные экстракции, также проводимые при температуре окружающей среды, для получения экстрактов полифенолов из спелых какао-бобов без шелухи, которые использовались для изучения характеристик растительных полифенолов какао и других растений, см. «А» Comparative Study of the Seed Polyphenols of the Genus Theobroma» «Сравнительное изучение полифенолов семян рода Theobroma», (Biochemical J. 74:362-365, 1960). Rigaud и др. получили экстракт из лиофилизированных какао-бобов и виноградных косточек и обнаружили, что использование метанола в качестве растворителя препятствует экстракции высших олигомеров, см. "Normal-Phase High-Performance Liquid Chromatograhic Separation of Procyanidins from Cacao Beans and Grape Seeds» («Отделение процианидинов из какао-бобов и виноградных косточек посредством ВЭЖХ» (J. Chromatography 654:255-60, 1993). Jalal и Collin получили экстракты из различных частей растения какао для анализа на присутствие полифенолов в каждой части растения. Экстрагирование проводили 70% холодным метанолом, а затем этилацетатом, см. "Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacao" (Phytochemistry, 16:1377-1380, 1977) «Полифенолы культур зрелых растений, ростков и тканей Theobroma cacao».

Для экстракции бобов какао также использовалась смесь ацетон/вода. Clapperton et al., описали экстракцию обезжиренного порошка какао, полученного из ферментированных бобов какао, используя охлажденный 70% ацетон, см. "Polyphenols and Cocoa Flavor, Groupe Polyphenols" Полифенолы и ароматические вещества какао (XVI^th Intern. Conf., Lisbon, Portugal, 13-16 июля, 1992). Rigaud объединил первую экстракцию этанолом и вторую экстракцию, используя 60%-ную смесь ацетона с водой, см. "Normal-Plase High-Performance Liquid Chromatographic Separation of Procyanidins from Cacao Beans and Grape Seeds" (J.Chromatography, 654:255-60, 1993).

Обычно какао-бобы обрабатывают таким образом, чтобы максимально уменьшить горький привкус, который дают бобам полифенолы, что приводит к снижению содержания полифенольного компонента в бобах. Существует два пути, при которых полифенольный компонент значительно уменьшается: ферментация какао-бобов в кожуре и обжаривание ферментированных какао-бобов для растрескивания кожуры и облегчения ее удаления. Zieglader и др. описали потерю антиоксидантной активности в экстрактах ферментированных какао-бобов по сравнению с экстрактами неферментированных бобов и связь этого снижения антиоксидантной активности со снижением количества полифенолов в экстрактах ферментированных бобов. Все описанные выше способы экстракции проводили с использованием ферментированных бобов и в большинстве случаев бобы были обжарены. При этом выход процианидинов был гораздо ниже, чем их выход из экстрактов неферментированных бобов.

Обычной практикой было использовать после стадии начальной экстракции стадию экстракции этилацетатом, см. Forsyth & Roberts, «Cacao Polyphenolic Substances: 3. The Structure of Cacao Leucocyanidin I» Biochem. J. 74, 374-378, 1960; Thompson et al., «Plant Procyanidins. Part I. Introduction; the Isolation, Structure and Distribution in Nature of Plant Procyanidins» J. Chem. Soc. Perkin I, Vol. 11, 1387-99, 1972; Jalal & Collins, «Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacao»,Phytochemistry, 16:1377-1380, 1977, Porter et al. «Flavans and Proanthocyanidins» Chapter Two in «The Flavonoids», Ed., J.B. Harbome, Chapman and Hall Ltd., London, 1988; патент США № 5554645, выданный 3 октября 1994 Romanczyk и др.). Экстракт в этом случае содержит мономеры и низшие олигомеры, но не содержит или содержит в небольшом количестве высшие олигомеры, см. Lea A. «The Phenolics of Ciders: Oligomeric and Polymeric Procyanidins», J. Sci. Fd Agric. 29, 471-477, 1978.

На выход экстрагированных полифенолов влияет то, были или не были какао-бобы обезжирены перед экстракцией. Если бобы не были обезжирены, то жир в бобах оказывает отрицательное действие на растворяющую способность растворителя, и полифенольный выход значительно снижается (Lazarus et al., «Flavonoids and Other Polyphenols» в серии «Методы Энзимологии», ред. Lester Packer. Academic Press, New York.

Экстракты какао получали из порошка какао, полученного из неферментированных или ферментированных какао-бобов, высушенных на солнце. Бобы размалывали, обезжиривали и экстрагировали смесью 70% ацетон/30% деионизированная вода, а затем экстрагировали 70% метанолом и два раза хлороформом. Затем экстрагировали этилацетатом с добавлением воды и удаляли этилацетат. Альтернативно, бобы экстрагировали 70% ацетоном. В обоих случаях экстракцию проводили при комнатной температуре, и водные экстракты сушили сублимацией, см. патент США № 5554645 (выданный 3 октября 1994 L. Romanczyk и др.) и WO 98/09533 (12 марта 1998).

Кроме того, экстракты какао могут быть получены из частично обезжиренного порошка какао, полученного из необжаренных бобов какао. Порошок какао, полученный как из ферментированных, частично ферментированных, так и из неферментированных какао-бобов имеет более высокое содержание полифенолов, то есть процианидинов какао, чем порошок какао, полученный из обжаренных какао-бобов, как это делается обычно, см. патент США № 6015913 (выданный 18 января 2000 K.S.Kealey и др.).

Обезжиренные, высушенные замораживанием, неферментированные бобы какао содержат приблизительно 2% алкалоидов ксантина, а обработанные обычным способом бобы содержат их еще больше. Теобромин является продуктом разложения кофеина, и оба являются хорошо известными стимуляторами нервной системы. Чрезмерное потребление алкалоида ксантина, как полагают, является вредным. Следовательно, в некоторых случаях, может быть желательным получение экстрактов какао без алкалоидов ксантина.

Таким образом, существует потребность в усовершенствованном способе экстрагирования процианидинов какао из сухих веществ какао, и, в некоторых случаях, для получения экстрактов какао, не содержащих кофеина и теобромина.

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу экстракции полифенолов какао, которые включают в себя катехин, эпикатехин и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Улучшенный способ включает в себя экстракцию при атмосферном или пониженном давлении подкисленным растворителем, способным растворять полифенолы, или водными подкисленными растворами, содержащими растворитель. Предпочтительно, количество кислоты, добавляемой в растворитель или водный растворитель, является достаточным для снижения рН с около 6,5 до около 2-4. Предпочтительными являются пищевые или физиологически приемлемые кислоты.

Сухие вещества какао получают из неферментированных, частично ферментированных или ферментированных бобов какао. Органический растворитель может быть выбран из группы, состоящей из низших алкильных спиртов, низших алкильных кетонов и низших алкильных ацетатов. Соответствующие растворители включают метанол, этанол, изопропанол, ацетон, метилацетат и этилацетат. Водный растворитель предпочтительно содержит не более чем около 50 об.% воды, однако он может содержать больше воды, но эффективность экстракции такими, более водными, растворами будет ниже. Предпочтительно, водно-органический растворитель содержит от около 50 до около 70% изопропанола, от около 80% до около 100% ацетона и от около 80% до около 95% этанола. При использовании одного этанола экстрагируются главным образом процианидиновые олигомеры какао, начиная с гептамеров. Смесь из около 80% изопропилового спирта и около 20% воды предпочтительно экстрагирует мономеры и олигомеры до гексамеров включительно.

Настоящее изобретение также относится к способу экстрагирования полифенолов какао, в том числе катехина, эпикатехина и процианидиновых олигомеров какао, из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Способ включает стадию экстракциии сухого вещества какао при атмосферном или пониженном давлении неподкисленным органическим растворителем, способным растворять полифенолы какао. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично неферментированными; однако могут использоваться ферментированные какао-бобы, но в этом случае в экстракте будет меньше высокомолекулярных олигомеров.

Частично ферментированные какао-бобы обычно имеют коэффициент ферментации 275 или менее. К предпочтительным частично ферментированным какао-бобам относятся синевато-серые, фиолетовые или фиолетово-коричневые бобы какао, или смеси синевато-серых и фиолетовых бобов какао, фиолетовых и коричневых бобов какао, или синевато-серых, фиолетовых или коричневых бобов какао. Неферментированные или частично ферментированные бобы какао содержат по меньшей мере от около 1% до около 15-17 вес.% общих процианидинов какао на грамм обезжиренного сухого вещества какао, обычно около 4-7%.

Растворитель может быть выбран из группы, состоящей из спирта низшего алкила, кетона низшего алкила и ацетата низшего алкила. Подходящими растворителями являются метанол, этанол, изопропил, ацетон, метилацетат и этилацетат. Водный раствор растворителя может содержать до около 50 об.% воды, однако количество воды может быть больше, но при этом общее количество экстрагированных полифенолов какао будет меньше. К предпочтительным растворителям относится 50-60% ацетон и 100% этанол. Экстракцию можно проводить при температуре от 0°С до температуры кипения используемого растворителя или водного растворителя при используемом давлении экстракции. Когда растворителем является метанол, экстракцию предпочтительно проводят при комнатной температуре. Когда растворителем является этанол, экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Когда растворителем является изопропанол, экстракцию предпочтительно проводят при около 70^°С. Когда растворителем является водный раствор ацетона, экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 50^°С до температуры кипения раствора.

В вышеуказанных процессах, при использовании подкисленного растворителя или его водного раствора, предпочтительнее низкая температура экстракции. Когда используется неподкисленный растворитель или его водный раствор, то может использоваться высокая температура экстракции.

Настоящее изобретение также относится к способу селективной экстракции низкомолекулярных процианидиновых олигомеров какао из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао. Используемым растворителем является растворитель, который предпочтительно экстрагирует низкомолекулярные олигомеры, например метилацетат или этилацетат. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными, однако могут использоваться ферментированные какао-бобы. Экстракцию предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Полученные экстракты какао состоят в основном из мономеров, димеров и тримеров.

Настоящее изобретение также относится к способу селективного экстрагирования высокомолекулярных процианидиновых олигомеров какао из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из необжаренных бобов какао. Этот способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухого вещества какао этилацетатом, (b) извлечения экстрагированного сухого вещества какао, (с) экстрагирования извлеченного сухого вещества какао растворителем, который является подходящим растворителем для высокомолекулярных олигомеров, например, ацетоном, этанолом и их смесью с содержанием воды до 50%, (d) разделения сухого вещества какао и экстракта какао и, возможно, е) сушки экстракта какао. Экстрагирование предпочтительно проводят при температуре от около 20°С до около 50°С. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными, однако могут использоваться ферментированные какао-бобы. Экстракт какао состоит в основном из по меньшей мере тетрамеров и высших олигомеров.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к непрерывному способу экстрагирования полифенолов какао при атмосферном или пониженном давлении, включая катехины, эпикатехины и процианидиновые олигомеры какао, из частично или полностью обезжиренного сухого вещества какао, используя растворитель, пригодный для растворения процианидинов какао, или водные растворы растворителя. Этот способ предусматривает стадии: а) контактирования ряда ячеек, заполненных сухими веществами какао, содержащими различные количества полифенолов какао, с растворителем, текущим в противоточном направлении, и (b) рециркулирования экстракта какао. Жидкий экстракт какао может быть высушен. К предпочтительным растворителям относятся низшие алкильные спирты, низшие алкильные кетоны и низшие алкильные ацетаты. Подходящими низшими спиртами являются метанол, этанол и изопропанол. Предпочтительным является этанол. Подходящим низшим алкильным кетоном является ацетон. Подходящими низшими ацетатами является метилацетат и этилацетат. Предпочтительно, цикл с экстрактом какао повторяют до практически полного исчезновения полифенолов какао, в том числе эпикатехина, катехина и/или процианидинов какао, из экстрагируемого сухого вещества какао.

Экстракты какао могут использоваться в виде жидких экстрактов, называемых «настойками», если растворителем является спирт, в виде водного раствора, если растворитель удаляют, или в виде водорастворимого сухого порошка, полученного после удаления растворителя или растворителя и воды. Когда используется растворитель, экстракт какао сушат путем испарения растворителя. Когда используется водный раствор растворителя, из экстракта какао выпаривают растворитель перед сушкой водного экстракта. Водные экстракты могут быть высушены сублимационной сушкой, распылительной сушкой, испарительной сушкой или барабанной сушкой.

Настоящее изобретение относится к способу получения процианидинов какао и теобромина из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао, полученного из бобов какао. Способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухих веществ какао этанолом при температуре от около 50°С до около 70°С, (b) охлаждения экстракта этанола при температуре и в течение времени, достаточных для осаждения теобромина, (с) отделения осажденного теобромина и, возможно, (d) удаления этанола из экстракта для получения сухих процианидинов какао. Предпочтительно, какао-бобы являются неферментированными или частично ферментированными и необжаренными, однако могут использоваться ферментированные и ферментированные обжаренные какао-бобы.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения количества теобромина в процианидинах какао, экстрагированных из частично обезжиренного или полностью обезжиренного сухого вещества какао. Этот способ предусматривает стадии: а) экстрагирования сухого вещества какао изопропанолом с получением спиртового экстракта, содержащего процианидины какао и теобромин, (b) охлаждения спиртового экстракта при температуре и в течение времени, достаточных для осаждения теобромина, и (с) отделения теобромина от спиртового экстракта.

В вышеуказанных способах охлаждение проводят в течение до около 12 часов при температуре от около 0°С до около 5°С, а стадию отделения проводят путем фильтрования экстракта, центрифугирования экстракта или адсорбирования теобромина подходящим адсорбентом.

На фиг. 1(А) представлен график, показывающий влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного этанола.

Фиг. 1(B) - график, на котором представлено влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на % выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного изопропанола.

Фиг. 1(С) - график, на котором представлено влияние температур 0°, 20°, 50° и 70°С на % выход олигомеров - мономеров, пентамеров и декамеров, при использовании в качестве экстрагирующего растворителя 100%-ного метанола.

Фиг. 2 - график, показывающий, что ацетон и этанол наиболее эффективны для экстракции высокомолекулярных олигомеров. Извлечение показано в процентах от выхода стандартной экстракции смесью ацетан:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5 об/об).

Фиг. 3 - график, на котором представлено влияние ферментации и обработки на количество мономеров и олигомеров процианидина, экстрагированных с использованием в качестве экстрагирующего растворителя смеси ацетона:воды:уксусной кислоты. Результаты представлены в % от выхода из неферментированных бобов какао.

Фиг. 4 - график, на котором представлено влияние ферментации и обработки на количество мономеров и олигомеров процианидина, экстрагированных с использованием в качестве растворителя кипящей воды. Результаты представлены в % от выхода из неферментированных бобов какао.

Фиг. 5 - блок-схема процесса экстракции полифенолов из какао-бобов.

Фиг. 6 - схема, описывающая процесс удаления теобромина из экстракта какао. Поток паров растворителя, содержащего теобромин, проходит через трехходовой клапан на охлаждаемые пластины слева. Затем поток переключают на правую сторону. После этого растворитель удаляют из левой части. Левую дверь охлаждающего шкафа открывают и твердый осадок сырого теобромина собирают с пластин охлаждающего шкафа или смывают растворителем и получают в жидком виде. Те же стадии повторяют на правой стороне. Растворитель извлекают.

Фиг. 7 - график, сравнивающий профили олигомеров сухого вещества какао-экстрактов при экстрагировании этилацетатом при 50°С веществ, полученных из неферментированных какао-бобов, и при экстрагировании этилацетатного экстракта сухого вещества какао смесью ацетон:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5). Процентный выход сравнивали с экстрактом сухих веществ какао из неферментированных бобов смесью ацетон:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5).

Фиг. 8 - график, сравнивающий выход мономеров и олигомеров в экстрактах сухого вещества какао, полученных из ферментированных и неферментированных бобов какао, при использовании смеси 80% этанол:20% вода в качестве растворителя.

Полифенолы какао, в том числе процианидины, могут быть получены из нескольких генотипов Theobroma cocoa c помощью процедур, обсуждаемых ниже. Мономеры включают в себя (+) - катехин, (-)-эпикатехин и их соответствующие эпимеры (то есть, (-)-катехин и (+)-эпикатехин). Процианидины, обнаруженные в экстрактах какао, включают олигомеры от димеров до октадекамеров. Олигомеры могут быть неразветвленными или разветвленными. Неразветвленные 4→8 олигомеры имеют структуру:

где х представляет собой целое число от 0-16. Разветвленные олигомеры имеют структуру:

где а и b, независимо, являются целыми числами от 0-15.

Могут встречаться структурные варианты процианидиновых олигомеров с образованием вторичной внутрифлавоноидной связи при окислительном взаимодействии углерода и кислорода с образованием А-типа олигомеров, как показано ниже (Porter et "Flavons and Proanthocyanidins" глава два in "The Flavonoids», Ed., J.B. Harbome, Chapman и Hall Ltd., London, 1988; Porter в методах биохимии растений, том I. Plant Phenolics. Dey и Harbome, Eds; Academic Press: San Diego, Ca, 1989). Из-за сложности такого преобразования, А-тип проантоцианидинов нечасто встречается в виде олигомеров с одной связью:

По цвету какао-бобы можно разделить на четыре категории: преимущественно коричневые (полностью ферментированные), фиолетовые/коричневые и фиолетовые (частично ферментированные), и синевато-серые (неферментированные). Сухое вещество какао, используемое для максимальной экстракции процианидинов какао, предпочтительно получают из неферментированных или частично ферментированных какао-бобов (то есть, из синевато-серых или фиолетовых какао-бобов, из смеси синевато-серых и фиолетовых какао-бобов, из смеси фиолетовых и коричневых какао-бобов, или из смеси синевато-серых, фиолетовых и коричневых какао-бобов). Предпочтительнее, чтобы какао-бобы были синевато-серыми и/или фиолетовыми. Неферментированные какао-бобы имеют более высокое содержание полифенола какао, чем ферментированные какао-бобы (Kim Keeney J.Food Sci. 49 1090, 1984; Porter et al., «Cacao Procyanidins:Major Flavonoids and Identification of Some Minor Metabolites» Phytochemistry, том 30, № 51657-1663, 1991).

Содержание полифенолов в какао-бобах или их смеси выше, когда коэффициент ферментации бобов равен 275 или меньше. «Коэффициент ферментации» определяют, используя оценочную систему для характеристики ферментации бобов какао. Например, синевато-серые бобы оценивают как 1, фиолетовые бобы - 2, фиолетовые/коричневые бобы - 3 и коричневые бобы - 4. Процент бобов, попавших в каждую категорию, умножают на оценочный номер. Таким образом, «коэффициент ферментации» для образца со 100% коричневых бобов будет 100×4 или 400, тогда как для образца со 100% фиолетовых бобов он будет 100×2 или 200. Образец из 50% синевато-серых бобов и 50% фиолетовых бобов будет иметь коэффициент ферментации 150, то есть [(50×1) + (50×2)].

Неферментированные или частично ферментированные бобы какао предпочтительно содержат, по меньшей мере, 1 вес.% общих процианидинов какао, от веса обезжиренного сухого вещества какао, предпочтительно 3-7 вес.%, более предпочтительно 7-12% и наиболее предпочтительно 13-17%.

Способ получения какао-массы, подходящей для экстракции, описан в патенте США № 5554645(выдан 10 сентября 1996 Romanczyk и др.). Собранные «стручки» какао вскрывали и вынимали из них бобы с кожурой для сублимационной сушки. Из полученной после сублимационной сушки массы вручную удаляли кожуру, а бобы обрабатывали следующим образом: сначала с высушенных сублимацией бобов вручную снимали оболочку и перемалывали в мелкий порошок с помощью мельницы TEKMAR Mill, затем полученную массу обезжиривали до утра экстракцией Soxhlet, используя в качестве растворителя гексан двойной дистилляции. Из обезжиренной массы вакуумом удаляли остаточный растворитель при температуре окружающей среды. Альтернативно, какао-бобы сушили на солнце в условиях, задерживающих ферментацию, затем бобы сушили в машине и после этого удаляли оболочку.

Частично обезжиренный или обезжиренный материал какао с высоким содержанием полифенолов какао, то есть с высоким содержанием процианидинов какао, может быть получен обработкой какао-бобов или их частиц без стадии обжаривания, а затем измельчением бобов до тертого какао и извлечением частично обезжиренного сухого вещества какао, или посредством шнекового прессования обжаренных бобов или их частиц, получая частично обезжиренное сухое вещество какао. Если в данном процессе используется частично ферментированные какао-бобы, то можно получить еще большее содержание процианидинов. Этот способ сохраняет полифенолы какао, так как проводится без обычной стадии обжаривания. Способ предусматривает стадии: (а) нагревания какао-бобов до внутренней температуры, достаточной лишь для снижения содержания влаги до приблизительно 3 вес.% и растрескивания кожуры, обычно в инфракрасном нагревательном приборе в течение 3-4 минут: (b) провеивания (отделения бобов от кожуры воздухом) (с) шнекового прессования частиц какао и d) извлечения какао масла и частично обезжиренного сухого вещества какао, содержащего полифенолы какао, в том числе процианидины какао. Перед стадией нагревания какао-бобы, возможно, очищают, например, в плотностном сепараторе с псевдоожиженным (воздухом) слоем. Предпочтительно, какао-бобы нагревают до внутренней температуры боба от около 100°С до около 110°С, более предпочтительно до температуры менее чем около 105°С. Провеивание (отделение воздухом) также можно осуществлять в фракционном пневмосепараторе с псевдоожиженным слоем. Вышеописанный процесс нагревания какао-бобов для снижения влажности и растрескивания кожуры описан в патенте США № 6015913 (выдан 18 января 2000 года Kealey et al.).

Внутреннюю температуру боба (ВТБ) можно измерить, если наполнить бобами изолированный контейнер, например термос, вмещающий 80-100 бобов. Для поддержания температуры бобов после перемещения бобов из нагревательного прибора в термос, термос подходящим образом закрывали для поддержания в нем температуры образца. Внутрь заполненной бобами емкости вставляли термометр, при этом температура на термометре устанавливалась в зависимости от температуры бобов в термосе. Значение температуры соответствовало ВТБ. ВТБ может также рассматриваться как равновесная температура массы бобов.

В контексте данного описания применяются следующие термины: «высшие олигомеры» означают здесь процианидиновые олигомеры, от гексамеров до декамеров или выше, а «низшие олигомеры» означают процианидиновые олигомеры, от димеров и до пентамеров. «Экстракт какао», как используется здесь, представляет собой экстракт, содержащий смесь неустановленного состава, экстрагированную из молотых какао бобов, предпочтительно очищенных от кожуры путем суспендирования обезжиренного сухого вещества какао в растворителе или водном растворителе, и удаления сухих веществ какао для извлечения жидкого экстракта. Жидкий экстракт может быть высушен способами, известными специалистам в данной области.

Процесс экстракции предусматривает стадии: суспендирования частично обезжиренного или обезжиренного сухого вещества какао в соответствующем растворителе или водном растворителе для растворения полифенолов какао, отделения экстрагированных сухих веществ какао от фазы растворителя, например, центрифугированием, и, возможно, удаления растворителя(ей). Предпочтительно, экстракция представляет собой непрерывный процесс.

Используемый растворитель, предпочтительно пищевой, может быть растворителем, способным растворять мономеры эпикатехина и катехина и процианидиновые олигомеры какао, содержащиеся в сухом веществе какао. Предпочтительно, растворитель выбран из группы, состоящей из низших спиртов, таких как метанол, этанол и изопропанол; ацетатов, таких как метил или этилацетат; и ацетона. Растворители могут использоваться неразбавленными и в виде водных растворов. Неожиданно оказалось, что предпочтительные разведения растворителя водой отличаются в зависимости от используемого растворителя.

Подкисление растворителя или водного раствора растворителя до рН от около 2 до около 4 может либо повышать, либо снижать эффективность экстракции процианидинов в зависимости от используемого растворителя. Содержание или отсутствие 0,5% уксусной кислоты в растворителе или водном растворителе оказывает разное влияние на эффективность экстракции в зависимости от используемого растворителя и его концентрации. Кислота, используемая при экстракции, может быть любой неминеральной кислотой. Предпочтительными кислотами являются пищевые или физиологически приемлемые кислоты, такие как муравьиная кислота, лимонная кислота, фосфорная кислота и уксусная кислота. При проведении экстракции при высокой температуре, присутствие кислоты не является предпочтительным.

Из экстрактов какао могут быть удалены теобромин и кофеин, причем эти метилксантины могут быть извлечены и очищены. Выбор предпочтительного растворителя зависит от того, выбрасывают или извлекают теобромин. Если теобромин выбрасывают, то лучшим экстрагирующим растворителем является изопропанол при низкой температуре. Однако если теобромин должен извлекаться для очистки, то лучшим растворителем является этанол, а экстракцию удобно проводить при температуре от 50 до 70°. Для обеспечения эффективного и простого процесса получения из какао полифенольного экстракта без теобромина оптимальные условия для удаления метилксантинов должны быть сбалансированы с оптимальными условиями для экстракции процианидинов.

Альтернативно, метилксантины могут быть удалены из экстракта с помощью гелевой хроматографии, как описано в патенте США № 5554645 (Romanczyk и др., 10 сентября 1996). Вкратце, процесс частичной очистки проводят с использованием жидкостной хроматографии на Sephadex LH 20 (28×2,5 см). Разделению способствует ступенчатый градиент растворителя в деионизированной воде. Композиция с начальным градиентом представляет собой 15% метанол в деионизированной воде, за которым ступенчато, каждые 30 минут, следуют 25% метанол в деионизированной воде, 35% метанол в деионизированной воде, 70% метанол в деионизированной воде и, наконец, 100% метанол.

После элюирования кофеина и теобромина элюент собирали в общей фракции, которая представляла собой не содержащую алкалоидов ксантина подфракцию исходного экстракта.

Метилксантины могут быть также удалены из экстракта какао путем их адсорбирования на твердом адсорбенте, после чего экстракт, по существу свободный от кофеина и теобромина, промывают через адсорбент. В данном процессе могут использоваться различные твердые адсорбенты, такие как полимерные смолы и активированный уголь. Предпочтительно, адсорбент по существу нейтрален в воде. Примером нейтральной адсорбирующей смолы является полукальцинированная смола ХЕ-340 (производство Rohm & Haas). Нейтральный активированный уголь может быть получен либо кислотной промывкой термически активированного угля, а затем промывкой водой до нейтральности, либо нейтрализацией кислотно-активированного угля водным раствором щелочи, а затем промывкой водой до нейтральности.

Экстракция растворителем обезжиренного сухого вещества какао может проводиться либо периодически, либо непрерывно, предпочтительно непрерывно. При периодическом процессе экстракции полифенолов из сухого вещества какао требуется больше растворителя относительно твердой фазы. Кроме того, для экстракции всех доступных полифенолов какао, в том числе процианидинов, обычно требуется несколько последовательных экстракций. Предпочтительным методом экстракции является непрерывная противоточная экстракция. В этом процессе оптимальны эффективность экстракции и затраты на осуществление процесса, позволяя применять этот способ в промышленном масштабе. Использование непрерывного противотока растворителя через сухое вещество какао позволяет значительно снизить количество растворителя относительно твердой фазы, так как растворитель можно непрерывно рециркулировать. Кроме того, в результате непрерывного потока растворителя через сухое вещество какао, нет необходимости проводить двойную экстракцию растворителем или промывать сухое вещество водным растворителем, чтобы обеспечить полное экстрагирование процианидинов из сухого вещества какао.

Как будет показано ниже, эффективность экстракции процианидинов значительно варьирует в зависимости от используемого растворителя. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что некоторые растворители в основном экстрагируют высшие олигомеры, тогда как другие растворители лучше экстрагируют мономеры и низшие олигомеры. Тип используемого растворителя, находится он в водном растворе или нет, температура проведения экстракции и другие факторы могут повлиять на селективную экстракцию высоко - или низкомолекулярных процианидиновых олигомеров. Путем последовательного проведения экстракции одного и того же сухого вещества какао двумя разными растворителями, один из которых экстрагирует мономеры и низшие олигомеры, а другой экстрагирует высшие олигомеры, можно получить отдельные фракции процианидинов в течение одной процедуры экстракции без необходимости подвергать экстракт сложной обработке разделения высших и низших олигомеров. Таким образом, еще одним вариантом изобретения является процесс, благодаря которому можно селективно экстрагировать олигомеры из сухого вещества какао в промышленном масштабе с помощью одностадийного процесса, без дорогостоящего и сложного процесса хроматографического разделения олигомеров.

Эксперименты

Контрольный экстракт

В последующих примерах результаты всех экстракций растворителями сравнивали с контрольными экстрактами, полученными экстрагированием неферментированных обезжиренных какао-бобов, высушенных сублимацией, с использованием процедур, описанных в части А примера 1. Использованным растворителем была смесь 70% ацетона, 29,5% воды и 0,5% уксусной кислоты. Все водные растворы были выражены в % (об/об). Десять граммов обезжиренной массы какао суспендировали в 100 мл этой смеси растворителей и обрабатывали ультразвуком в течение 5-10 минут при 50°С. Жидкий раствор центрифугировали в течение 15 минут при 4°С при 3000×g и надосадочную жидкость фильтровали через стекловату. Выход неочищенных процианидинов составил от 15 до 20%.

Разделение и количественная оценка олигомеров процианидина

В последующих примерах для разделения и количественной оценки по степени полимеризации мономеров и олигомеров процианидина в экстрактах какао использовались описываемые ниже аналитические способы. Способ, описанный ниже для идентификации олигомеров процианидина