Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты)

Бактерия - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислоты методом ферментации с использованием микроорганизма. Настоящее изобретение, в частности, относится к способу получения таких L-аминокислот, как L-лизин, L-аргинин, L-орнитин, L-гистидин, L-изолейцин, L-треонин, L-пролин, L-фенилаланин, L-цистеин и L-глутаминовая кислота. Они представляют собой L-аминокислоты, применяемые в промышленности. В частности, L-лизин, L-треонин, L-изолейцин и L-пролин пригодны для использования в качестве добавок к кормам для животных, в качестве компонентов оздоровительной пищи и для инфузии аминокислот. L-аргинин и L-орнитин пригодны для использования в качестве агентов, улучшающих работу печени, для инфузии аминокислот, и в качестве компонентов комплексных препаратов аминокислот L-гистидин пригоден для использования в качестве средства, улучшающего работу печени и в качестве предшественника гистамина. L-фенилаланин пригоден для использования в качестве предшественника подсластителей.

Уровень техники

L-аминокислоты получают в промышленных масштабах методом ферментации с использованием микроорганизмов, которые относятся к роду Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia и т.п.

Способы получения L-лизина описываются в ЕР 0857784А, JP 11-192088A, WO 00/53726 и WO 96/17930. Способы получения L-аргинина описываются в ЕР 0999267А, ЕР 1170358А и JP 2002-017342А. В указанных описанных способах используют штаммы бактерий-продуцентов основных L-аминокислот, в том числе штаммы, выделенные из природных источников или их искусственно мутированные штаммы, а также рекомбинантные штаммы, которые обладают повышенной активностью фермента биосинтеза основных L-аминокислот.

Кроме того, сообщается (WO 00/61723 и JP 2001-120269А) о способах получения L-аминокислот из метанола, который доступен для проведения ферментации в больших количествах по низкой цене, с использованием мутированных штаммов или генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, которые относятся к роду Methylophilus или Methylobacillus.

Известно, что методы модифицирования включения или экспорта L-аминокислот клетками бактерий улучшают способность бактерий продуцировать L-аминокислоты. Методы модифицирования захвата L-аминокислот предусматривают исключение или снижение захвата L-аминокислот клетками, с целью повышения способности продуцировать L-аминокислоты. В частности, указанные методы включают метод удаления оперона gluABCD или его части, с тем, чтобы устранить или ослабить включение L-глутаминовой кислоты (ЕР 1038970А).

Методы модифицирования экспортера включают метод исключения или снижения экспорта промежуточного соединения или субстрата при биосинтезе L-аминокислот и метод усиления экспорта продуцированной L-аминокислоты. В качестве метода исключения или снижения экспорта промежуточного соединения при биосинтезе L-глутаминовой кислоты известен способ мутации или разрушения гена α-кетоглутаратпермеазы, с целью снижения экспорта α-кетоглутаровой кислоты (WO 01/005959).

В качестве метода усиления экспорта L-аминокислот был предложен способ активации lysE (гена-экпортера основных L-аминокислот; J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1999 Nov; 1 (2): 327-36) в штамме бактерии Corynebacterium, которая, как известно, продуцирует L-лизин (WO 97/23597) или L-аргинин (патентная публикация США 2003-0113899). Известен также способ увеличения экспрессии генов rhtA, B, C (JP 2000-189177A) и yfiK, гена yahN (EP 1016710A), которые, как полагают, вовлекаются в экспорт L-аминокислот, в клетках бактерии Escherichia.

В качестве гена для экспорта основных L-аминокислот известен вышеуказанный ген lysE. Однако в том случае, когда ген lysE амплифицируют в ассимилирующих метанол бактериях, таких как бактерия Methylophilus, а полученный штамм используют для получения L-лизина или L-аргинина, то ген lysE дикого типа, выделенный из бактерии Coryneform, является смертельным для бактерии Methylophilus, и поэтому необходимо вводить мутантный ген lysE (ЕР 1266966А), который позволяет расти микроорганизму-хозяину. Таким образом, ген lysE не всегда работоспособен при экспорте L-лизина или L-аргинина в том случае, когда его вводят в гетерогенные микроорганизмы. По этой причине желательно получить ген для экспорта и продуцирования L-аминокислот, который обладает способностью секретировать значительные количества L-аминокислот, в том числе L-лизина или L-аргинина, в различных гетерогенных микроорганизмах-хозяевах.

Ген ybjE расположен в геноме Escherichia coli, и было высказано предположение, что он кодирует предполагаемый белок на мембране (Science, 277 (5331): 1453-74, 1997). Однако о клонировании гена и его анализе посредством экспрессии в бактериальных клетках не сообщается, и, таким образом, его физиологическое действие остается неизвестным.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является штамм бактерии, который способен эффективно продуцировать L-аминокислоту. Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа эффективного получения L-аминокислоты с использованием указанного штамма.

Для того, чтобы добиться поставленных целей, авторы настоящего изобретения провели тщательное исследование и в результате на основании устойчивости к высоким концентрациям L-лизина получили ген ybjE, новый ген для экспортера L-аминокислот. Кроме того, авторы также обнаружили, что L-аминокислоты, включая основные L-аминокислоты, такие как L-лизин, L-аргинин, L-орнитин и L-гистидин; алифатические L-аминокислоты, такие как L-изолейцин; гидроксилсодержащие L-аминокислоты, такие как L-треонин; циклические L-аминокислоты, такие как L-пролин; ароматические L-аминокислоты, такие как L-фенилаланин; серосодержащие L-аминокислоты, такие как L-цистеин; и кислые L-аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота, можно эффективно получать с использованием микроорганизма, в котором увеличена экспрессия гена ybjE.

Объектом настоящего изобретения является микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-аминокислоты, при этом указанный микроорганизм модифицируют таким образом, что экспрессия гена ybjE увеличивается.

Еще одним из объектов настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, в котором экспрессию указанного гена ybjE усиливают путем увеличения копийности указанного гена ybjE или путем модифицирования регуляторной последовательности, которая контролирует экспрессию указанного гена ybjE.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, в котором аминокислотную последовательность белка, кодируемого указанным геном ybjE, выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 9 и 10, и в котором указанный белок обладает способностью экспортировать L-аминокислоту.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, где указанный ген ybjE выбирают из группы, включающей:

(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; и

(b) ДНК, способную гибридизоваться в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или зондом, который может быть получен из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, и где указанная ДНК кодирует белок, способный экспортировать L-аминокислоту.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, где указанный ген ybjE выбирают из группы, включающей:

(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, включающую нуклеотиды с номерами с 49 по 948 из SEQ ID NO: 1; и

(b) ДНК, способную гибридизоваться в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, включающую нуклеотиды с номерами с 49 по 948 из SEQ ID NO: 1, или зондом, который может быть получен из нуклеотидной последовательности, включающей нуклеотиды с номерами с 49 по 948 из SEQ ID NO: 1, и где указанная ДНК кодирует белок, способный экспортировать L-аминокислоту.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанная способность указанного микроорганизма экспортировать L-аминокислоту повышается с указанным увеличением экспрессии указанного гена ybjE.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом устойчивость микроорганизма к L-аминокислоте или аналогу L-аминокислоты повышается с указанным увеличением экспрессии указанного гена ybjE.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанную L-аминокислоту выбирают из группы, включающей L-лизин, L-аргинин, L-орнитин, L-гистидин, L-изолейцин, L-треонин, L-пролин, L-фенилаланин, L-цистеин и L-глутаминовую кислоту.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанный микроорганизм относится к семейству энтеробактерий.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанный микроорганизм, относящийся к семейству энтеробактерий, представляет собой микроорганизм, относящийся к роду Escherichia.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанный микроорганизм является бактерией Coryneform.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанный микроорганизм является микроорганизмом, ассимилирующим метанол.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный микроорганизм, при этом указанный микроорганизм, ассимилирующий метанол, относится к роду Methylophilus или Methylobacillus.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание вышеуказанного микроорганизма в питательной среде, с целью получения и накопления указанной L-аминокислоты, и выделение указанной L-аминокислоты из питательной среды или микроорганизма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание вышеуказанного микроорганизма в жидкой питательной среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, с целью получения и накопления указанной L-аминокислоты, и выделение указанной L-аминокислоты из питательной среды или микроорганизма.

Еще одним объектом настоящего изобретения является вышеуказанный способ, при этом L-аминокислоту выбирают из группы, включающей L-лизин, L-аргинин, L-орнитин, L-гистидин, L-изолейцин, L-треонин, L-пролин, L-фенилаланин, L-цистеин и L-глутаминовую кислоту.

Краткое описание фигур

На Фиг. 1 приведена схема конструкции плазмиды для амплификации гена ybjE в бактериях Escherichia.

На Фиг. 2 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-лизина.

На Фиг. 3 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с инактивированным геном ybjE, в присутствии высоких концентраций L-лизина.

На Фиг. 4 приведена схема конструкции плазмиды для амплификации гена ybjE в бактериях, ассимилирующих метанол.

На Фиг. 5 приведена схема конструкции плазмиды для продуцирования L-лизина с использованием бактерий, ассимилирующих метанол.

На Фиг. 6 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Methylophilus methylotrophus с амплифицированным геном ybjE в присутствии аналога L-лизина.

На Фиг. 7 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-изолейцина.

На Фиг. 8 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-глутамата.

На Фиг. 9 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-треонина.

На Фиг. 10 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-гистидина.

На Фиг. 11 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-пролина.

На Фиг. 12 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-орнитина.

На Фиг. 13 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-фенилаланина.

На Фиг. 14 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-цистеина.

На Фиг. 15 приведены кривые роста для контрольного штамма и штамма Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE в присутствии высоких концентраций L-аргинина.

На Фиг. 16 приведены кривые роста для контрольного штамма и штаммов Escherichia coli с амплифицированным геном ybjE (948 пар нуклеотидов или 900 пар нуклеотидов)в присутствии высоких концентраций L-лизина.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Настоящее изобретение детально разъясняется ниже.

1. Микроорганизм по настоящему изобретению

Микроорганизм по настоящему изобретению способен продуцировать L-аминокислоту, и его модифицируют таким образом, что экспрессия гена ybjE увеличивается. Выражение "способность продуцировать L-аминокислоту" по тексту настоящего описания означает способность вызывать накопление L-аминокислоты в питательной среде или в клетках микроорганизма, когда микроорганизм по настоящему изобретению выращивают в питательной среде. Микроорганизм по настоящему изобретению может быть способен продуцировать несколько видов L-аминокислот. Микроорганизм, который способен продуцировать L-аминокислоту, может быть микроорганизмом, который изначально обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, или может быть микроорганизмом, который получают модификацией родительского штамма микроорганизма, как указано ниже, с использованием методов мутагенеза или с помощью методов рекомбинантной ДНК таким образом, чтобы микроорганизм приобрел способность продуцировать L-аминокислоту. Микроорганизм по настоящему изобретению может быть также микроорганизмом, который приобрел способность продуцировать L-аминокислоту путем увеличения экспрессии гена ybjE.

L-аминокислоты, которые продуцируют согласно настоящему изобретению, специально не ограничиваются и включают основные L-аминокислоты, такие как L-лизин, L-аргинин, L-орнитин, L-гистидин и L-цитруллин; алифатические L-аминокислоты, такие как L-изолейцин, L-аланин, L-валин, L-лейцин и L-глицин; гидроксилсодержащие L-аминокислоты, такие как L-треонин и L-серин; циклические L-аминокислоты, такие как L-пролин; ароматические L-аминокислоты, такие как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан; серосодержащие L-аминокислоты, такие как L-цистеин, L-цистин и L-метионин; и кислые L-аминокислоты и их амиды, такие как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин и L-аспарагин. Микроорганизм по настоящему изобретению может обладать способностью продуцировать два или несколько видов указанных L-аминокислот.

Придание способности продуцировать L-аминокислоту

Ниже приведены примеры микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать L-аминокислоту, которые используют по настоящему изобретению. Однако микроорганизмы указанными примерами не ограничиваются, а включают любые микроорганизмы, которые обладают способностью продуцировать L-аминокислоту.

В качестве родительского штамма микроорганизма по настоящему изобретению могут применяться микроорганизмы семейства энтеробактерий, такие как бактерии Escherichia, бактерии Pantoea или бактерии Coryneform и т.д. Кроме того, могут применяться ассимилирующие метанол бактерии, такие как бактерии Methylophilus и бактерии Methylobacillus, которые способны продуцировать L-аминокислоты из метанола. Далее, примеры родительских штаммов включают семейство энтеробактерий, которые относятся к γ-протеобактериям, включая бактерии, относящиеся к роду Escherichia, Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella и Morganella, и другие бактерии, в том числе бактерии Alicyclobacillus и бактерии Bacillus, и дрожжи, включая дрожжи, которые относятся к роду Saccharomyces, Candida и т.п. Указанные родительские штаммы могут изначально обладать геном ybjE или могут не обладать прирожденным геном ybjE и показывать улучшенную способность экспортировать L-аминокислоту после введения гена ybjE.

Могут применяться бактерии Escherichia, описанные у Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurum, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), такие как Escherichia coli. Примеры штаммов Escherichia coli дикого типа включают, но этим не ограничиваясь, штамм К12 и его производные, штамм Escherichia coli MG1655 (ATCC No. 47076) и штамм W3110 (ATCC No. 27325). Указанные штаммы могут быть получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, адрес: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America).

Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes и т.д. Примеры бактерий Pantoea включают Pantoea ananatis и т.д. Хотя некоторые бактерии, первоначально классифицированные как Enterobacter aerogenes, в настоящее время могут быть классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis или Pantoea stewartii на основании анализа 16S рРНК, микроорганизм, относящийся к семейству энтеробактерий, который используют согласно настоящему изобретению, может быть либо бактериями Enterobacter, либо бактериями Pantoea. Конкретные примеры Pantoea ananatis включают Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615), Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207) и их производные. Указанные штаммы были первоначально идентифицированы и депонированы как Enterobacter agglomerans, а в настоящее время классифицируются как Pantoea ananatis.

Примеры бактерий Methylophilus включают, но этим не ограничиваясь, Methylophilus methylotrophus, а типичные примеры Methylophilus methylotrophus включают штамм AS1 (NCIMB10515) и т.д. Штамм Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB 10515) доступен из Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (адрес: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).

Примеры бактерий Methylobacillus включают, но этим не ограничиваясь, Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum и т.д. Примеры Methylobacillus glycogenes включают штамм Т-11 (NCIMB 11375), штамм АТСС 21276, штамм АТСС 21371, штамм ATR80 (Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, pp. 67-72 (1994)), штамм А513 (Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 42, pp. 67-72 (1994)) и т.д. Штамм Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 доступен из Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (адрес: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom). Примеры Methylobacillus flagellatum включают штамм КТ (Arch. Microbiol., vol. 149, pp. 441-446 (1988)) и т.д.

Бактерии Coryneform представляют собой группу микроорганизмов, которые описаны в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8^th Ed., p. 599 (1974) и могут применяться согласно настоящему изобретению. Указанные микроорганизмы классифицируют на аэробные, грампозитивные и не кислотостойкие, которые не способны к множественному делению. Бактерии Coryneform включают также такие бактерии, которые ранее относили к роду Brevibacterium, но которые в настоящее объединяют в род Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)), а также бактерии, которые относятся к роду Brevibacterium или Microbacterium, которые близко связаны с геном Corynebacterium.

Примеры подобных бактерий Coryneform перечислены ниже:

Corynebacterium acetoacidophilum

Corynebacterium acetoglutamicum

Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum

Brevibacterium flavum

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitallis

Corynebacterium ammoniagens

Brevibacterium album

Brevibacterium cerinum

Microbacterium ammoniaphilum

В частности, можно привести примеры следующих штаммов:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

Corynebacterium callunae ATCC15991

Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060

Corynebacterium lilium ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacterium efficiens AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC13868

Brevibacterium divaricatum ATCC14020

Brevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC13869)

Brevibacterium roseum ATCC13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066

Brevibacterium thiogenitallis ATCC19240

Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872

Brevibacterium album ATCC15111

Brevibacterium cerinum ATCC15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354

Указанные микроорганизмы можно получить, например, из Американской коллекции типовых культур. Каждому штамму присвоен уникальный регистрационный номер, который приведен в каталоге Американской коллекции типовых культур. Штаммы можно заказать в соответствии с этим регистрационным номером. Кроме того, штамм AJ12340 был депонирован 27 октября 1987 в Национальном технологическом институте бионаук и человека, Агентстве прикладной науки и технологии, Министерстве международного труда и промышленности (в настоящее время - независимое исполнительное агентство, Национальный институт передовой прикладной науки и технологии, Международный патентный депозитарий организмов (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, почтовый код: 305-5466)) в качестве международного депозита в соответствии с Будапештским договором и ему присвоен инвентарный номер FERM BP-1539. Штамм AJ12418 был депонирован 5 января 1989 в Национальном институте передовой прикладной науки и технологии, Международном патентном депозитарии организмов в качестве международного депозита в соответствии с Будапештским договором, и ему присвоен инвентарный номер FERM BP-2205.

Далее поясняются способы придания способности родительскому штамму, как указано выше, продуцировать L-аминокислоту.

Для придания способности продуцировать L-аминокислоту могут быть использованы обычные способы, применяемые для выращивания бактерии - продуцента L-аминокислоты, которая относится к роду бактерий Escherichia или Coryneform и т.д. Например, могут применяться способы получения ауксотрофного мутантного штамма, штамма, устойчивого к аналогу аминокислоты, или мутантного штамма с метаболическим регулированием, который обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, и способы получения рекомбинантного штамма, обладающего повышенной активностью фермента биосинтеза L-аминокислот ("Amino Acid Fermentation", The Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1^st Edition, May 30, 1986, pp. 77-100). При выращивании бактерий-продуцентов L-аминокислоты с использованием указанных способов можно придать одно или несколько свойств, включая ауксотрофию, стойкость к аналогу аминокислоты и метаболическое регулирование мутации.

При разработке рекомбинантного штамма может быть увеличена активность ферментов биосинтеза одной или нескольких L-аминокислот. Кроме того, способы придания свойств ауксотрофии, придания стойкости к аналогу аминокислоты и метаболическое регулирование мутации могут быть объединены со способами увеличения активности фермента биосинтеза L-аминокислот.

Ауксотрофный мутантный штамм, штамм, устойчивый к аналогу аминокислоты или штамм, мутировавший путем метаболического регулирования, который обладает способностью продуцировать L-аминокислоту, можно получить, подвергая родительский штамм или штамм дикого типа типичной мутагенной обработке, такой как рентгеновское или ультрафиолетовое облучение, обработка мутагеном, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG). Затем из мутантных штаммов можно выделить ауксотрофный мутантный штамм, штамм, устойчивый к аналогу аминокислоты, или мутантный штамм с метаболическим регулированием, которые обладают способностью продуцировать L-аминокислоту.

Примеры аналогов L-лизина включают оксализин, гидроксамат лизина, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (АЕС), γ-метиллизин, α-хлоркапролактам, норлейцин и т.п. Примеры аналогов L-аргинина включают гидроксамат аргинина, гомоаргинин, D-аргинин, канаванин, гидроксамат аргинина.

Конкретные примеры штаммов, устойчивых к аналогам L-лизина, или штаммов, мутировавших путем метаболического регулирования, которые обладают способностью продуцировать L-лизин, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, JP 56-18596A и патент США № 4346170), штамм Escherichia coli VL611 (JP 2000-189180А) и т.п. Кроме того, в качестве штамма Escherichia coli, продуцирующего L-лизин, можно использовать штамм WC196 (WO 96/17930). Штамм WC196 первоначально был выращен путем придания устойчивости штамму W3110, который выделяют из Escherichia coli К-12, к действию АЕС (S-(2-аминоэтил)-L-цистеин). Штамм WC196 был обозначен как штамм Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в независимом исполнительном агентстве, Национальном институте передовой прикладной науки и технологии, Международном патентном депозитарии организмов (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, почтовый код: 305-8566) 6 декабря 1994 и ему присвоен инвентарный номер FERM P-14690. Затем депозит был переведен 29 сентября 1995 в международный депозит в соответствии с Будапештским договором и ему присвоен инвентарный номер FERM BP-5252.

Примеры бактерий Coryneform, которые обладают способностью продуцировать L-лизин, включают мутантные штаммы, устойчивые к S-(2-аминоэтил)-цистеину (далее обозначают как "AEC"), в том числе Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470) (описан в JP56-1914B, JP56-1915B, JP57-14157B, JP57-14158B, JP57-30474B, JP58-10075B, JP59-4993B, JP61-35840B, JP62-24074B, JP62-36673B, JP5-11958B, JP7-112437B и JP7-112438B), мутантные штаммы, ауксотрофные по аминокислоте, такой как L-гомосерин (JP48-28078B и JP56-6499B), мутантные штаммы, устойчивые к АЕС, и ауксотрофные по аминокислотам, таким как L-лейцин, L-гомосерин, L-пролин, L-серин, L-аргинин, L-аланин и L-валин (патенты США № 3708395 и 3825472), мутантные штаммы-продуценты L-лизина, устойчивые к DL-α-амино-ε-капролактаму, α-аминолауриллактаму, аналогу аспарагиновой кислоты, лекарственному сульфамидному препарату, хиноиду и N-лауроиллейцину, мутантные штаммы-продуценты L-лизина, устойчивые к ингибитору оксалоацетатдекарбоксилазы или ингибитору фермента респираторного тракта (JP50-53588A, JP50-31093A, JP52-102498A, JP53-9394A, JP53-86089A, JP55-9783A, JP55-9759A, JP56-32995A, JP56-39778A, JP53-43591B и JP53-1833B), мутантные штаммы-продуценты L-лизина, ауксотрофные по инозитолу или уксусной кислоте (JP55-9784A и JP56-8692A), мутантные штаммы-продуценты L-лизина, которые чувствительны к действию фторпировиноградной кислоты или температуры 34°С или выше (JP55-9783A и JP53-86090A), мутантные штаммы - продуценты L-лизина бактерий Brevibacterium или Corynebacterium, устойчивые к этиленгликолю (патент США № 4411997) и т.д.

Способность продуцировать L-аминокислоту можно придать также путем увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент биосинтеза L-аминокислоты.

Например, способность продуцировать L-лизин можно придать путем увеличения экспрессии гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и гена, кодирующего аспартокиназу. В частности, приготавливают рекомбинантную ДНК лигированием фрагмента гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и фрагмента гена, кодирующего аспартокиназу, в вектор, преимущественно высококопийный вектор, который операбельно можно поместить в микроорганизм-хозяин, используемый для продукции L-лизина. В итоге этой трансформации копийность гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и гена, кодирующего аспартокиназу в клетке-хозяине, возрастает, и, таким образом, активность указанных ферментов усиливается. Далее по тексту настоящего описания дигидродипиколинатсинтазу, аспартокиназу и аспартокиназу III обозначают их аббревиатурами, соответственно, как DDPS, AK и AKIII.

Гены, которые кодируют DDPS и AK, специально не ограничиваются, при условии, что они кодируют белки, обладающие соответственно активностью DDPS и AK. Примеры подобных генов включают гены Escherichia coli, Methylophilus methylotrophus, Corynebacterium glutamicum и т.д. Поскольку нуклеотидные последовательности для гена DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986) и гена AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), известны, то указанные гены могут быть получены методом ПЦР с использованием праймеров, разработанных на основании их нуклеотидных последовательностей в хромосомной ДНК микроорганизма, такого как штамм E. coli К-12. Далее по тексту настоящего описания ген, кодирующий DDPS, и ген, кодирующий AK, в качестве примеров представлены генами dapA и lysC, полученными из E. coli, однако гены, кодирующие DDPS, и гены, кодирующие AK, не ограничиваются генами dapA и lysC.

Известно, что DDPS дикого типа, полученная из Escherichia coli, чувствительна к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, и что AKIII дикого типа, полученная из Escherichia coli, чувствительна к супрессии и ингибированию L-лизином по типу обратной связи. Поэтому в том случае, когда используют dapA и lysC, то предпочтительно применяют мутантные гены, кодирующие DDPS и AK, которые устойчивы к ингибированию L-лизином по типу обратной связи. Далее по тексту настоящего изобретения DDPS, имеющая мутацию, которая выявляется при ингибировании L-лизином по типу обратной связи, может также обозначаться как "мутантная DDPS", а ДНК, кодирующая мутантную DDPS, может также обозначаться как "мутантный dapA" или "dapA*". AKIII, полученная из Escherichia coli, которая имеет мутацию, устраняющую ингибирование L-лизином по типу обратной связи, может также обозначаться как "мутантная AKIII", а ДНК, кодирующая мутантную AKIII, может также обозначаться как "мутантный lysC". DDPS, полученная из бактерий Corynebacterium, обладает изначальной стойкостью к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, и поэтому DDPS и AK, которые применяются согласно настоящему изобретению, не обязательно должны подвергаться мутации.

Примеры ДНК, кодирующей мутантную DDPS, которая устойчива к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, включают ДНК, кодирующую DDPS, аминокислотная последовательность которой включает замещение 118-го остатка гистидина тирозином. (Патенты США № 5661012 и 6040160). Кроме того, примеры ДНК, кодирующей мутантную AKIII, которая устойчива к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, включают ДНК, кодирующую AKIII, аминокислотная последовательность которой включает замещение 352-го остатка треонина изолейцином (Патенты США № 5661012 и 6040160). Мутантную ДНК можно получить с помощью сайтнаправленного мутагенеза по методу ПЦР и т.п.

Плазмида, которую используют для клонирования гена, может быть любой плазмидой при условии, что она может реплицироваться в микроорганизмах, и конкретные примеры плазмид включают pBR322, pTWV228 (Takara Bio), pMW119 (Nippon Gene), pUC19 и т.д.

Вектор, который операбельно можно поместить в микроорганизм-хозяин, используемый для трансформации, представляет собой плазмиду, обладающую способностью автономно реплицироваться в клетках каждого микроорганизма. Конкретные примеры векторов для Escherichia coli включают pSTV29 (Takara Bio), RSF1010 (Gene, Vol. 75 (2), pp. 271-288, 1989), pUC19, pBR322, pMW119 и т.д. Могут также использоваться векторы ДНК фага. Вектор для бактерии Methylophilus, например, представляет собой плазмиду, которая обладает способностью автономно реплицироваться в клетках бактерий Methylophilus. Конкретные примеры векторов для бактерии Methylophilus включают RSF1010 и его производные, такие как pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301 и pTB70 (Nature, 287, 396 (1980)). Примеры вектора, который операбельно можно поместить в бактерию Coryneform, включают pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A) и pSFK6 (JP-2000-262288A). Кроме того, векторы, которые получают удалением фрагмента ДНК, придающего плазмиде способность автономно реплицироваться в бактерии Coryneform, с последующей вставкой фрагмента в векторы для Escherichia coli, могут быть использованы в качестве так называемого челночного вектора, который способен автономно реплицироваться как в Escherichia coli, так и в бактерии Coryneform.

С целью приготовления рекомбинантной ДНК посредством лигирования dapA и lysC с любым из вышеуказанных векторов, можно использовать рестриктазы для расщепления как фрагмента ДНК, содержащего dapA и lysC, так и вектора. Лигирование обычно осуществляют с помощью лигазы, такой как Т4 ДНК-лигаза. dapA и lysC могут быть включены в отдельные векторы или в один вектор. Методы, которые могут применяться для расщепления с помощью рестриктаз, лигирования ДНК, приготовления хромосомной ДНК, проведения ПЦР, приготовления плазмидной ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и т.д., могут быть обычными методами, хорошо известными специалистам. Подобные методы описываются в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п. Для введения в микроорганизм рекомбинантной ДНК, полученной вышеуказанным способом, может применяться любой метод при условии, что обеспечивается достаточная эффективность трансформации. Например, может применяться электропорация (Canadian Journal of Microbiology, 43, 97 (1997)).

В качестве плазмиды, которая содержит мутантный dapA, кодирующий мутантную DDPS, и мутантный lysC, кодирующий мутантную AKIII, может применяться плазмида RSFD80, пригодная для широкого круга хозяев (патент США № 6040160). Штамм Escherichia coli JM109, трансформированный с помощью RSFD80, был обозначен как AJ12396 (патент США № 6040160), и указанный штамм был депонирован 28 октября 1993 в независимом исполнительном агентстве, Национальном институте передовой прикладной науки и технологии, Международном патентном депозитарии организмов и получил инвентарный номер FERM P-13936. Затем депозит был преобразован 1 ноября 1994 в международный депозит в соответствии с Будапештским договором и ему присвоен инвентарный номер FERM BP-4859. RSFD80 можно получить из штамма AJ12396 известным способом.

Экспрессию гена DDPS и гена АК можно также увеличить путем интегрирования множества копий dapA и lysC в хромосомную ДНК микроорганизма. С целью введения множества копий dapA и lysC в хромосомную ДНК микроорганизма, можно провести гомологичную рекомбинацию путем конъюгирования последовательности, которая присутствует во многих копиях в хромосомной ДНК. В качестве последовательности, которая содержится в хромосомной ДНК во множестве копий, может использоваться повторяющаяся ДНК или инвертированный повтор, содержащийся на конце способного к перемещению элемента. Иначе, как описано в JP2-109985А, множество копий dapA и/или lysC может быть введено в хромосомную ДНК с помощью транспозона. В обоих указанных методах активности DDPS и АК усиливаются в результате увеличения копийности dapA и lysC в трансформированных штаммах.

Помимо вышеуказанных способов амплификации гена экспрессию гена DDPS и гена АК можно также увеличить путем замещения регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию, такой как промоторы dapA и lysC, более сильными промоторами (JP1-215280А). Примеры подобных сильных промоторов включают lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, P_R промотор и P_L промотор фага лямбда, tet промотор, amyE промотор, spac промотор и т.д. Вставка указанных промоторов вместо природных промоторов увеличивает экспрессию dapA и lysC, что приводит к увеличению активности DDPS и АК. Усиление регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию, можно комбинировать с увеличением копийности dapA и lysC.

Способность продуцировать L-лизин можно придать также путем увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент биосинтеза L-лизина, отличный от DDPS и АК. Примеры подобных ферментов включают ферменты диаминопимелатного пути синтеза, такие как дигидродипиколинатредуктаза, диаминопимелатдекарбоксилаза, диаминопимелатдегидрогеназа (WO 96/40934), фосфоенолпируваткарбоксилаза (JP60-87788A), аспартатаминотрансфераза (JP6-102028B), диаминопимелатэпимераза (JP2003-135066A), аспартатсемиальдегиддегидрогеназа (WO 00/61723). Другие примеры подобных ферментов включают ферменты аминоадипатного пути развития, такие как гомоаконитатгидратаза (JP2000-157276A) и т.д. Увеличение экспрессии гена указанных ферментов можно комбинировать с увеличением экспрессии генов DDPS и АК.

Кроме того, микроорганизм, обладающий способностью продуцировать L-лизин, можно получить также путем снижения или исключения внутриклеточной активности фермента, который катализирует реакцию синтеза соединения, отличного от L-лизина, и реакцию, ответвляющуюся от пути биосинтеза L-лизина. Примеры подобных ферментов включают гомосериндегидрогеназу и лизиндекарбоксилазу. Штаммы, в которых активность указанных ферментов снижена или исключена, описываются в WO 95/23864 и WO 96/17930.

Примеры методов снижения или исключения внутриклеточной активности фермента включают мутацию или делецию гена, кодирующего фермент в клетках мик