Изетионатная соль селективного ингибитора cdk4

Изетионатная соль селективного ингибитора cdk4

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к солевым формам 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, который является селективным ингибитором циклинзависимой киназы 4 (CDK4), пригодным для лечения воспалительных и клеточных пролиферативных заболеваний, таких как рак и рестеноз.

Циклинзависимые киназы и родственные серин/треонинпротеин-киназы являются важными клеточными ферментами, которые выполняют основные функции в регуляции клеточного деления и пролиферации. Каталитические единицы циклинзависимой киназы активируются посредством регуляторных субъединиц, известных как циклины. По меньшей мере, идентифицированы шестнадцать циклинов млекопитающих (D.G. Johnson и C.L. Walker, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1999), 39: 295-312). Циклин B/CDK1, циклин А/CDK2, циклин Е/CDK2, циклин D/CDK4, циклин D/CDK6 и, вероятно, другие гетеродимеры, включая CDK3 и CDK7, являются важными регуляторами развития клеточного цикла. Дополнительные функции гетеродимеров циклин/CDK включают регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, дифференцировку и апоптоз (D.O. Morgan, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (1997), 13261-13291).

Ингибиторы циклинзависимой киназы могут оказаться пригодными при лечении рака. Показано, что увеличенная активность или временно аномальная стимуляция циклинзависимых киназ приводит к развитию опухолей у человека (C.J. Sherr, Science (1996), 274: 1672-1677). Действительно, развитие человеческих опухолей обычно ассоциируется с изменениями или в самих CDK-белках или в их регуляторах (C. Cordon-Cardo, Am. J. Pathol. (1995), 147: 545-560; J.E. Karp и S. Broder, Nat. Med. (1995), 1: 309-320; M. Hall et al., Adv. Cancer Res. (1996), 68:67-108). Встречающиеся в природе белковые ингибиторы циклинзависимых киназ, такие как р16 и р27, вызывают in vitro ингибирование роста в линиях раковых клеток при раке легкого (A. Kamb, Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1998), 227: 139-148).

Имеющие малую молекулу ингибиторы CDK также могут использоваться при лечении сердечно-сосудистых нарушений, таких как рестеноз и атеросклероз, и других сосудистых нарушений, которые приводят к аберрантной клеточной пролиферации. Сосудистая гладкомышечная пролиферация и интимальная гиперплазия с последующей баллонной ангиопластикой ингибируются путем сверхэкспрессии белкового ингибитора циклинзависимой киназы р21 (M.W. Chang et al., J. Clin. Invest. (1995), 96: 2260; Z-Y. Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (США), (1996), 93: 9905). Кроме того, результатом воздействия пурин-CDK2-ингибитора CVT-313 (константа ингибирования (Ки)=95 нМ) является ингибирование образования неоинтимы у крыс более чем на 80% (E.E. Brooks et al., J. Biol. Chem. (1997), 29207-29211).

Ингибиторы CDK можно использовать для лечения заболеваний, вызванных различными инфекционными агентами, включая грибы, простейшие паразиты, такие как Plasmodium falciparum, и ДНК-овые и РНК-овые вирусы. Например, циклинзависимые киназы необходимы для вирусной репликации с последующей инфекцией вирусом простого герпеса (HSV) (L.M. Schang et al., J. Virol. (1998), 72: 5626) и известны гомологи CDK, играющие существенную роль в дрожжах.

Селективные ингибиторы CDK можно использовать для улучшения последствий различных аутоиммунных нарушений. Ревматоидный артрит, или хроническое воспалительное заболевание, характеризуется гиперплазией синовиальной ткани. Ингибирование пролиферации синовиальной ткани будет минимизировать воспаление и предотвращать разрушение суставов. Обнаружено, что экспрессия белкового ингибитора CDK р16 в синовиальных фибробластах ингибирует рост (K. Taniguchi et al., Nat. Med. (1999), 5: 760-767). Подобным образом, при артрите у используемой в качестве модели крысы припухлость сустава, по существу, ингибируют путем лечения экспрессирующим р16 аденовирусом. Ингибиторы CDK могут быть эффективны против других нарушений клеточной пролиферации, включая псориаз (характеризуется кератиноцитной гиперпролиферацией), гломерулонефрит и волчанку.

Определенные ингибиторы CDK могут быть пригодны в качестве химиозащитных агентов вследствие их способности ингибировать прогрессирование клеточного цикла нормальных нетрансформированных клеток (Chen et al., J. Natl. Cancer Institute (2000), 92: 1999-2008). Предварительная обработка ингибитором CDK ракового больного перед использованием цитотоксических агентов может уменьшать побочные эффекты, обычно ассоциируемые с химиотерапией. Нормально пролиферирующие ткани защищают от цитотоксических эффектов путем воздействия селективного ингибитора CDK.

В обзорных статьях в отношении ингибиторов циклинзависимых киназ, имеющих малые молекулы, указывается на трудность идентификации соединений, которые ингибируют специфические белки CDK без ингибирования других ферментов. Таким образом, несмотря на их потенциал для лечения различных заболеваний, ингибиторы CDK в настоящее время не одобрены для коммерческого использования (P.M. Fischer, Curr. Opin. Drug Discovery (2001), 4: 623-634; D.W. Fry and M.D. Garrett, Curr. Opin. Oncologic, Endocrine & Metabolic Invest. (2000), 2: 40-59; K.R. Webster and D. Kimball, Emerging Drugs (2000), 5: 45-59; T.M. Sielecki et al., J. Med. Chem. (2000), 43: 1-18).

Несмотря на эти трудности согласно последним исследованиям идентифицировано некоторое количество селективных ингибиторов CDK4, которые, как рассмотрено выше, могут быть пригодны при лечении рака - или в качестве противораковых агентов или в качестве химиозащитных агентов - и при лечении сердечно-сосудистых нарушений, таких как рестеноз и атеросклероз, заболеваний, вызванных инфекционными агентами, и аутоиммунных нарушений, включая ревматоидный артрит. В отношении раскрытия этих селективных ингибиторов CDK4 см. международную патентную заявку PCT/IB03/00059, зарегистрированную 10 января 2003 г. (заявка '059), которая включена в данный контекст путем ссылки во всей ее полноте.

В заявке '059 раскрывается особенно эффективный и селективный ингибитор CDK4, 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-он:

В стандартных ферментных анализах соединения формулы 1 показывают концентрации ингибирования ИК₅₀ (концентрация, приводящая к 50% ингибирования) для CDK4 и CDК2 (при 25^оС) 0,011 мкМ и >5 мкМ, соответственно. В отношении обсуждения стандартных анализов определений ИК₅₀ для CDK4 и CDК2 см. D.W. Fry et al., J. Biol. Chem. (2001), 16617-16623.

Несмотря на то, что соединение формулы 1 является эффективным и селективным ингибитором CDK4, его использование в фармацевтических продуктах вызывает проблемы. Например, свободное основание имеет плохую растворимость в воде (9 мкг/мл) и показывает низкую биодоступность в исследованиях на животных. Дигидрохлоридная соль соединения формулы 1 проявляет адекватную растворимость в воде. Однако исследования в отношении влажности показывают, что даже при низкой относительной влажности (10% относительной влажности (RH)), дигидрохлоридная соль абсорбирует воду в количествах более чем примерно 2% от ее массы, делая ее неподходящей для использования в твердом лекарственном продукте. Моногидрохлоридная соль соединения формулы 1 является незначительно гигроскопичной, абсорбируя более чем 2% от ее массы, при относительной влажности более чем 80%. Однако способ получения моногидрохлоридной соли приводит к частично кристаллическому лекарственному веществу, что означает возможные проблемы при использовании способа в крупных масштабах. Таким образом, необходимы другие солевые формы соединения формулы 1.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к моноизетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, которая представлена формулой 2:

Изетионатная соль может существовать в виде одного или более полиморфов, включая форму А, форму В и форму D. Каждый из полиморфов можно различать с помощью порошковой рентгенограммы (PXRD) (дифрактограмма), или с помощью рамановского спектра, или термограммы дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), или любой комбинации PXRD, рамановского спектра и термограммы DSC. Изетионатная соль может быть безводной или может содержать различные количества воды или одного, или более растворителей.

Таким образом, один аспект согласно настоящему изобретению относится к моноизетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, которую обозначают как форма А и которая характеризуется одним или более из следующего: порошковая рентгенограмма имеет пики при величинах 2θ от примерно 8,7, 13,5 и 17,6, или рамановский спектр имеет пики с величинами сдвига частот комбинационного рассеяния от примерно 1600 см^-1, 1290 см^-1, 675 см^-1, 470 см^-1, 450 см^-1 и 425 см^-1, или термограмма DSC имеет отчетливый эндотермический пик при 273^оС.

Другой аспект согласно настоящему изобретению относится к моноизетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, которую обозначают как форма В и которая характеризуется одним или более из следующего: порошковая рентгенограмма имеет пики при величинах 2θ примерно 5,1, 11,8, 12,1, 12,8, 13,1 и 14,7, рамановский спектр имеет пики с величинами сдвига частот комбинационного рассеяния примерно 1600 см^-1, 1290 см^-1, 470 см^-1, 450 см^-1 и 425 см^-1, но без основного пика при 675 см^-1, или термограмма DSC имеет отчетливый эндотермический пик при 271^оС.

Дальнейший аспект согласно настоящему изобретению относится к моноизетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, которую обозначают как форма D и которая характеризуется одним или более из следующего: порошковая рентгенограмма имеет пики при величинах 2θ примерно 8,4, 8,9 и 21,9, рамановский спектр имеет пик с величиной сдвига частот комбинационного рассеяния примерно 463 см^-1, или термограмма DSC имеет отчетливый эндотермический пик при 277^оС. Для каждой солевой формы порошковую рентгенограмму получают, используя CuK_α-излучение, а термограмму DSC получают, используя скорость нагрева 5^оС/мин.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим дозированным формам, которые включают изетионатную соль 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов. Пригодные эксципиенты включают дезинтеграторы, связующие вещества, растворители, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества, консерванты, антиоксиданты, ароматизаторы, красители и тому подобное.

Настоящее изобретение также относится к способам получения изетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она. Один из способов включает добавление раствора изетионовой кислоты и первого растворителя к водной суспензии 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, с получением первой смеси. Способ также включает сушку вымораживанием смеси для получения аморфной соли, которая далее объединяется со вторым растворителем с получением второй смеси, включающей изетионатную соль 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она.

Другой способ включает получение затравочного кристалла изетионатной солевой формы 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она и добавление затравочного кристалла к дисперсии 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она и первого растворителя с получением первой смеси. Способ также включает объединение первой смеси с раствором изетионовой кислоты и вторым растворителем с получением второй смеси, включающей изетионатную соль 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она.

В обоих вышеуказанных способах первый и второй растворители могут быть одинаковыми или различными и являться смешиваемыми с водой растворителями, включая метанол, этанол и другие спирты. Для улучшения выходов способы могут включать нагрев, охлаждение или нагрев и охлаждение второй смеси до температур выше или ниже комнатной температуры. Например, вторую смесь можно нагревать до температуры в диапазоне от примерно 30^оС до примерно 60^оС и потом дать ей возможность охладиться до комнатной температуры. Альтернативно, вторую смесь можно выдерживать при комнатной температуре, а потом охлаждать до температуры примерно 0^оС или ниже. Подобным образом вторую смесь можно нагревать до температуры в диапазоне от примерно 30^оС до примерно 60^оС и потом охлаждать до температуры примерно 0^оС или ниже.

Другой способ включает взаимодействие трет-бутилового эфира 4-{6-[6-(1-бутоксивинил)-8-циклопентил-5-метил-7-оксо-7,8-дигидропиридо[2,3-d]пиримидин-2-иламино]пиридин-3-ил}пиперазин-1-карбоновой кислоты с изетионовой кислотой в растворителе и воде с получением смеси, которая включает диизетионатную соль 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она. Способ необязательно включает добавление блокирующего основания к реакционной смеси для получения моноизетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она.

Настоящее изобретение, далее, относится к способу лечения нарушения или состояния млекопитающего, включая человека, вызванного аномальной клеточной пролиферацией, или вирусными или грибковыми инфекциями, или аутоиммунным заболеванием. Способ включает введение млекопитающему такого количества изетионатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, которое эффективно для лечения нарушения или состояния. Нарушения или состояния, вызванные аномальной клеточной пролиферацией, включают рак и сосудистую гладкомышечную пролиферацию, связанную с атеросклерозом, послеоперационным сосудистым стенозом и рестенозом, и эндометриоз. Аутоиммунные заболевания включают псориаз, подобный воспалению ревматоидный артрит, волчанку, диабет типа 1, диабетическую нефропатию, рассеянный склероз, гломерулонефрит и отторжение трансплантированного органа, включая реакцию "трансплантат против хозяина".

Изетионатная соль обладает значительными преимуществами по отношению к свободному основанию (формула 1) и другим солевым формам, включая аддитивные гидрохлоридные и дигидрохлоридные соли. По сравнению со свободным основанием, изетионатная соль показывает более чем 20000-кратное улучшение растворимости в воде. В случае дигидрохлоридной соли, однако, улучшение растворимости не сопровождается существенным увеличением гигроскопичности. Кроме того, изетионатная соль является, в основном, кристаллической, и, следовательно, не возникает дополнительных проблем, связанных с моногидрохлоридной солью. Эти и другие преимущества должны помогать облегчать решение множества проблем, встречающихся при получении фармацевтических продуктов, содержащих селективный ингибитор CDK4 формулы 1.

Краткое описание чертежей

Разнообразные особенности, преимущества и другие использования согласно настоящему изобретению станут более очевидны при рассмотрении следующего описания и чертежей, на которых:

Фиг.1 показывает PXRD моноизетионатной соли (форма А) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.2 показывает PXRD моноизетионатной соли (форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.3 показывает PXRD мономезилатной соли (форма А, форма В, форма С и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.4 показывает PXRD димезилатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.5 показывает PXRD моногидрохлорида 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.6 показывает PXRD дигидрохлорида 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.7 показывает рамановский спектр моноизетионатной соли (форма А, форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, имеющий сдвиги частот комбинационного рассеяния в пределах от 0 до 1850 см^-1;

Фиг.8 показывает рамановский спектр моноизетионатной соли (форма А, форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, имеющий сдвиги частот комбинационного рассеяния в пределах от 1350 до 1800 см^-1;

Фиг.9 показывает рамановский спектр моноизетионатной соли (форма А, форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, имеющий сдвиги частот комбинационного рассеяния в пределах от 1100 до 1350 см^-1;

Фиг.10 показывает рамановский спектр моноизетионатной соли (форма А, форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, имеющий сдвиги частот комбинационного рассеяния в пределах от 500 до 850 см^-1;

Фиг.11 показывает рамановский спектр моноизетионатной соли (форма А, форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, имеющий сдвиги частот комбинационного рассеяния в пределах от 340 до 550 см^-1;

Фиг.12 показывает термограмму DSC моноизетионатной соли (форма А) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.13 показывает термограммы DSC моноизетионатной соли (форма В и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.14 показывает термограммы DSC мономезилатной соли (форма А, форма В, форма С и форма D) 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.15 показывает термограмму DSC димезилатной соли 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.16 показывает термограмму DSC дигидрохлорида 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она;

Фиг.17 показывает изотермы адсорбции/десорбции воды для свободного основания 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она; и

Фиг.18 показывает изотермы адсорбции/десорбции воды для различных солей 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, включая моноизетионат (форма В и форма D), гидрохлорид и дигидрохлорид, мономезилат (форма А и форма С), димезилат и монотозилат.

Подробное описание определений и сокращений

Если не указано иначе, в данном описании используются определения, рассмотренные ниже.

Термин "рак" включает, но не ограничиваясь этим, следующие формы рака: рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак яичка, рак пищевода, рак желудка, рак кожи, рак легкого, рак костей, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак желчных протоков, рак полости рта и глотки (оральный), рак губы, рак языка, рак рта, рак глотки, рак тонкой кишки, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак головного мозга и рак центральной нервной системы, глиобластома, нейробластома, кератоакантома, эпидермоидная карцинома, крупноклеточный рак, аденокарцинома, аденома, фолликулярная карцинома, недифференцированный рак, сосковидная карцинома, семинома, меланома, саркома, рак мочевого пузыря, рак печени, рак почки, миелоидные нарушения, лимфоидные нарушения, болезнь Ходжкина, рак волосковых клеток и лейкоз.

Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к веществам, которые, в рамках действительного медицинского заключения, пригодны для применения при контактировании с тканями пациентов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, в соответствии с приемлемым соотношением пользы и риска и эффективным для их применения по назначению.

Термин "лечить" относится к реверсированию, облегчению, ингибированию прогрессирования болезни или предупреждения нарушения или состояния, для которого применим такой термин, или предупреждения одного или более симптомов такого нарушения или состояния.

Термин "лечение" относится к действию "лечить", как непосредственно определено выше.

В таблице 1 перечислены сокращения, используемые в описании.

Таблица 1
Сокращения
Сокращение	Описание
aq	водный
ACN	ацетонитрил
BOC	трет-бутоксикарбонил
DCM	дихлорметан
DSC	дифференциальная сканирующая калориметрия
Et3N	триэтиламин
EtOH	этиловый спирт
h, min, s	час, минута, секунда
IPA	изопропиловый спирт
МеОН	метанол
PXRD	порошковая рентгенограмма
RH	относительная влажность
RT	комнатная температура, то есть 20-25оС
THF	тетрагидрофуран
mgA/mL	миллиграммы активного вещества на миллилитр раствора

Моноизетионатная соль (формула 2) может существовать в виде одного или более полиморфов, включая форму А, форму В и форму D. Как указано выше, каждый из полиморфов можно различать с помощью порошковой рентгенограммы (PXRD), или с помощью рамановской спектроскопии, или дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), или любой комбинации этих характеристических способов. Моноизетионатная соль (формула 2) может быть безводной или может содержать различные количества воды или один или более растворителей. Кроме того, моноизетионатная соль (формула 2) может быть, в основном, чистой, то есть содержать, по меньшей мере, примерно 99% масс. индивидуального полиморфа, или может быть смесью двух или более полиморфов (например, формы В и формы D, и т.д.).

Свободное основание (формула 1) является двухосновным соединением, которое может образовывать аддитивные соли как моно-, так и дикислот. Соединяющаяся с ними кислота имеет pK_as от 7,3 до 4,1, таким образом, для получения дисоли необходимы сравнительно сильные кислоты. Хотя возможно получение диизетионатной соли соединения формулы 1, показано, что моноизетионатная соль более пригодна, так как для нее необходимо меньшее количество противоиона.

Фиг.1 и 2 представляют дифрактограммы PXRD для моноизетионатных солевых форм 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она (формула 2). Эти формы обозначены как форма А на Фиг.1 и форма В и форма D на Фиг.2. Для улучшения читаемости дифрактограмма формы D на Фиг.2 смещена вверх примерно на 700 единиц. В таблице 2, ниже, перечислены основные PXRD-пики (то есть показана высота пика по отношению к уровню шума более чем 3,5) для моноизетионатных полиморфов А, В и D и представлена в подчеркнутом виде подгруппа характерных пиков, которые могут быть использованы для отличия одного полиморфа от другого. Перечень характерных пиков, представленный в таблице 2, не является единственно возможным перечнем характерных пиков. Специалисты в области идентификации полиморфов могут выбирать другие группы характерных пиков, чтобы также отличить один полиморф от другого.

Для сравнения результатов Фиг.3-6 показывают дифрактограммы PXRD для мономезилата, димезилата, гидрохлорида и дигидрохлорида 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, соответственно. Несмотря на то, что эти соли могут существовать более чем в одной форме, отдельные полиморфы имеют только идентифицированную мономезилатную соль, которая на Фиг.3 представлена как форма А, форма В, форма С и форма D. Для выделения различий между формами мономезилатной соли дифрактограммы формы В, формы С и формы D на Фиг.3 смещены вверх на различные величины.

Каждая из дифрактограмм PXRD, представленных на Фиг.1-6, получена на рентгеновском дифрактометре для порошкообразных образцов RIGAKU D/Max 2200 с использованием CuK_α-излучения. Дифрактометр оборудован тонкосфокусированной рентгеновской трубкой. Во время каждого эксперимента напряжение и ток трубки устанавливают при 40 кВ и 40 мА, соответственно, щели отклонения и рассеивания устанавливают при 0,5^о, а щель приемного устройства устанавливают при 0,3 мм. Дифрагированное излучение определяют с использованием сцинтилляционного детектора NaI. Для каждого эксперимента используют θ-2θ непрерывное сканирование со скоростью приблизительно 1^о/мин (3 с/0,040^о за один шаг) от 3,0 до 40,0^о 2θ. Образцы для анализа подготавливают путем помещения их на кремниевую пластину-держатель. Данные получают, используя программное обеспечение RIGAKU's RIGMEAS, и анализируют, используя пакет собственного программного обеспечения, разработанный с использованием базовых программных средств JADE.

Для каждого измерения дифракции рентгеновских лучей порошкообразного образца образец солевой формы помещают в полость, расположенную на плоской поверхности держателя, и используют предметное стекло для выравнивания поверхности образца. Держатель, который удерживает образец, помещают в дифрактометр и пучком рентгеновских лучей облучают образец, сначала при малом угле относительно плоской поверхности держателя. Потом пучок рентгеновских лучей шагообразно перемещают по дуге, последовательно увеличивая угол между падающим пучком (лучом) и плоской поверхностью держателя. При каждом шаге сканирования сцинтилляционный счетчик определяет количество дифрагированного излучения, которое регистрирует в виде функции от 2. Прибор с программным обеспечением показывает результаты сканирования дифрагированного излучения в виде интенсивности по сравнению с 2 (Фиг.1-6).

Дифрактограммы PXRD между отдельными измерениями одного и того же полиморфа могут различаться по многим причинам. Источники ошибки включают вариации подготовки образца (например, высота образца), ошибки прибора, ошибки калибровки и ошибки оператора (включая ошибки в определении местоположения пиков). Предпочтительная ориентация, то есть отсутствие беспорядочной ориентации кристаллов в образце PXRD, может происходить в результате значительных различий в относительной высоте пиков. Ошибки калибровки и ошибки в высоте образца часто являются результатом смещения всех пиков дифрактограммы в одинаковом направлении и на одну и ту же величину. Небольшие различия в высоте образцов на плоском держателе могут приводить к большим сдвигам в положениях пиков PXRD. Вследствие систематических исследований показано, что различия в высоте образца в 1 мм могут приводить к смещениям пика так же сильно, как 1^о 2, см. Chen et al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2001), 26: 63.

Во многих случаях смещения пиков в дифракционных картинах, получаемые в результате систематической ошибки, могут быть устранены путем компенсации смещения (например, использование поправочного коэффициента для всех значений положения пика) или путем перекалибровки дифрактометра. Обычно одинаковые методики могут быть использованы для компенсации различий дифрактометров так, что местоположение пика PXRD, полученного на двух различных приборах, можно привести в согласование. Кроме того, когда эти методики применяют к измерениям PXRD для одинаковых или различных дифрактометров, местоположения пика для отдельного полиморфа обычно находятся в пределах примерно ±0,2^о 2.

Фиг.7-11 показывают рамановские спектры моноизетионатных солевых форм 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она (формула 2). Фиг.7 показывает рамановские спектры моноизетионатной соли формы А, В и D со сдвигом частот комбинационного рассеяния в диапазоне от 0 до 1850 см^-1, в то время как Фиг.8-11 представляют рамановские спектры моноизетионатной соли формы А, В и D со сдвигом частот комбинационного рассеяния в диапазоне от 1350 до 1800 см^-1, 1100 до 1350 см^-1, от 500 до 850 см^-1 и от 340 до 550 см^-1, соответственно. На некоторых из фигур для одного или более рамановских спектров можно применять другое масштабирование ординаты (например, форма А на Фиг.7, 8, 10 и 11) или другие базисные линии (например, форма А и форма В на Фиг.9) или другое масштабирование ординаты и другие базисные линии (Фиг.10) для подчеркивания отличий моноизетионатных солевых форм.

В таблице 3, ниже, перечислены характерные пики рамановских спектров, которые могут быть использованы для отличия одной моноизетионатной солевой формы от другой. В качестве данных PXRD перечень характерных пиков, представленных в таблице 3, не является единственно возможным перечнем характерных пиков, и специалисты в области идентификации полиморфов могут выбирать другие группы характерных пиков, с помощью которых также можно отличать один полиморф от другого.

Рамановские спектры, показанные на Фиг.7-11, получены с использованием рамановского микроскопа и спектрографа KAISER OPTICAL SYSTEMS HOLOLAB. В рамановском спектрографе применяется твердотельный диодный лазер, работающий при длине волны 785 нм, с выходной мощностью приблизительно 90 мВт. Мощность, передаваемая образцу через объектив микроскопа, составляет приблизительно 27 мВт. Термоэлектрически охлажденный детектор CCD используют для обнаружения рамановского сигнала. Волоконно-оптические кабели, соединяющие рамановский микроскоп и спектрограф, используют для направления возбуждаемого лазером видимого излучения и рамановского рассеянного света на образец и от образца, соответственно.

Для получения характерных рамановских спектров образцы каждой из полиморфных форм исследуют в отношении многочисленных местоположений или мест. Для каждого образца рамановские спектры получают в четырех или пяти местах, с четырьмя воспроизведениями спектров для каждого места. Обычно, в случае с твердыми образцами, данные для исследованных полиморфных форм показывают наибольшую вариацию интенсивности пика и показывают сравнительно небольшую вариацию местоположения пика. Для каждой из форм величины сдвига частот комбинационного рассеяния (местоположения пика в виде функции волнового числа) различаются меньше, чем на 1 см^-1, тем не менее, как можно ожидать, местоположения пиков у различных форм могут отличаться больше, чем на 1 см^-1. Полагают, что, по меньшей мере, некоторая вариация интенсивности пика или местоположения пика возникает вследствие отличий в направлении лазерного излучения, проходящего разные кристаллы в образце.

Таблица 3
Характерные пики рамановского спектра моноизетионатной соли форм А, В и D
Пик (см-1)	Пик, являющийся характерным для данного полиморфа
1600	А и В
1290	А и В
675	А
470	А и В
463	D
450	А и В
425	А и В

Изменения от эксперимента к эксперименту, описанные выше, рамановские спектры отдельного полиморфа, полученные при использовании различных приборов, показывают небольшие различия (то есть, 1 см^-1 или менее) в положении пика и сравнительно гораздо большие различия в интенсивности пика. Показано, что комбинационное рассеяние света не зависит от используемой длины волны возбуждения, положение пика должно быть одним и тем же между приборами, в которых используют различные источники возбуждения. Интенсивности пиков могут изменяться в зависимости от, среди других обстоятельств, типа детектора или оптики, мощности возбуждающего лазера и положения образца.

Фиг.12 и 13 показывают термограммы DSC моноизетионатных солевых форм 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она (формула 2), определяемых как форма А (Фиг.12) и формы В и D (Фиг.13). Кроме того, Фиг.14-16 показывают термограммы DSC мономезилатной соли (формы А, В, С и D), димезилатной соли и дигидрохлорида, соответственно. Данные DSC получают, используя прибор TA INSTRUMENTS 2920, модулированный DSC V2.6. Отдельные полиморфные образцы анализируют в герметичных алюминиевых чашках с отверстием, используя скорость нагрева 5^оС/мин до 350^оС, и продувают азотом со скоростью 50 мл/мин.

Как показано на Фиг.12-15, моноизетионатная соль (формы А, В и D), мономезилатная соль (формы А, В, С и D) и димезилатная соль имеют определенные температуры плавления, показывая отчетливые эндотермические пики при примерно 273, 271, 277, 309, 307, 302, 304 и 289^оС, соответственно. В отличие от этого дигидрохлорид (Фиг.16) обладает относительно сложной термограммой DSC, которая включает широкие эндотермические пики от примерно 40 до 110^оС и от примерно 160 до 200^оС, которые, вероятно, показывают потерю увлажняющей и кристаллизационной воды, соответственно. На следовое количество дигидрохлорида согласно DSC также указывает относительно отчетливый экзотермический пик, начинающийся при примерно 207^оС, и широкий эндотермический пик, начинающийся при примерно 275^оС, который, вероятно, показывает, соответственно, трансформацию формы и плавление или деструкцию или и плавление, и деструкцию.

Фиг.17 и 18 показывают изотермические пики адсорбции и десорбции воды (при 25^оС) для свободного основания (формула 1) и различных солей 6-ацетил-8-циклопентил-5-метил-2-(5-пиперазин-1-илпиридин-2-иламино)-8Н-пиридо[2,3-d]пиримидин-7-она, включая моноизетионат (формы В и D), гидрохлорид и дигидрохлорид, мономезилат (формы А и С), димезилат и монотозилат. Данные по адсорбции и десорбции воды получают, используя симметричный гравиметрический анализатор фирмы VTI CORPORATION, модель SGA-100. Чтобы получить изотерму водяного пара, образец полиморфа помещают на микровесы в герметичной экологически чистой камере и затем нагревают со скоростью 5^оС/мин до тех пор, пока температура в камере не достигнет 40^оС. Чтобы получить массу сухого образца, полиморфу дают возможность уравновеситься при 40^оС до тех пор, пока опытный образец не будет изменять массу менее чем на 0,0270% масс. в течение 2 мин. После сушки образец охлаждают до 25^оС и затем подвергают воздействию различных уровней влажности в диапазоне от 5% или 10% относительной влажности (RH) до 90% RH и от 90% RH до 10 или 5% RH, в 10%-ном возрастании RH. При каждом уровне влажности полиморфу дают возможность уравновеситься до тех пор, пока опытный образец не будет изменять массу менее чем на 0,0270% масс. в течение 2 мин. Уравновешенную массу при каждом уровне влажности регистрируют и вместе с массой сухого образца используют для построения графика зависимости изменения массы от относительной влажности.

Из соединений, показанных на Фиг.17 и 18, только свободное основание, моноизетионатная соль (формы В и D), и монотозилатная соль показывают менее чем на 2% изменение массы, когда их подвергают воздействию уровней влажности в диапазоне от 10% RH до 90% RH при 25^оС.

В таблице 4 перечислена растворимость в воде свободного основания (его наиболее стабильной кристаллической фазы в соответствии с экспериментами с суспензией) и изетионатной соли (форма В, ее наиболее стабильная форма в соответствии с экспериментами с суспензией). Так как оказывается, что форма В является наиболее стабильной изетионатной солевой формой, она должна показывать наименьшую растворимость в воде среди исследуемых изетионатных солевых форм. Другие изетионатные солевые формы не оценивали на метастабильную растворимость. Растворимости в воде изетионатной соли достигают путем растворения соли в воде вплоть до приблизительно 300 мг/мл, причем уравновешивают в течение времени примерно 48 часов, спустя которое замечают присутствие некоторого количества твердого вещества и измеряют концентрацию соли в водной фазе, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). См. таблицу 5 с перечисленными условиями ВЭЖХ. Растворимости в воде свободного основания достигают уравновешиванием твердого вещества в воде в течение 14 часов и измерением концентрации свободного основания в водной фазе, используя полуавтоматический UV-vis метод, при котором используют спектрофотометр для прочтения планшетов SPECTRMAX PLUS.

Данные в таблице 4 показывают, что растворимость в воде моноизетионатной соли (при рН 5,4) в 20000 раз больше, чем свободного основания (при рН 7,9). Это большое несоответствие в р