Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты

Добавки в виде полиалкиленгликолевой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к полиалкиленгликолевым кислотам и к их связыванию с терапевтически активными биофармацевтическими препаратами с целью получения терапевтически активных коньюгатов полиалкиленгликоля с указанными биофармацевтическими препаратами.

Химическое связывание гидрофильных линейных полимеров полиалкиленгликоля (известных как ПАГ) с биофармацевтическими препаратами, такими как белки и пептиды, является известным приемом и широко используется в биотехнологии. Наиболее известным соединением полиалкиленгликоля является полиэтиленгликоль (известный как ПЭГ).

В качестве примера биотехнологического применения ПАГ можно указать некоторые активные производные ПАГ, связанные с биофармацевтическими препаратами, такими как белки и ферменты, и обладающие ценными свойствами. Поскольку ПАГ растворим в органических растворителях, то ПАГ, связанный с такими биофармацевтическими препаратами, как ферменты и белки, образует коньюгаты, растворимые и активные в органических растворителях. Связывание ПАГ с белком может уменьшать иммуногенные свойства коньюгата ПАГ-белок и скорость его клиренса в печени по сравнению с немодифицированным белком. Кроме того, связывание ПАГ с биофармацевтическими препаратами, такими как белок, может существенно увеличить полупериод циркуляции таких коньюгатов в крови.

При получении комплексов ПАГ с биофармацевтическими препаратами, такими как белок, эффективность и продолжительность действия такого лекарственного средства зависит от фармакокинетических свойств конкретного биофармацевтического препарата. В связи с иммуногенными свойствами, нерастворимостью в воде и коротким биохимическим полупериодом биофармацевтических препаратов, прежде всего белков и полипептидов, наиболее важным фактором, позволяющим обеспечить пролонгированное действие таких лекарственных препаратов, становится снижение клиренса указанных биофармацевтичсских препаратов. Снижение клиренса достигается за счет исключения или ингибирования гломерулярной фильтрации благодаря изменению заряда белка и его мол. массы (Brenner и др., Am, J. Physiol., 234, F455 (1978)). Установлено, что при повышении объема молекулы и маскировании возможных эпитопов модификация терапевтических биофармацевтических препаратов, таких как полипептид и белок, при связывании с полимером является эффективным способом снижения скорости клиренса, а также антигенности биофармацевтических препаратов, прежде всего белков. Улучшение фармакокинетических свойств лекарственных препаратов при связывании полимера ПАГ с молекулами биофармацевтических препаратов, таких как полипептиды и белки, можно объяснить следующими факторами: снижение протеолиза, повышение растворимости в воде, снижение почечного клиренса и пространственное торможение клиренса, опосредованного рецептором. Так в US 4129337 (Davis и др.) описано коньюгирование ПЭГ с белками, такими как ферменты и инсулин, для получения менее иммуногенного продукта, сохраняющего существенную часть биологической активности таких биофармацевтических препаратов.

Известно множество активных производных ПАГ, прежде всего ПЭГ, реагентов, которые предложены для модификации биофармацевтических препаратов, таких как белки (см., например, монографию Zaiipsky и др., и Harris и др., Poly (ethylengiycot) Chemistry: Biotechnical and Biomedicat Application, J.M.Harris ed., Plenum Press, New York, гл.21 и 22 (1992), большинство из которых включают промежуточную группу между ПЭГ и биофармацевтическими препаратами. Некоторые из указанных реагентов недостаточно устойчивы в водной среде, в которой обычно проводят коньюгирование. Кроме того, конъюгация часто приводит к потере биологической активности in vitro, что вызывается рядом причин, главной их которых является пространственное блокирование активного центра белков. Следовательно, требуется создание нового реагента, более устойчивого в водной среде, который можно использовать для сайт-специфичной модификации белка.

В настоящем изобретении предлагается новый класс активированных полиалкиленгликолевых кислот и реагентов на основе их активированных эфиров для коньюгирования с биофармацевтическими препаратами, такими как полипептиды, сахара, белки и терапевтически активные низкомолекулярные соединения. Указанные реагенты представляют собой соединения любой из формул

где R, R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

PAG (ПАГ) означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от 1000 до 50000 Да,

n означает целое число от 0 до 1,

m означает целое число от 4 до 8,

А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир, или его гидролизуемые сложные эфиры, если А означает водород;

где R, PAG, X и А имеют значения, указанные выше,

w означает целое число от 1 до 3,

один из R₃ и R₄ означает (низш.)алкил, а другой означает водород или (низш.)алкил;

где R, А и Х имеют значения, указанные выше,

PAG¹ означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от приблизительно 500 до приблизительно 25000 Да,

у означает целое число от 0 до 3,

v означает целое число от 1 до 3,

k означает целое число от 1 до 2.

Среди соединений формулы I-А, указанной выше, предпочтительны соединения формулы

где A, R, PAG, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше.

Другими предпочтительными соединениями формулы I-А, указанной выше, являются соединения формулы

где A, R, PAG, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше.

Предпочтительными соединениями формулы I-В, указанной выше, являются соединения формулы

где А, R, PAG, R₃, R₄ и w имеют значения, указанные выше.

Предпочтительными соединениями формулы I-С, указанной выше, являются соединения формулы

где R, PAG¹, A, v, у и k имеют значения, указанные выше.

Предпочтительно А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир, или гидролизуемые сложные эфиры, более предпочтительно А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир.

В указанных выше соединениях А предпочтительно означает водород. Кроме того, предпочтительны указанные выше соединения, в которых А означает активированную уходящую группу. В указанных выше соединениях, прежде всего в соединениях формулы I-С1, где А предпочтительно означает активированную уходящую группу, А предпочтительно означает N-гидроксисукцинимидил.

В другом предпочтительном варианте R означает метил. Кроме того, предпочтительны указанные выше соединения, в которых ПАГ означает ПЭГ, двухвалентный остаток полиэтиленгликоля, образованный за счет удаления двух концевых гидроксильных групп. Предпочтительно ПЭГ характеризуется мол. массой от 10000 до 40000, более предпочтительно от 20000 до 35000. В соединениях формулы I-С, описанных выше, где ПАГ¹ означает ПЭГ¹, ПЭГ¹ предпочтительно характеризуется мол. массой от 500 до 15000.

В другом предпочтительном варианте изобретения n равно 0, a m равно 4. Предпочтительно w равно 1.

В еще одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу получения активированного эфира формулы

где R, R¹ и R² каждый независимо означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

PAG означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гдроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от 1000 до 50000 Да,

n означает целое число от 0 до 1,

m означает целое число от 4 до 8,

А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир, причем указанный способ включает конденсацию соединения формулы

с соединением формулы

где R⁵ означает защитную гидролизуемую группу сложного эфира, Y означает галоген, а R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше, с образованием сложного эфира формулы

где R, PAG, X, R¹, R², R⁵, m и n имеют значения, указанные выше, гидролиз указанного сложного эфира с образованием свободной кислоты формулы

где R, PAG, X, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше,

и взаимодействие указанной свободной кислоты с галогенидом активированной уходящей группы в присутствии конденсирующего агента с образованием указанного активированного эфира.

В еще одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу получения активированного эфира формулы

где R означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

PAG означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от 1000 до 50000 Да,

w означает целое число от 1 до 3,

один из R₃ и R₄ означает (низш.)алкил, а другой означает водород или (низш.)алкил,

А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир, причем указанный способ включает конденсацию соединения формулы

где w, R³, R⁴ имеют значения, указанные выше, Y означает галоген, a R⁵ означает гидролизуемую защитную группу сложного эфира с соединением формулы

где R и РАС имеют значения, указанные выше, V означает -ОН или -NH₂ с образованием сложного эфира формулы

где w, R, PAG, X, R₃, R₄ и R₅ имеют значения, указанные выше, гидролиз указанного сложного эфира с образованием свободной кислоты формулы

где w, R, PAG, X, R³, R⁴ и R⁵ имеют значения, указанные выше, и взаимодействие указанной свободной кислоты с галогенидом активированной уходящей группы в присутствии конденсирующего агента с образованием указанного активированного эфира.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу получения активированного эфира формулы

где R означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

А означает водород или активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир,

PAG¹ означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от приблизительно 500 до приблизительно 25000 Да,

у означает целое число от 0 до 3,

v означает целое число от 1 до 3,

k означает целое число от 1 до 2,

причем указанный способ включает конденсацию соединения формулы

где у и v имеют значения, указанные выше, Y означает галоген, а R⁵ образует гидролизуемую защитную группу сложного эфира с соединением формулы

где R, PAG¹ и k имеют значения, указанные выше, V означает -ОН или -NH₂ с образованием сложного эфира формулы

где R, PAG¹, X, R⁵, k, v и у имеют значения, указанные выше, гидролиз указанного сложного эфира с образованием свободной кислоты формулы

где R, PAG¹, X, R⁵, k, v и у имеют значения, указанные выше,

и взаимодействие указанной свободной кислоты с галогенидом активированной уходящей группы в присутствии конденсирующего агента с образованием указанного активированного эфира.

В указанных выше способах указанная уходящая группа предпочтительно означает N-гидроксисукцинимидил.

Кроме того, предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к коньюгату формулы

где Р означает остаток биофармацевтического препарата, содержащего концевую гидроксильную группу, причем концевая гидроксильная группа удалена,

R, R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

PAG означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от 1000 до 50000 Да,

n означает целое число от 0 до 1,

m означает целое число от 4 до 8.

В описанном выше коньюгате Р предпочтительно означает гликозид или остаток AZT. Предпочтительно Х означает -О-, предпочтительно PAG означает остаток полиэтиленгликоля с мол. массой от 10000 до 15000, R предпочтительно означает метил.

Другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения является коньюгат формулы

где Р означает остаток биофармацевтического препарата, содержащего концевую гидроксильную группу, причем концевая гидроксильная группа удалена,

R, R₁ и R₂ каждый независимо означает водород или (низш.)алкил,

Х означает -О- или -NH-,

PAG означает двухвалентный остаток полиалкиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп, причем указанный остаток характеризуется мол. массой от 1000 до 50000 Да,

n означает целое число от 0 до 1,

m означает целое число от 4 до 8.

В описанном выше коньюгате Р предпочтительно означает остаток белка или полипептида, более предпочтительно Р означает полипептид Т-20, характеризующийся последовательностью SEQ ID №:1. Предпочтительно Х означает -О-, предпочтительно PAG означает остаток полиэтиленгликоля с мол. массой от 10000 до 15000.

Указанные соединения используются в качестве реагентов при получении коньюгатов биофармацевтических препаратов, таких как полипептиды, сахара, белки и гликозиды. При образовании коньюгатов с биофармацевтическими препаратами, такими как белки, пептиды и гликозиды, соединения формул I-А, I-В и I-С улучшают их фармакокинетические и фармакодинамические свойства. Клинически ценные свойства коньюгатов включают, наряду в прочими премуществами, более продолжительный полупериод циркуляции in vivo, сниженный клиренс и повышенную активность, изменение биораспределения, приводящее к увеличению активности, пониженную иммуногенность, сниженную токсичность, более высокую физическую и термическую устойчивость, устойчивость к действию протеаз. Устойчивость соединений формул I-А, I-В и I-С позволяет получать коньюгаты с биофармацевтическими препаратами и таким образом исключить возможность денатурации.

Реагенты формул I-А, I-В и I-С можно коньюгировать с амино- или гидроксигруппой в составе биофармацевтических препаратов с образованием коньюгатов, которые в существенной степени сохраняют биологическую активность исходного биофармацевтического препарата. В общем случае для целей коньюгирования предпочтительно, чтобы амино- и гидроксигруппы с составе биофармацевтических препаратов были локализованы в концевом фрагменте цепи. Реагенты по изобретению могут связываться именно с концевыми амино- и карбоксигруппами с образованием конюгатов по настоящему изобретению. Реагенты по изобретению устойчивы в водной среде и легко взаимодействуют с биофармацевтическими препаратами с образованием коньюгатов, которые можно вводить в терапевтических целях в водной среде.

Термин полиалкиленгликоль означает радикалы поли((низш.)алкилен)гликоля, где алкиленовый радикал означает радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 7 атомов углерода. Термин "(низш.)алкилен" означает двухвалентный алкиленовый радикал с прямой или разветвленной цепью, содержащей от 2 до 7 атомов углерода, такой как полиэтилен, поли-н-пропилен, полиизопропилен, поли-н-бутилен и полизобутилен, а также полиалкиленгликоли, образованные из смешанных алкиленгликолей, такие как полимеры, содержащие смесь радикалов полиэтилена и полипропилена, и полимеры, содержащие смесь радикалов полиизопропилена, полиэтилена и полиизобутилена. Радикалы алкиленгликоля с разветвленной цепью содержат в полимерной цепи (низш.)алкильные группы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, и в зависимости от числа атомов углерода, содержащихся в прямой цепи алкиленовой группы, общее число атомов углерода в любом алкиленовом остатке в составе полиалкиленгликолевого заместителя составляет от 2 до 7 атмов углерода. Термин "(низш.)алкил" включает (низш.)алкильные группы, содержащие от 1 до 7 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, такие как метил, этил, пропил, изопропил и т.п., прежде всего предпочтителен метил.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения ПАГ в соединениях формул I-А, I-В и I-С означает остаток полиэтиленгликоля, образованный при удалении двух концевых гидроксильных групп. Кроме того, остатки ПАГ по настоящему изобретению в соединении формулы I-А и I-В характеризуются мол. массой от приблизительно 10000 до приблизительно 50000, наиболее предпочтительно от приблизительно 20000 до приблизительно 40000, прежде всего предпочтительно от приблизительно 25000 до приблизительно 35000. В соединении формулы I-С в общем случае предпочтительно, чтобы общая мол. масса двух радикалов ПАГ¹ составляла от приблизительно 10000 до приблизительно 50000, предпочтительно от приблизительно 20000 до приблизительно 40000, наиболее предпочтительно от приблизительно 25000 до приблизительно 35000.

Реагенты формулы I-А, I-В и I-С можно коньюгировать с любым известным биофармацевтичсским препаратом, который содержит свободную гидрокси- или аминогруппу. Конденсацию можно проводить со свободной кислотой или с активированным эфиром.

Соединения формул I-А, I-В и I-С по настоящему изобретению можно вводить в реакцию со свободной гидрокси- или свободной аминогруппой биофармацевтического препарата, который содержит белковый, пептидный или небольшой органический фрагмент, с образованием коньюгата в виде сложного эфира или амида.

Коньюгаты по настоящему изобретению в виде сложного эфира или амида можно получать с использованием реагентов по изобретению по следующим схемам. При образовании коньюгатов в виде сложного эфира реагенты взаимодействуют с биофармацевтическим препаратом, содержащим концевую гидроксигруппу, как показано ниже

где Р означает остаток биофармацевтического препарата, содержащего концевую гидроксигруппу, причем указанная концевая группа удалена.

На указанной схеме В означает остаток соединений I-А, I-В и I-С, не содержащий концевой реакционно-способной карбоксильной группы или уходящей группы активированного эфира. При проведении указанной реакции можно использовать любой стандартный метод получения сложного эфира, включающий взаимодействие реакционно-способной карбоксильной группы со спиртом, с образованием коньюгата в виде сложного эфира. Предпочтительным методом является конденсация кислоты со спиртом в присутствии конденсирующего агента, такого как дициклогексилкарбодиимид, с использованием катализатора конденсации. При этом можно использовать любой стандартный катализатор конденсации, такой как 1-гидроксибензотриазол и (4-диметиламино)пиридин, или их смеси. В общем случае реакцию проводят в инертном органическом растворителе. Реакцию можно проводить со свободной кислотой или с ее активированным эфиром. При проведении реакции с активированным эфиром нет необходимости использовать катализатор конденсации и/или конденсирующий агент. При проведении указанной реакции температура и давление не имеют решающего значения и реакцию можно проводить при комнатной температуре. Однако при необходимости реакцию можно проводить при более высоких или более низких температурах. На схеме Р может означать остаток любого биофармацевтического препарата, содержащего концевую гидроксигруппу. При получении указанных сложных эфиров предпочтительные биофармацевтические препараты, содержащие концевую гидроксигруппу, включают нуклеозиды, такие как АЗТ (AZT). Кроме того, Р может означаеть любой низкомолекулярный биофармацевтический препарат, содержащий концевую гидроксигруппу.

При получении амидов используют соединение, показанное на следующей схеме

где Р¹ означает остаток биофармацевтического препарата, содержащего концевую аминогруппу, причем указанная концевая аминогруппа удалена.

На приведенной схеме остаток В имеет значения, указанные выше. Р¹ может означать остаток любого биофармацевтического препарата, содержащего концевую аминогруппу, такого как белок или пептид или низкомолекулярный биофармацевтический препарат, содержащий концевую аминогруппу. Предпочтительные белки и пептиды включают интерферон-α, интерферон-β, консенсус интерферон, гранулоцит-колонийстимулирующий фактор (GCSF), гранулоцит/макрофаг-колонийстимулирующий фактор (GM-CSF), интерлейкины, колонийстимулирующий фактор, а также иммуноглобулины, такие как IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, и их фрагменты. Другие предпочтительные биофармацевтические препараты, содержащие аминогруппу, включают пептиды, указанные в US 5464933, прежде всего пептид Т-20, характеризующийся аминокислотной последовательностью

Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe (SEQ ID:1).

Реакцию получения амида проводят любым стандартным методом конденсации кислоты или активированного эфира (ОА) с амином с образованием пептидной связи. При получении коньюгата для образования пептидной связи используют любой стандартный метод взаимодействия кислоты и амина с образованием амида.

ОА по изобретению может означать любую уходящую группу активированной кислоты. Предпочтительные уходящие группы активированных кислот включают галогены, такие как хлор и бром, N-сукцинимидилокси, сульфо-N-сукцинимидилокси, 1-бензотриазолилокси, 1-имидазолил, пара-нитрофенилокси, 2,3,4-трихлорфенилокси, пентахлорфенилокси, пентафторфенилокси, N-фталимидилокси, N-тетрагидрофталимид, N-глутаримид, 1-гидроксипиперидин, 5-хлор-8-гидроксихинолин, N-норборнен-2,3-дикабоксимид и гидрокси-7-азабензотриазол.

Соединение формулы I-А, где Х равно 0

где A, R, PAG, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше, получают при взаимодействии соединения PAG-гидрокси формулы

где R и РАС имеют значения, указанные выше,

с соединением формулы

где R⁵ образует гидролизуемую защитную группу сложного эфира, Y означает галоген, а R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше, по следующей схеме

где R, PAG, m и n имеют значения, указанные выше, а А¹ означает активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным атомом кислорода образует сложный эфир.

При конденсации соединения формулы V с соединением формулы VI получают соединение формулы VIII. При проведении указанной реакции соединение формулы V взаимодействует с соединением формулы VI в органическом растворителе при кипячении с обратным холодильником в присутствии гидрида щелочного металла, такого как гидрид натрия. При этом используют любой стандартный метод конденсации спирта с галогенидом. В общем случае предпочтительно используют инертный органический растворитель из группы ароматических углеводородов, такой как бензол и толуол. Однако при проведении реакции можно использовать любой пригодный инертный органический растворитель. В соединении формулы VI группа R³ может означать любую известную гидролизуемую защитную группу сложного эфира. В общем случае, указанные гидролизуемые защитные группы сложных эфиров включают (низш.)алкильные защитные группы. Соединение формулы VIII гидролизуют с образованием соединения формулы IX обычными методами, такими как гидролиз в присутствии основания, такого как гидроксид щелочного металла в водной среде. Затем кислоту формулы IX переводят в активированную форму, соединение формулы X, с использованием активирующей уходящей группы, такой как N-гидроксисукцинимидильная группа, при взаимодействии с N-гидроксисукцинимидом. Однако при получении соединения формулы Х можно использовать любые известные активирующие уходящие группы, такие как указанные выше. Для получения соединения формулы Х можно использовать любой известный метод получения активированного эфира карбоновой кислоты, содержащего активированную уходящую группу, такую как N-гидроксисукцинимидильная группа.

Получение соединения I-А-1, которое включает соединения формулы IX и X, конденсацией соединения формулы V с соединеним формулы VI по вышеуказанной схеме иллюстрируется следующими общими методиками.

5 г соединения ПЭГ формулы V (мол. масса от 1000 до 40000) в 50-100 мл толуола сушили азеотропной перегонкой при кипячении с обратным холодильником в течение 1-3 ч, а затем удаляли 20-30 мл толуола. Полученную смесь растворяли в 20-30 мл безводного тетрагидрофурана и добавляли по каплям к гидриду натрия (5-10-кратный молярный избыток) в безводном тетрагидрофуране в атмосфере аргона, помещенному в круглодонную колбу. Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. При получении соединения формулы VIII использовали следующие сложные эфиры галогенсодержащих кислот формулы VI: метиловый эфир 5-бромвалериановой кислоты; или этиловый эфир 5-иодвалериановой кислоты; или этиловый эфир 6-бромгексановой кислоты, этиловый эфир ω-хлорвалериановой кислоты; или метиловый эфир 6-бромгексановой кислоты; или метиловый эфир 7-бромгептановой кислоты; или этиловый эфир 7-бромгептановой кислоты; или метиловый эфир 8-бромоктановой кислоты; или этиловый эфир 8-бромоктановой кислоты; или метиловый эфир 10-бромдекановой кислоты; или этиловый эфир ω-бромундекановой кислоты; или метиловый эфир 11-бромундекановой кислоты, или метиловый эфир броммиристиновой кислоты; или этиловый эфир 15-бромпентадекановой кислоты; или метиловый эфир 16-бромгексадекановой кислоты; или метиловый эфир 17-бромгептадекановой кислоты; или метиловый эфир 3-хлорбутановой кислоты, метиловый эфир 3-бромбутановой кислоты; или этиловый эфир 3-бромбутановой кислоты, этиловый эфир β-бромвалериановой кислоты; или этиловый эфир β-бромкапроновой кислоты. Сложный эфир указанной кислоты (5-10-молярный избыток) добавляли к реакционной смеси с использованием шприца и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе, к остатку, содержащему соединение формулы VIII, добавляли 2-пропанол/диэтиловый эфир (1:1), осадок, соединение формулы VIII, отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме.

Сложный эфир ПЭГ-кислоты формулы VIII (4 г) растворяли в 50-100 мл 1 н. раствора гидроксида натрия и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К смеси добавляли 1-6 н. соляную кислоту до рН 2,5-3,0 и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и продукт осаждали добавлением диэтилового эфира. Продукт, ПЭГ-кислоту формулы IX, отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме.

ПЭГ-кислоту формулы IX (2 г) растворяли в безводном дихлорметане (10-20 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (1,05-2,0-кратный молярный избыток) и дициклогексилкарбодиимид (1,05-2,0-кратный молярный избыток) и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение ночи. Затем смесь фильтровали, концентрировали и продукт осаждали добавлением 2-пропанола/диэтилового эфира (1:1). Продукт высушивали в вакууме в течение ночи, при этом получали активированный эфир формулы Iа1 (соединение формулы X).

Соединение формулы I-А, где Х означает NH, формулы

где A, R, PAG, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше, получают из соединения

где R и РАС имеют значения, указанные выше,

сначала при взаимодействии соединения формулы XII с соединением формулы VI с образованием соединения формулы

где R, R¹, R², R⁵, PAG, m и n имеют значения, указанные выше.

Соединение формулы XIII получают конденсацией амина формулы XII с галогенпроизводным формулы VI. При этом можно использовать любой стандартный метод конденсации амина с галогенсодержащим соединением. Затем из соединения формулы XIII получают соединение формулы I-А2, где А означает уходящую группу, через промежуточное соединение формулы

где R, PAG, R¹, R², m и n имеют значения, указанные выше.

Указанную реакцию с образованием соединения формулы XIV проводят обычным гидролизом в присутствии основания, как описано выше. Из соединения формулы XIV получают соединение формулы 1А2, где А означает актвированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным кислородом образует сложный эфир, аналогично тому, как описано при превращении соединения формулы IX в соединение формулы X.

В общем случае способ получения соединения формулы 1А2, где А означает активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным кислородом образует сложный эфир, с использованием сначала взаимодействия соединения формулы XII с соединением формулы VI с образованием соединения формулы 1А2, иллюстрируется следующей общей схемой.

Первая стадия

5 г ПЭГ-амина формулы XII (мол. массы от 1000 до 40000) растворяли в 25-50 мл абсолютного этанола. Затем к раствору ПЭГ добавляли соединение формулы VI, которое может означать метиловый эфир 5-бромвалериановой кислоты или (этиловый эфир 5-йодвалериановой кислоты; или этиловый эфир 6-бромгексановой кислоты, или этиловый эфир ω-хлорвалериановой кислоты; или метиловый эфир 6-бромгексановой кислоты; или метиловый эфир 7-бромгептановой кислоты; или этиловый эфир 7-бромгептановой кислоты; или метиловый эфир 8-бромоктановой кислоты; или этиловый эфир 8-бромоктановой кислоты; или метиловый эфир 10-бромдекановой кислоты; или этиловый эфир ω-бромундекановой кислоты; или метиловый эфир 11-бромундекановой кислоты, или метиловый эфир броммиристиновой кислоты; или этиловый эфир 15-бромпентадекановой кислоты; или метиловый эфир 16-бромгексадекановой кислоты; или метиловый эфир 17-бромгептадекановой кислоты; или метиловый эфир 3-хлорбутановой кислоты, метиловый эфир 3-бромбутановой кислоты; или этиловый эфир 3-бромбутановой кислоты, этиловый эфир β-бромвалериановой кислоты; или этиловый эфир β-бромкапроновой кислоты) (5-10-кратный избыток) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе, продукт осаждали добавлением 2-пропанола/диэтилового эфира (1:1), отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, при этом получали соединение формулы XIII.

Вторая стадия

Сложный эфир ПЭГ-кислоты формулы XIII (4 г) растворяли в 50-100 мл 1 н. раствора гидроксида натрия и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. К смеси добавляли 1-6 н. соляную кислоту до рН 2,5-3,0 и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и продукт осаждали добавлением диэтилового эфира. Продукт, ПЭГ-кислоту формулы XIV, отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме.

ПЭГ-кислоту формулы XIV (2 г) растворяли в безводном дихлорметане (10-20 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (1,05-2,0-кратный молярный избыток) и дициклогексилкарбодиимид (1,05-2,0-кратный молярный избыток) и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение ночи. Затем смесь фильтровали, концентрировали и продукт осаждали добавлением 2-пропанола/диэтилового эфира (1:1). Продукт высушивали в вакууме в течение ночи, при этом получали соединение формулы I-А2, где А означает активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным кислородом образует сложный эфир.

Соединение формулы I-В, где Х равно 0, формулы

где A, R, PAG, R³, R⁴, w и n имеют значения, указанные выше,

получают при взаимодействии соединения формулы V с соединением формулы

где w, Y, R³, R⁴ и R⁵ имеют значения, указанные выше,

с образованием соединения формулы

где w, R, PAG, R₃, R₄ и R₅ имеют значения, указанные выше.

Реакцию соединения формулы XX с соединением формулы V с образованием соединений формулы XXI проводят аналогично тому, как описано при взаимодействии соединения формулы V с соединением VI с образованием соединения VII. Затем соединение формулы XX гидролизуют в присутствии основания в условиях, описанных выше, с образованием соединения формулы

где R, PAG, R³ и R⁴ имеют значения, указанные выше.

Затем из соединения формулы XXII получают соединение формулы I-В1, где А означает активированную уходящую группу, которая вместе с присоединенным кислородом образует сложный эфир. Указанную реакцию проводят аналогично тому, как описано при получении соединения формулы Х из соединения IX.

Соединение формулы I-В, где Х означает NH, формулы

где A, R, PAG, R³, R⁴ и w имеют значения, указанные выше,

получают при взаимодействии соединения формулы XII с соединением формулы XX, при этом получают соединение формулы

где R, ПАГ, R₃, R₄ и R₅ имеют значения, указанные выше.

Реакцию соединения формулы XX с соединением формулы XII с образованием соединения формулы XXV проводят аналогично тому, как описано для реакции соединения формулы XII с соединением формулы VI с образованием соединения XIII. Затем соединение формулы XXV гидролизуют в присутствии основания в условиях, описанных выше, с образованием соединения формулы

где R, PAG, R³ и R⁴ и w имеют значения, указанные выше.

Получение соединения формулы I-В2 по реакции соединения формулы XX с соединением формулы III проводят аналогично тому, как описано при получении соединения формулы I-А2, при замене соединения формулы XX на соединение формулы VI.

Соединение формулы I-С, где Х равно 0, формулы

где R, PAG¹, A, v, у и k имеют значения, указанные выше, получают при взаимодействии соединения формулы

где Y, R⁵, у и v имеют значения, указанные выше,

с соединением формулы

где R, PAG и k имеют значения, указанные выше.

Получение соединения формулы I-С1 проводят, как показано на следующей схеме

где A¹, R, PAG¹, n и v имеют значения, указанные выше.

При получении соединения формулы I-С1 два моля соединения формулы XXXVI вводят в реакцию с одним мол