Способ получения мясного продукта

Способ получения мясного продукта

Реферат

Изобретение относится к пищевой промышленности и касается способа получения мясного продукта заданного качества и формы.

Изобретение включает в себя выделение мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас и их выращивание на поддерживающем каркасе при воздействии двух видов электрического тока.

Техническим результатом является сокращение сроков получения мясного продукта за счет ускорения процесса удвоения клеточной популяции.

Технический результат достигается за счет того, что мясной продукт получают выделением мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посевом таких клеток на поддерживающий каркас и их выращиванием на поддерживающем каркасе при воздействии переменного тока высокой частоты напряженностью 500-800 В/см 1-10 раз через каждые 20-40 минут, а затем под действием электрических импульсов с продолжительностью импульса менее 1 с при значениях градиента напряжения 1-6 кВ/см, приводящих к разрушению 1-5% клеток.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение долгого времени in vitro и широким спектром дифференцировки. В связи с этим особое внимание уделяется способам изоляции МСК из тканей организма, однако универсального метода их получения до сих пор нет.

Впервые мезенхимальные стволовые клетки были получены из костного мозга по своей способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92).

Изобретение позволяет получать пищевой продукт, состоящий из скелетных миобластных клеток и фибробластных клеток, в которых соотношение фибробластов и миобластов может меняться и составлять 1:(1-2) соответственно.

Клетки, которые можно принимать в качестве пищевого продукта, включают скелетные миобласты и фибробласты. Клетки согласно настоящему изобретению, могут происходить от любого вида сельскохозяйственных животных с полной гарантией биобезопасности.

Клетки, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут происходить от доноров любого возраста, и могут быть клетками взрослого организма, клетками новорожденного, эмбриональными клетками, эмбриональными стволовыми клетками или мышечными клетками, происходящими из эмбриональных стволовых клеток.

Что касается воздействия электрического тока на клетки, то из уровня техники известно следующее.

Известно воздействие электрического тока на растительные клетки. Это приводит к интенсификации прессового способа извлечения сока из растительного сырья. Суть этого явления, которое называется электроплазмолизом, сводится к следующему: выход сока из растительного сырья зависит от первоначальной степени проницаемости протоплазменной оболочки и от способности последней противостоять внешним воздействиям в процессе предварительной обработки и прессования. Поэтому любые внешние воздействия, направленные на повреждение протоплазмы и увеличение ее проницаемости, приводят к повышению сокоотдачи. Известно, что при предварительной обработке растительного сырья переменным током с напряжением 220 В происходит практически мгновенная гибель протоплазмы, при этом клеточная проницаемость увеличивается и отделение сока при следующем прессовании возрастает.

Что касается действия электрического тока на клетки микроорганизмов, то известен способ разрушения клеток микроорганизмов при воздействии на них электрическим зарядом в электрически напряженной жидкой среде посредством приложения электрического тока с помощью электрода при условии, что электрод не контактирует с клетками. При этом клеточные оболочки у 99% микроорганизмов разрывались (патент RU 2108113).

О влиянии электрического тока на животные клетки известно следующее. Из патента США 6835390, опубликованного 28.12.2004, известно получение мясного продукта культивированием нечеловеческих мышечных клеток с последующим посевом их на поддерживающую структуру и выращиванием на ней. При этом на мышечные клетки могут дополнительно воздействовать электрическим током. Однако в данной публикации не указаны конкретные параметры тока. Воздействие током способствует накоплению мышечной массы в культуре клеток. Мышечные клетки, выращенные in vitro, отличаются от клеток, выращенных in vivo, поскольку не подвергались физической нагрузке. А воздействие электрического тока способствует сокращению мышц, имитируя физическую нагрузку, что позволяет в условиях in vitro ускорить рост клеток.

Авторами настоящего изобретения установлено, что при действии тока с определенными параметрами, у некоторых клеток разрушаются клеточные оболочки. Эти явления в зависимости от параметров тока называют электроплазмолизом или электростимуляцией. Но при этом разрушению подвергается только 1-5% всех клеток. Остальные клетки сохраняют свою целостность. Оказалось, что при возбуждении в среде импульсного электрического поля происходит пробой цитоплазматической мембраны 1-5% клеток. После окончания действия тока целостность мембраны не восстанавливается и содержимое клетки поступает в среду. При этом рост остальных клеток увеличивается в несколько раз за счет поступивших в среду питательных веществ клетки, которые проявляют себя как стимуляторы роста.

До электростимуляции и электроплазмолиза на клетки воздействовали переменным током с частотой 1-5 МГц от 1 до 10 раз через каждые 20-40 минут. Это приводит к тому, что под воздействием высокочастотного поля клетки располагаются по направлению силовых линий. Это явление диэлектрофореза (движения частиц в электрическом поле) объясняется наличием разницы диэлектрической проницаемости дисперсной фазы и дисперсионной среды и зависит от величины заряда на клетке. Однородное электрическое поле создает силу, воздействующую на любые поляризуемые объекты, заряженные и незаряженные. При диэлектрофорезе частицы или клетки демонстрируют взаимное притяжение с образованием линейных цепочек типа "жемчужных бус". Это позволяет в конечном итоге получить мясной продукт заданной конфигурации. В случае неоднородного (дивергентного) поля имеет место движение клеток в сторону минимальной напряженности поля, что вызывает их концентрацию.

Воздействие переменным током высокой частоты начинали при образовании монослоя.

Опытным путем авторами настоящего изобретения было обнаружено, что наибольший рост клеток наблюдается при 1-3-кратном воздействии электрических импульсов с продолжительностью импульса менее 1 с при значениях градиента напряжения 1-6 кВ/см. Причем длительность обработки составляет 60 с, а обработку начинают через 2-3 часа после обработки клеток высокочастотным полем.

Если же воздействовать электрическими импульсами более 3 раз (4 и выше), то происходит разрушение большего числа клеток (6 и более %) и в таком случае не происходит столь интенсивного накопления клеточной массы.

Таким образом, настоящее изобретение включает комбинацию воздействия переменного тока высокой частоты с воздействием электрических импульсов.

Для выделения мышечных клеток авторы настоящего изобретения использовали стандартные методы (например, US 6835390). Мышечные клетки выделяли из донорской мышечной ткани сельскохозяйственных животных, используя стандартные методы, включая энзиматическое диспергирование. Например, для получения миобластов в начале получали мышечные клетки из мускул задней конечности. Ткань помещали в среду переваривания, содержащую коллагеназу и трипсин, измельчали на кусочки хирургическими ножницами. Дальнейшее измельчение биоптатов проводили путем пипетирования через иглу с помощью шприца. Высвободившиеся клетки собирали. Процедуру повторяли несколько раз для максимального выхода миобластов. Собранные клетки объединяли и использовали для накопления клеточной массы как описано ниже.

В настоящем изобретении клетки до получения пищевых композиций размножаются in vitro, с целью накопления необходимой клеточной массы. Характерным свойством настоящего изобретения является использование популяции (т.е. группы из двух и более клеток) мышечных клеток для получения пищевой композиции. Мышечные клетки настоящего изобретения должны расти как клеточная культура, т.е. как популяция клеток, которая растет in vitro, в соответствующей среде, поддерживающей рост клеток до использования в качестве пищевой композиции.

Варианты сред могут варьироваться.

Среда, используемая для обеспечения пролиферации мышечных клеток, и среда, используемая для поддержания мышечных клеток, могут различаться. Наиболее приемлемая ростовая среда: MCDB 120 + дексаметазон (0,39 мг/мл) + эпидермальный ростовой фактор (ЭРФ) (10 нг/мл) + эмбриональная сыворотка (ЭС) - 15%. Наиболее приемлемая поддерживающая среда: DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки (ЛС).

Сыворотка играет большую роль в прикреплении, пролиферации и дифференцировке клеток. Концентрация сыворотки в среде может достигать 15%. Кроме сыворотки в состав среды могут входить такие синтетические среды как F10 или DMED, а также эмбриональный экстракт (0,5-1%) и экстракт стрептококка.

Ростовая среда может быть также бессывороточной.

В состав среды может входить также одно или несколько веществ, обладающих антиоксидантными свойствами. Например, витамин (в виде стабильной формы фосфата аскорбиновой кислоты L-аскорбат-2-фосфат или в любой другой форме). Кроме того, эффективным антиоксидантом в составе культуральной среды может быть N-ацетил-L-цистеин, который является предшественником L-цистеина и который связан с внутриклеточным синтезом глутатиона, выполняющим антиоксидантную функцию. Другими антиоксидантами, которые могут входить в состав культуральной среды, являются витамин Е (D-альфа-токоферол), ресвератол (растительный фитоалексин, входящий в состав винограда), конэнзим Q, альфа-липоевая кислота, ликопин, биофлаваноиды и квирсетин. Фосфат аскорбиновой кислоты используется в концентрациях от 20 мкМ до 2 мМ, N-ацетил-L-цистеин - в концентрации от 20 мкМ до 2 мМ.

Также подходящей культуральной средой является модифицированная среда MCDB 153, содержащая низкую концентрацию кальция, который необходим для роста мезенхимальных стволовых клеток и клеток предшественников до индукции процессов дифференциации. Среда также может быть обогащена L-аскорбатом-2-фосфатом и N-ацетил-L-цистеином.

Такая культуральная среда имеет состав, который предупреждает и замедляет процесс дифференцировки зрелых стволовых клеток. Высокая концентрация кальция в культуральной среде является самым благоприятным фактором для дифференциации клеток. Это было установлено в работах Rheinwald et al. (1975) Cell 6: 331-43 и Yuspa et al. (1981) Nature 293: 72-74, где разрабатывалась методика получения зрелых клеток кожи из эпидермальных кератиноцитов. В отличие от известного настоящее изобретение включает среду с относительно низким содержанием кальция, что помогает предупредить дифференцировку стволовых клеток. Обычные питательные среды содержат ионы кальция в концентрации 1,8 мМ. Среда с низкоионным содержанием кальция может иметь концентрацию кальция ниже 0,9-0,1 мМ. Наиболее предпочтительно - в пределах 0,1-0,09 мМ. Ионы кальция могут входить в состав среды в виде двухкомпонентных солей, таких как хлорид кальция (CaCl), углекислый кальций (СаСО) или сульфат кальция (CaSO).

Клетки могут расти на поддерживающих каркасах, которые могут быть различной конфигурации и различных размеров. Это позволяет придать необходимую форму производимому мясному продукту. Такие каркасы могут быть изготовлены как из натуральных, так и из синтетических материалов. Предпочтительными являются каркасы, изготовленные из коллагена, фибронектина, ламинина или синтетических материалов, таких как альгинат, политимидиловая или полиуридиловая кислота. Такие каркасы известны из уровня техники и описаны в патентах US 5686091, US 5863984, US 5916265. Также в качестве каркасов могут быть использованы губки, полученные из плазмы крови животных, с высокоразвитой поверхностью. При этом процесс структурирования губки и роста клеток может идти одновременно.

Время культивирования in vitro может составлять максимально 14 дней, но предпочтительно - 7 дней. За это время может происходить удвоение клеточной популяции от 2 до 10 раз. Желательно 5-кратное удвоение клеточной популяции. При этом устанавливается соотношение миобластов к фибробластам как 1:2-1:1.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой способ получения мясного продукта, включающий выделение мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас и их выращивание на поддерживающем каркасе при воздействии высокочастотного поля для получения заданной конфигурации готового продукта, а затем 1-3-кратное воздействие электрическими импульсами с продолжительностью импульса менее 1 с при значениях градиента напряжения 1-6 кВ/см, приводящее к разрушению 1-5% клеток.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1.

Кусочки мышечной ткани коровы измельчали до размера 0,5 мм, обрабатывали раствором трипсина (0,25%-ный раствор) или раствором коллагеназы (0,1%-ный раствор). Полученные клетки собирали и выращивали на среде, содержащей F10 - 83%, 15% лошадиной сыворотки, экстракт стрептококка - 1%, 0,5% эмбрионального экстракта цыплят, N-ацетил-L-цистеин - 0,5%.

Клетки высеивают в подходящие по размеру культуральные матрасы, которые покрыты натуральным биоматериалом, таким как коллаген, определенной конфигурации (в зависимости от желаемого размера получаемого продукта).

Инкубировали при 37°С в атмосфере с 5%-ным CO₂.

После того как все клетки прикрепились, поменяли среду.

После образования монослоя (80%) на клетки воздействуют электрическим током напряженностью 600 В/см с частотой 2 МГц в течение 20 с, а затем через 40 минут повторяют операцию.

Через 2 часа воздействуют электрическим импульсом с продолжительностью импульса 0,6 с при значениях градиента напряжения 2 кВ/см. Причем длительность обработки составляет 60 с.

Через 15 минут проводят повторную обработку электрическими импульсами с продолжительностью импульса 0,6 с при тех же значениях градиента напряжения. При этом длительность обработки не изменяется.

Одновременно с проведением данного эксперимента проводят контрольный эксперимент, который отличается от описанного выше тем, что не проводится обработка электрическими импульсами.

Поскольку во взятом за прототип патенте не указаны конкретные параметры тока, не приведено время воздействия на клетки, то авторам настоящего изобретения не представляется возможным провести сравнительные опыты согласно настоящему изобретению и прототипу. Поэтому для сравнения авторами настоящего изобретения был осуществлен процесс получения мясного продукта без обработки клеток электрическими импульсами.

При сравнении мясного продукта, полученного согласно изобретению и мясного продукта, полученного в качестве контроля, оказалось, что время удвоения клеток согласно изобретению уменьшилось в 1,5 раза по сравнению с контролем.

При этом трансформации клеток не происходит.

При этом также клетки могут делиться на протяжении 15-25 циклов in vitro, сохраняя свои характерные признаки, до получения пищевого продукта.

Пример 2.

Выделение мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас проводили аналогично примеру 1.

После образования монослоя на клетки воздействуют электрическим током напряженностью 500 В/см с частотой 5 МГц в течение 15 с, а затем через каждые 30 минут повторяют операцию в течение 3 раз.

Через 2,5 часа после окончания воздействия высокочастотным полем воздействуют электрическим импульсом с продолжительностью импульса 0,6 с при значениях градиента напряжения 3 кВ/см. Причем длительность обработки составляет 40 с.

В данном случае повторную обработку электрическими импульсами не проводят.

Одновременно с проведением данного эксперимента проводят контрольный эксперимент, который отличается от описанного выше тем, что не проводится обработка электрическими импульсами.

При сравнении мясного продукта, полученного согласно изобретению, и мясного продукта, полученного в качестве контроля, оказалось, что время удвоения клеток согласно изобретению уменьшилось в 1,6 раза по сравнению с контролем.

При этом трансформации клеток не происходит.

При этом также клетки могут делиться на протяжении 15-25 циклов in vitro, сохраняя свои характерные признаки, до получения пищевого продукта.

Пример 3.

Выделение мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас проводили аналогично примеру 1.

После образования монослоя на клетки воздействуют электрическим током напряженностью 800 В/см с частотой 2 МГц в течение 15 с, а затем через каждые 20 минут повторяют операцию в течение 6 раз.

Через 3 часа после окончания воздействия высокочастотным полем воздействуют электрическим импульсом с продолжительностью импульса 0,6 с при значениях градиента напряжения 2 кВ/см. Причем длительность обработки составляет 50 с.

Через 15 минут проводят повторную обработку электрическими импульсами с продолжительностью импульса 0,6 с при тех же значениях градиента напряжения. При этом длительность обработки не изменяется.

Через 15 минут после окончания повторной обработки проводят еще одну обработку электрическими импульсами при тех же условиях.

Одновременно с проведением данного эксперимента проводят контрольный эксперимент, который отличается от описанного выше тем, что не проводится обработка электрическими импульсами.

При сравнении мясного продукта, полученного согласно изобретению, и мясного продукта, полученного в качестве контроля, оказалось, что время удвоения клеток согласно изобретению уменьшилось в 1,6 раза по сравнению с контролем.

При этом трансформации клеток не происходит.

При этом также клетки могут делиться на протяжении 15-25 циклов in vitro, сохраняя свои характерные признаки, до получения пищевого продукта.

1. Способ получения мясного продукта, включающий выделение мезенхимальных клеток сельскохозяйственных животных, посев таких клеток на поддерживающий каркас и их выращивание на поддерживающем каркасе под действием электрического поля, отличающийся тем, что при образовании монослоя на каркасе воздействуют переменным током напряженностью 500-800 В/см с частотой 1-5 МГц в течение 15-20 с 1-10 раз через каждые 20-40 мин, а затем электрическими импульсами с продолжительностью импульса менее 1 с при значениях градиента напряжения 1-6 кВ/см, приводящими к разрушению 1-5% клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве поддерживающего каркаса используют губки, полученные из плазмы крови животных путем структурирования.