Способ получения l-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia

Способ получения l-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислоты методом ферментации, и более конкретно, к генам, положительно влияющим на результат данной ферментации. Данные гены важны для улучшения продукции L-аминокислоты, например, для продукции L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана и L-глутаминовой кислоты.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например трансформация микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по типу обратной связи (см., например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации, в том числе штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; европейский патент ЕР0219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ WO 01/14525 A1, европейская заявка ЕР 301572 А2, патент США 5376538), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).

В настоящее время известный штамм ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5705371) является одним из лучших продуцентов треонина. Для создания штамма ВКПМ В-3996 в родительский штамм Е.coli K-12 (ВКПМ В-7) были введены несколько мутаций и плазмида, описанная ниже. Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназагомосериндегидрогеназу I и устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, результатом чего является пониженный уровень биосинтеза изолейцина и фенотип с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактериях с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, поэтому такие штаммы очень эффективны для продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигает 85 г/л.

Для оптимизации основного пути биосинтеза желаемого соединения дальнейшее улучшение штаммов-продуцентов L-аминокислоты может быть осуществлено путем снабжения бактерии повышенными количествами сахаров в качестве источников углерода, например глюкозы. Несмотря на эффективность транспорта глюкозы системой PTS, доступность источника углерода у высокопродуктивного штамма может быть недостаточной.

Известно, что активный транспорт сахаров и других метаболитов в бактериальные клетки осуществляется при помощи нескольких транспортных систем.

Среди известных транспортных систем для утилизации L-арабинозы используются две индуцируемые транспортные системы. Низкоспецифичная пермеаза (К_м примерно 0.1 мМ) кодируется геном araE, расположенным на 61.3 минуте, и высокоспецифичная система (К_м - от 1 до 3 мкМ) кодируется опреоном araFG, расположенным на 44.8 минуте хромосомы Е.coli. Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислот) с функцией рецептора хемотаксиса, а локус araG кодирует как минимум один белок, расположенный на внутренней стороне мембраны. Как высоко-, так и низкоспецифичная системы транспорта находятся под контролем продукта гена araC и, таким образом, являются частью регулона ara (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Исследования в мембранных везикулах показали, что пермеаза L-арабинозы может транспортировать L-арабинозу с низкой эффективностью (140-320 мкМ), и что транспорт арабинозы сопряжен с транспортом протонов (Daruwalla, K.R. et al., Biochem. J., 200(3); 611-27 (1981)). Пермеаза L-арабинозы является членом Major Facilitator Superfamily (MFS) транспортеров (Griffith, J.K. et al., Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95 (1992)). Поглощенная арабиноза катаболизируется в ксилулозо-5-фосфат группой ферментов, кодируемых опероном araBAD, и далее через пентозо-фосфатный путь (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Тем не менее, в настоящее время нет сообщений, описывающих использование бактерии семейства Enterobacteriaceae с повышенной активностью пермеазы L-арабинозы для повышения продукции L-аминокислот.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлена структура хромосомной области Е.coli перед геном araE и структура интегрированного фрагмента ДНК, содержащего ген cat и гибридный промотор P_L-tac.

Фиг.2 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей пермеаз арабинозы Escherichia coli (Ec), Shigella flexneri (Sf), Salmonella typhimurium (Sf), Klebsiella oxytoca (Ко) и Bacillus sublilis (Bs). Выравнивание производилось с использованием программы множественного выравнивания PIR Multiple Alignment (http://pir.georgetown.edu). Идентичные аминокислоты помечены звездочкой (*), похожие аминокислоты помечены двоеточием (:).

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматических или ароматических L-аминокислот с использованием указанных штаммов.

Данные цели были достигнуты путем обнаружения того факта, что повышение экспрессии гена araE, кодирующего пермеазу арабинозы, может повысить продукцию L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан и L-глутаминовая кислота.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы в этой бактерии повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активность указанной пермеазы L-арабинозы повышена путем усиления экспрессии гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активность указанной пермеазы L-арабинозы повышена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы, таким образом, что экспрессия указанного гена повышена, или путем увеличения количества копий указанного гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что активность глюкокиназы в ней повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что активность изомеразы ксилозы в ней повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из родов Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella и Morganella.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой вышеупомянутый ген кодирует пермеазу L-арабинозы, выбранную из группы, состоящей из:

(A) белка, включающего в себя аминокислотную последовательность, представленную в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); и

(B) варианта белка с аминокислотной последовательностью, представленной в Списке последовательностей под номером 2 SEQ ID NO:2, который обладает активностью пермеазы L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой вышеупомянутый ген, кодирующий пермеазу L-арабинозы, включает в себя ДНК, выбранную из группы, состоящей из:

(a) ДНК, которая включает в себя нуклеотидную последовательность с 1 по 1419 нуклеотид, представленную в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1);

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью с 1 по 1419 нуклеотид, представленной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, и кодирует белок, обладающий активностью премеазы L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанные жесткие условия включают в себя такие условия, когда отмывка производится при 60°С и концентрации солей 1×SSC и 0.1% SDS в течение 15 минут.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-треонина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия далее модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, и устойчивого к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок.

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-лизина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-гистидина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-фенилаланина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-глутаминовой кислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, что приводит к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-треонин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-лизин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-гистидин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-фенилаланин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-аргинин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотойа является L-триптофан.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Согласно настоящему изобретению, «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, когда указанная бактерия выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее, чем 1.0 г/л. Термин "L-аминокислоты" включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан и L-глутаминовая кислота.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella и т.д. В частности, могут быть использованы бактерии, классифицированные как относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (Национальный Центр Биотехнологической Информации - National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Примеры микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя штамм семейства Enterobacteriaceae, обладающий способностью к продукции L-аминокислоты и модифицированный таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы в нем повышена. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя штамм семейства Enterobacteriaceae, обладающий способностью к продукции L-аминокислоты и не имеющий природной активности пермеазы L-арабинозы, который трансформирован фрагментом ДНК, кодирующим пермеазу L-арабинозы.

Термин "активность пермеазы L-арабинозы" означает активность транспорта сахаров, таких как L-арабиноза и L-глюкоза, в клетку. Активность пермеазы L-арабинозы может быть обнаружена и измерена с помощью метода, описанного у Henderson P.J. и Macpherson A.J. (Methods Enzymol., 125, 387-429 (1986)).

Термин "модифицирована таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы повышена" означает, что удельная активность указанного белка в указанной бактерии выше, чем у немодифицированного штамма, например природного. Примеры такой модификации включают увеличение количества молекул пермеазы L-арабинозы на бактериальную клетку, повышение специфической активности молекулы пермеазы L-арабинозы и так далее. Кроме того, природный штамм, используемый для сравнения, включает, например, штамм Escherichia coli К-12. Согласно настоящему изобретению, в результате повышения внутриклеточной активности пермеазы L-арабинозы может быть повышено количество накопленной в культуральной жидкости L-аминокислоты, например L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты.

Повышение в бактериальной клетке активности пермеазы L-арабинозы может быть достигнуто за счет усиления экспрессии гена araE, кодирующего пермеазу L-арабинозы. В качестве гена пермеазы L-арабинозы согласно настоящему изобретению могут быть использованы: любой ген araE, полученный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, также как и любой ген araE, полученный из других бактерий, таких как бактерии, принадлежащие к родам Bacillus, Klebsiella, Pantoea, Salmonella или Shigella. Гены araE, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, предпочтительны.

Термин "усиление экспрессии гена" означает, что экспрессия данного гена выше, чем у немодифицированного штамма, например природного. Примеры такой модификации включают увеличение количества копий экспрессируемого гена(ов) в бактериальной клетке, повышение уровня экспрессии гена(ов) и так далее. Количество копий экспрессируемого гена можно измерить, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК с последующей гибридизацией по Саузерну с использованием зонда, синтезированного на основе нуклеотидной последовательности указанного гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и подобных им. Уровень экспрессии гена может быть измерен с помощью известных методов, включающих Нозерн блоттинг, количественный обратный ПЦР (RT-PCR) и подобные им. Кроме того, природные штаммы, которые можно использовать в качестве контроля, включают, например, штамм Escherichia coli К.-12 или штамм Pantoea ananatis FERM ВР-6614. В результате повышения внутриклеточной активности пермеазы L-арабинозы наблюдается накопление в питательной среде L-аминокислоты, например L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты.

Ген araE, кодирующий пермеазу L-арабинозы, а именно симпортер L-арабинозы/протона, из Escherichia coli уже известен (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 2978786 по 2980204 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank; gi:49175990). Ген araE расположен между открытой рамкой считывания ydeA и геном kduD на хромосоме Е.coli К-12. Также известны другие гены araE, кодирующие пермеазу L-арабинозы: ген araE из Shigella flexneri (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 2935806 по 2937224 в последовательности с инвентарным номером NP_838353.1 в базе данных GenBank; gi:30064182); ген araE из Salmonella typhimurium LT2 (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 3175802 по 3177220 в последовательности с инвентарным номером NP_461933.1 в базе данных GenBank; gi:16766318), ген araE из Klebsiella oxytoca (локус Р45598; gi:1168483) и подобные им. Ген araE из Escherichia coli согласно настоящему изобретению представлен последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1).

При транспортировке в клетку глюкоза фосфорилируется с помощью глюкокиназы, кодируемой геном glk. Следовательно, также желательно модифицировать указанную бактерию таким образом, чтобы активность глюкокиназы в ней была повышена. Ген glk, кодирующий глюкокиназу из Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 2506481 по 2507446 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank; gi:16127994). Ген glk расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между открытыми рамками считывания b2387 и b2389.

При соответствующих условиях изомераза ксилозы, кодируемая геном xylA, также эффективно катализирует превращение D-глюкозы в D-фруктозу (Wovcha, M.G. et al., Appi Environ Microbiol. 45(4): 1402-4 (1983)). Следовательно, также желательно модифицировать указанную бактерию таким образом, чтобы активность изомеразы ксилозы в ней была повышена. Ген xylA, кодирующий изомеразу ксилозы из Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 3728788 по 3727466 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990). Ген xylA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами xylB и xylF.

Таким образом, гены araE, glk и xylA могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе известной нуклеотидной последовательности данных генов. Гены, кодирующие пермеазу L-арабинозы из других микроорганизмов, могут быть получены сходным образом.

Ген araE, полученный из Escherichia coli, представлен ДНК, которая кодирует следующие белки (А) или (В):

(А) белок, аминокислотная последовательность которого представлена в последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); или

(В) вариант белка, аминокислотная последовательность которого представлена в аминокислотной последовательности под номером 2 (SEQ ID NO:2) и который обладает активностью пермеазы L-арабинозы.

Используемый в настоящем изобретении термин "вариант белка" обозначает белок, с изменениями в аминокислотной последовательности, будь то делеции, вставки, добавки либо замены аминокислот, но при этом сохраняет полезный уровень желаемой активности, например полезный для повышения продукции L-аминокислоты. Количество аминокислотных изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). Такие изменения в вариантах могут иметь место в областях белка, не критичных для его функционирования. Это связано с тем, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, поэтому такие изменения не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка или его активности. Эти изменения в варианте белка имеют место в областях белка, которые не критичны для его функционирования. Таким образом, вариант белка (В) может быть представлен белком с гомологией не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности пермеазы L-арабинозы, приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), до тех пор, пока сохраняется активность пермеазы L-арабинозы. Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с помощью хорошо известных способов, например компьютерной программы BLAST 2.0, которая учитывает три параметра: счет, идентичность и схожесть.

Для того, чтобы сохранялась активность белка, замены, делеции, вставки или добавки одного или нескольких аминокислотных остатков в указанном белке должны являться консервативной мутацией(ями). Пример консервативной мутации - это консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Туг, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.

Ранее было показано, что транспортеры сахаров MFS, такие как D-ксилоза/Н+симпортер (XylE), Е-арабиноза/Н+симпортер (AraE) и D-галактоза/Н+симпортер (GalP), обладают высокой гомологией, выравнивания этих белков имеют минимум 28% идентичных консервативных аминокислотных остатков (Henderson, P.J. and Maiden M.C., Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci., 30, 326 (1236), 391-410 (1990)). Сравнение аминокислотных последовательностей пермеазы арабинозы из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca и Bacillus subtilis также демонстрирует высокую степень гомологии между указанными белками (смотри Фиг.2). С этой точки зрения замены или делеции аминокислотных остатков, идентичных во всех вышеупомянутых белках, могут серьезно повлиять на их функции, в то время как модификации других неконсервативных аминокислотных остатков могут не приводить к изменению активности пермеазы L-арабинозы.

ДНК, которая кодирует практически такой же белок, как описанная выше пермеаза L-арабинозы, может быть получена, например, модификацией нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей пермеазу L-арабинозы (SEQ ID NO:1), например, при помощи сайт-направленного мутагенеза, включающего в себя делецию, замену, вставку или добавку одного и более аминокислотного остатка в специфическом сайте указанного белка. Описанная выше модифицированная ДНК может также быть получена традиционным мутагенезом. Такие способы могут включать обработку гидроксиламином ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, УФ-излучением или химическими веществами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как пермеаза L-арабинозы, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации в подходящей клетке, и изучения активности любого экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как пермеаза L-арабинозы, также может быть получена путем выделения ДНК (из геномной ДНК), которая гибридизуется в жестких условиях с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность 1 (SEQ ID NO:1), которая кодирует белок, обладающий активностью пермеазы L-арабинозы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие гомологией менее 50%, не гибридизуются друг с другом. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для гибридизации и, как правило, от рекомендаций изготовителя. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1 (SEQ ID NO:1). Зонд подобного рода может быть получен в результате ПНР с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1 (SEQ ID NO:1), в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.

Замены, делеции, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, ввиду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих пермеазу L-арабинозы.

«Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок» означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами. Трансформация указанной ДНК приводит к увеличению экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к увеличению активности указанного белка в клетке бактерии. Способы трансформации бактерии включают все опубликованные на сегодняшний день способы. Например, может быть использован способ обработки клеток-реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

Методы увеличения экспрессии гена включают в себя методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Используемый здесь термин «низкокопийный вектор» используется для векторов, количество которых не превышает 5 копий на клетку.

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосому бактерии, например методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Mu интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до 3 копий интегрируемого гена.

Увеличение числа копий гена пермеазы L-арабинозы может быть также достигнуто путем введения множественного числа копий гена пермеазы L-арабинозы в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена пермеазы L-арабинозы в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве мишеней последовательностей, присутствующих в нескольких копиях в хромосомной ДНК. Последовательности, присутствующие в хромосомной ДНК в нескольких копиях, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Так же, как это описано в патенте США 5595889, возможно ввести ген пермеазы L-арабинозы в транспозон, для последующей переноса с целью введения множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Также увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного на хромосоме после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт-кодону (Gold et al., Annu. Rev.Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J, 3, 623-629, 1984). Предварительно было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, экспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена пермеазы L-арабинозы в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO 00/18935 или патентной заявке Японии №1-215280.

Методы получения плазмидной ДНК включают, но не ограничиваются ими, разрезание и лигирование ДНК, трансформацию, выбор олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им или другие методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма, используемого для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены штаммами-продуцентами треонина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/p VIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген IlvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит также мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105, Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913,2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания yaaX. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназугомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40