Полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды

Полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим протеазной активностью, и выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим указанные полипептиды. Данное изобретение относится также к конструкциям на основе нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанные последовательности нуклеиновых кислот, а также к способам получения и применения указанных полипептидов.

Предпосылки изобретения

Клонирование гена пенициллолизина (plnC) из штамма Penicillium citrinum описано в статье Matsumoto et al., in Biochim. Biophys. Acta 1218: 469 (1994). Последовательность была включена в базу данных EMBL под номером D25535.

В заявке WO 97/46689 описаны нижеследующие (кодирующие) последовательности протеазы, выделенные из специфических штаммов Aspergillus:

SEQ ID No.1 в заявке WO 97/46689 представляет неполный ген рерН Aspergillus niger;

SEQ ID No.2 в заявке WO 97/46689 представляет неполную кДНК рерН Aspergillus niger;

SEQ ID No.3 в заявке WO 97/46689 представляет неполную аминокислотную последовательность РЕРН Aspergillus niger;

SEQ ID No.4 в заявке WO 97/46689 представляет ген pepI Aspergillus nidulans;

SEQ ID No.5 в заявке WO 97/46689 представляет кДНК pepI Aspergillus nidulans; и

SEQ ID No.6 в заявке WO 97/46689 представляет аминокислотную последовательность PEPI Aspergillus nidulans.

В статье Ramesh et al., Gene 165(1):121-125 (1995), описано клонирование и исследование генов, кодирующих протеазы из штаммов Aspergillus flavus и Aspergillus fumigatus. Указанные последовательности включены в базу данных EMBL соответственно под номерами L7524 и U24146.

Последовательность вариантной нейтральной протеазы, созданной на основе нейтральной протеазы II из штамма Aspergillus oryzae, описана в патенте Японии 05-168479. Клонирование родительской нейтральной протеазы II Aspergillus oryzae описано в статье Hiroki Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. (1991), 228, p. 97-103.

Зрелые пептидные части вышеуказанных протеаз идентичны зрелой пептидной части протеазы Thermoascus по настоящему изобретению на 75,7% или меньше.

Нуклеотидные последовательности, соответствующие зрелым пептидным частям вышеуказанных протеаз, идентичны нуклеотидной последовательности, соответствующей зрелой пептидной части протеазы Thermoascus по настоящему изобретению, на 68,4% или меньше.

Целью настоящего изобретения является получение альтернативных протеаз, предназначенных для использования в корме для животных.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим протеазной активностью, которые выбраны из группы, состоящей из:

(а) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична аминокислотам -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2;

(b) полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, которая гибридизирует в условиях низкой (степени) строгости (жесткости) с:

(i) зрелой протеазой, кодирующей часть плазмиды, находящейся в штамме DSM 14652 Escherichia coli;

(ii) нуклеотидами 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 или 559-1089 SEQ ID No.1;

(iii) субпоследовательностью (i) или (ii), содержащей по крайней мере 100 нуклеотидов, или

(iv) комплементарной цепью последовательности (i), (ii) или (iii);

(с) варианта полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, включающую аминокислоты -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2, включающего замены, делеции и/или инсерции одной или более аминокислот;

(d) аллельного варианта полипептида (а) или (b);

(е) фрагмента полипептида (а), (b) или (d), обладающего протеазной активностью.

SEQ ID No.1 представляет последовательность кДНК протеазы из штамма CGMCC № 0670 Thermoascus aurantiacus (SEQ ID No.1), и SEQ ID No.2 представляет выведенную из нее аминокислотную последовательность.

Настоящее изобретение относится также к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим полипептиды, и к конструкциям на основе нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, а также к способам получения и применения полипептидов, в частности, в корме для животных.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показаны результаты испытания на ингибирование с использованием протеазы штамма CGMCC №0670 Thermoascus aurantiacus.

На фигуре 2 показан температурный профиль вышеуказанного испытания.

На фигуре 3 показан профиль показателей рН вышеуказанного испытания.

На фигуре 4 показана устойчивость к показателям рН в вышеуказанном испытании.

На фигуре 5 показаны результаты испытания на субстратную специфичность в вышеуказанном испытании.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили новый класс протеаз, которые могут быть пригодны для использования в корме для животных. Большинство известных кормовых протеаз являются сериновыми протеазами, причем многие из указанных протеаз не обладают достаточной кислотостойкостью, чтобы избежать разрушения в кислотной среде желудка. Протеазы по данному изобретению представляют собой кислотостойкую металлопротеазу, выделенную из Thermoascus aurantiacus. Зрелая полипептидная часть указанной протеазы содержит аминокислоты 1-177 SEQ ID No.2. При выполнении исследований in vitro, имитирующих пищеварение у животных с однокамерным желудком и рыб, было установлено, что протеаза Thermoascus aurantiacus может увеличивать количество растворимого и расщепляемого белка и повышать степень гидролиза белка. Гомологичный новый полипептид обнаружен в Aspergillus oryzae (аминокислоты 177-353 SEQ ID No.11).

Полипептиды, обладающие протеазной активностью

Протеазы иногда именуются также пептидазами, протеиназами, пептидными гидролазами или протеолитическими ферментами. Протеазы могут относиться к экзо-типу, в соответствии с которым гидролиз пептидов происходит, начиная с любого конца, или к эндо-типу, в соответствии с которым гидролиз происходит внутри полипептидных цепей (эндопептидазы). Эндопептидазы активно воздействуют на пептидные субстраты, блокированные у N- и C-конца, что характерно для специфичности рассматриваемой протеазы.

Термин "протеаза" в используемом здесь значении означает фермент, который гидролизует пептидные связи. Протеаза означает любой фермент, относящийся к группе ферментов ЕС 3.4 (включая ферменты тринадцати подклассов). Номер ЕС относится к номенклатуре ферментов, представленной в Enzyme Nomenclature 1992 NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, включая дополнения 1-5, опубликованные соответственно в журналах Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; и Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650. Данная номенклатура регулярно дополняется и обновляется; см., например, в Интернете (WWW) на сайте http://www.chem.gmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html).

Протеазы классифицированы с учетом их каталитического механизма в следующие группы: сериновые протеазы (S), цистеиновые протеазы (С), аспарагиновые протеазы (А), металлопротеазы (М) и неизвестные или еще не классифицированные протеазы (U); см. справочник Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds.), Academic Press (1998), в частности, общее введение.

В конкретных вариантах осуществления изобретения протеазы по данному изобретению выбраны из группы, состоящей из:

(а) протеаз, относящихся к металлоэндопептидазам ЕС 3.4.24;

(b) металлопротеаз, относящихся к группе М, приведенных в вышеуказанном справочнике;

(с) металлопротеаз, еще не отнесенных к какому-либо классу (обозначение: Clan MX) или относящихся к одному из классов МА, МВ, МС, MD, ME, MF, MG, MH (рассмотренные на стр. 989-991 вышеуказанного справочника);

(d) других семейств металлопротеаз (рассмотренных на стр. 1448-1452 вышеуказанного справочника);

(е) металлопротеаз с фрагментом HEXXH;

(f) металлопротеаз с фрагментом HEFTH;

(g) металлопротеаз, относящихся к одному из семейств М3, М26, М27, М32, М34, М35, М36, М41, М43 или М47 (рассмотренные на стр. 1448-1452 вышеуказанного справочника); и

(h) металлопротеаз, относящихся к семейству М35 (рассмотренные на стр. 1492-1495 вышеуказанного справочника).

В других конкретных вариантах осуществления изобретения металлопротеазы являются гидролазами, в которых нуклеофильное воздействие на пептидную связь опосредовано молекулой воды, активируемой катионом двухвалентного металла. Примерами катионов двухвалентных металлов являются цинк, кобальт или марганец. Ион металла может удерживаться в требуемом положении лигандами аминокислот. Число лигандов может быть равно пяти, четырем, трем, двум, одному или нулю. В конкретном варианте осуществления изобретения число лигандов равно двум или трем, предпочтительно трем.

Чтобы определить, является ли данная протеаза металлопротеазой или нет, следует обратиться к вышеуказанному справочнику и к изложенным в нем принципам. Такое определение можно произвести для всех типов протеаз независимо от того, относится такая протеаза к природному или дикому типу, является генетически сконструированной или синтетической.

Активность протеазы можно измерить при помощи любого анализа, в котором используется субстрат, имеющий пептидные связи, соответствующие специфичности исследуемой протеазы. Показатель рН и температуру анализа необходимо также привести в соответствие с исследуемой протеазой. Примерами значений рН для анализа являются рН 6, 7, 8, 9, 10 или 11. Примерами температур для анализа являются 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 80°С.

Примером субстрата для протеазы является казеин, в частности казеин, сшитый с азурином (AZCL-казеин). Два анализа протеазы описаны в примере 1, из которых так называемый анализ с использованием AZCL-казеина является более предпочтительным для достижения целей настоящего изобретения.

Не существует ограничений, относящихся к происхождению протеазы по данному изобретению. Таким образом, термин "протеаза" включает не только протеазы природного или дикого типа, полученные из микроорганизмов любого рода, но также любые мутанты, варианты, фрагменты и т.д., обладающие протеазной активностью, а также синтетические протеазы, такие как инвертированные протеазы и консенсусные протеазы. Такие генетически сконструированные протеазы можно получить методами, известными в данной области, например, при помощи сайт-направленного мутагенеза, полимеразной цепной реакции (PCR) (используя фрагмент PCR, содержащий требуемую мутацию в качестве одной из затравок при выполнении реакций PCR) или неспецифического мутагенеза. Получение консенсусных белков описано, например, в европейском патенте ЕР 897985. Термин "полученный из" применительно к данному источнику означает, что полипептид, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, продуцирован источником или клеткой, в которых присутствует данная последовательность нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид секретируется вне клетки.

В конкретном варианте осуществления изобретения протеаза является слабоаллергенным вариантом, вызывающим пониженную иммунологическую реакцию при воздействии на животных, включая человека. Термин "иммунологическая реакция" означает любую реакцию иммунной системы животного под действием данной протеазы. Одним типом иммунологической реакции является аллергическая реакция, вызывающая повышение уровней IgE у подвергнутого такому воздействию животного. Слабоаллергенные варианты можно получить методами, известными в данной области. Например, протеаза может быть конъюгирована с полимерами, защищающими части или эпитопы протеазы, вызывающие иммунологическую реакцию. Конъюгация с полимерами может включать химическое связывание полимера с протеазой in vitro, как это описано, например, в заявках WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 и/или WO 99/00489. Конъюгация может дополнительно или альтернативно включать связывание полимеров с протеазой in vivo. Такая конъюгация может быть достигнута путем создания методами генетической инженерии нуклеотидной последовательности, кодирующей протеазу, введения в протеазу консенсусных последовательностей, кодирующих дополнительные сайты гликозилирования, и экспрессии протеазы в хозяине, способном гликозилировать протеазу, как это описано, например, в заявке WO 00/26354. Другим способом получения слабоаллергенных вариантов является создание методами генетической инженерии нуклеотидной последовательности, кодирующей протеазу, которая вызывает аутоолигомеризацию протеазы, благодаря которой одни мономеры протеазы могут защищать эпитопы других мономеров протеазы и уменьшать, таким образом, антигенность олигомеров. Такие продукты и их получение описаны, например, в заявке WO 96/16177. Эпитопы, вызывающие иммунологическую реакцию, могут быть идентифицированы разными методами, такими как метод выявления фагов, описанный в заявках WO 00/26230 и WO 01/83559, или неспецифический подход, описанный в ЕР №561907. После идентификации эпитопа его аминокислотную последовательность можно изменить с получением измененных иммунологических свойств протеазы, используя известные методы манипуляции генами, такие как сайтнаправленный мутагенез (см., например, заявки WO 00/26230, WO 00/26354 и/или WO 00/22103), и/или конъюгируя полимер в достаточной близости к эпитопу, чтобы защитить эпитоп.

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотам -178-177, -159-177 или предпочтительно аминокислотам 1-177 (зрелый полипептид) SEQ ID No.2 по крайней мере примерно на 64% или по крайней мере примерно на 65%, по крайней мере примерно на 70% или по крайней мере примерно на 75%, по крайней мере примерно на 76% или по крайней мере примерно на 77%, по крайней мере примерно на 78% или по крайней мере примерно на 79%, по крайней мере примерно на 80% или по крайней мере примерно на 82%, по крайней мере примерно на 85%, или по крайней мере примерно на 90%, или по крайней мере примерно на 95%, или по крайней мере примерно на 97%, и обладает протеазной активностью (далее именуемые "гомологичные полипептиды"). В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептиды по данному изобретению i) имеют или ii) состоят из аминокислотной последовательности с вышеуказанной степенью идентичности.

Протеаза Thermoascus aurantiacus, зрелый полипептид которой содержит аминокислоты 1-177 SEQ ID No.2, несомненно, является одним примером полипептида по данному изобретению.

Другой полипептид по данному изобретению, полученный из Aspergillus oryzae, содержит SEQ ID No.11 или аминокислоты -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 или 177-397 и кодируется SEQ ID No.10 или соответственно ее нуклеотидами 2-1129, 2-1195, 2-1267, 71-1129, 71-1195, 71-1267, 599-1129, 599-1195 или 599-1267.

В соответствии с целями настоящего изобретения степень идентичности двух аминокислотных последовательностей, а также степень идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить при помощи программы "Align", которая представляет собой сопоставление по Нидлману-Вуншу (то есть глобальное сопоставление). Указанная программа используется для сопоставления полипептидных и нуклеотидных последовательностей. Для сопоставления полипептидов используется матрица подсчета по умолчанию BLOSUM50 и для сопоставления нуклеотидов используется матрица идентичности по умолчанию. За первый остаток разрыва цепи начисляется -12 очков для полипетидов и -16 очков для нуклеотидов. За последующие остатки разрыва цепи начисляется -2 очка для полипептидов и -4 очка для нуклеотидов.

Программа "Align" является частью пакета программ FASTA версии v20u6 (см. W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, and W.R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). В программе сопоставления белков FASTA использован алгоритм Смита-Уотермана без ограничения величины разрыва цепи (см. "Smith-Waterman algorithm", T.F. Smith and M.S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

В конкретном варианте осуществления изобретения гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается сорока, тридцатью пятью, тридцатью, двадцатью пятью, двадцатью или пятнадцатью аминокислотами. В другом варианте осуществления изобретения гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается десятью, девятью, восьмью, семью, шестью или пятью аминокислотами. В другом конкретном варианте осуществления изобретения гомологичные полипептиды отличаются четырьмя, тремя или двумя аминокислотами либо одной аминокислотой из аминокислот -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2.

В конкретных вариантах осуществления изобретения полипептиды по настоящему изобретению а) имеют или b) состоят из

i) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2;

ii) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 или 177-397 SEQ ID No.11; или

аллельных вариантов или фрагментов последовательностей i) и ii), обладающих протеазной активностью.

Фрагмент аминокислот -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2 или аминокислот -23-353, -23-374, -23-397, 1-353, 1-374, 1-397, 177-353, 177-374 или 177-397 SEQ ID No.11 представляет полипептид, в котором одна или более аминокислот удалены из амино- и/или карбоксильного конца указанных аминокислотных последовательностей. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент содержит по крайней мере 75 аминокислотных остатков, или по крайней мере 100 аминокислотных остатков, или по крайней мере 125 аминокислотных остатков, или по крайней мере 150 аминокислотных остатков, по крайней мере 160 аминокислотных остатков, или по крайней мере 165 аминокислотных остатков, или по крайней мере 170 аминокислотных остатков, или по крайней мере 175 аминокислотных остатков.

Аллельный вариант представляет собой одну из двух или более альтернативных форм гена, занимающего тот же хромосомный локус. Аллельный вариант образуется в результате мутации и может привести к полиморфизму в популяциях. Генные мутации могут быть "молчащими" (отсутствие изменений в кодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, содержащие измененные аминокислотные последовательности. Аллельным вариантом полипептида является полипептид, кодированный аллельным вариантом гена.

Настоящее изобретение относится также к выделенным полипептидам, обладающим протеазной активностью, которые кодированы последовательностями нуклеиновых кислот, гибридизирующими в условиях очень низкой, низкой, средней, средне-высокой, высокой или очень высокой строгости с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизирует в тех же условиях (а) с нуклеотидами 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 или предпочтительно с нуклеотидами 559-1089 SEQ ID No.1, (b) с последовательностью кДНК, находящейся в нуклеотидах 559-1089 SEQ ID No.1, (с) с субпоследовательностью последовательности (а) или (b), (d) с комплементарной цепью последовательности (а), (b) или (с) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). В одном конкретном варианте осуществления изобретения зонд нуклеиновой кислоты выбирают из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот (а), (b), (c) или (d).

Последовательности нуклеотидов 559-1089, 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344 или 559-1344 SEQ ID No.1 могут содержать по крайней мере 100 нуклеотидов или в другом варианте осуществления изобретения по крайней мере 200 нуклеотидов. Кроме того, указанная последовательность может кодировать фрагмент полипептида, обладающий протеазной активностью.

Последовательности нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотиды 559-1089, 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344 или 559-1344 SEQ ID No.1 или их субпоследовательность, а также аминокислотные последовательности, содержащие аминокислоты -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2 или их фрагмент, можно использовать для создания зонда нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие протеазной активностью, из штаммов других родов или видов методами, хорошо известными в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК представляющего интерес рода или вида стандартными методами саузерн-блоттинга, чтобы идентифицировать и выделить соответствующий ген. Такие зонды могут быть значительно короче всей последовательности, но должны содержать по крайней мере 15, предпочтительно по крайней мере 25 и более предпочтительно по крайней мере 35 нуклеотидов. Можно также использовать более длинные зонды. Можно использовать ДНК- и РНК-зонды. Зонды обычно метят для обнаружения соответствующего гена (например, ³²Р, ³Н, ³⁵S, биотином или авидином). Такие зонды входят в объем настоящего изобретения.

Таким образом, можно произвести скрининг библиотеки геномной ДНК или кДНК, полученной из других подобных организмов, для скрининга ДНК, гибридизирующейся с вышеописанными зондами и кодирующей полипептид, обладающий протеазной активностью. Геномную или другую ДНК из других подобных организмов можно выделить электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле или другими методами выделения. ДНК из библиотек или выделенную ДНК можно перенести или иммобилизовать на нитроцеллюлозе или другом приемлемом носителе. Чтобы идентифицировать клон или ДНК, гомологичную SEQ ID No.1 или ее субпоследовательности, носитель используют при выполнении анализа методом саузерн-блоттинга. В соответствии с целями настоящего изобретения гибридизация показывает, что последовательность нуклеиновой кислоты гибридизирует с меченым зондом нуклеиновой кислоты, соответствующим последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID No.1, ее комплементарной цепи или субпоследовательности, в условиях от очень низкой до очень высокой строгости. Молекулы, с которыми гибридизирует зонд нуклеиновой кислоты в указанных условиях, можно обнаружить при помощи рентгеновской пленки.

В конкретном варианте осуществления изобретения зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2, или ее субпоследовательности. В другом варианте осуществления изобретения зонд нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 или предпочтительно нуклеотиды 559-1089 SEQ ID No.1 (кодирующая зрелый полипептид область SEQ ID No.1). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения зонд нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты или предпочтительно ее область, кодирующую зрелый полипептид, которая находится в плазмиде, находящейся в Escherichia coli DSM 14652, при этом последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, обладающий протеазной активностью.

Для получения длинных зондов, содержащих по крайней мере 100 нуклеиотидов, условия от очень низкой до очень высокой строгости определяются как прегибридизация и гибридизация при 42°С в 5-кратном объеме SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК спермы лосося и 25% формамида для условий очень низкой и низкой строгости, 35% формамида для условий средней и средне-высокой строгости или 50% формамида для условий высокой и очень высокой строгости в соответствии со стандартными методами саузерн-блоттинга.

Для получения длинных зондов, содержащих по крайней мере 100 нуклеотидов, носитель трижды промывают по 15 минут, используя 2-кратный объем SSC, 0,2% SDS, предпочтительно по крайней мере при 45°С (условия очень низкой строгости), более предпочтительно по крайней мере при 50°С (условия низкой строгости), более предпочтительно по крайней мере при 55°С (условия средней строгости), более предпочтительно по крайней мере при 60°С (условия средне-высокой строгости), еще предпочтительнее по крайней мере при 65°С (условия высокой строгости) и наиболее предпочтительно по крайней мере при 70°С (условия очень высокой строгости).

Для получения коротких зондов длиной от около 15 нуклеотидов до около 70 нуклеотидов строгие условия определяются как прегибридизация, гибридизация и промывка после гибридизации при температуре на 5°С-10°С ниже вычисленной температуры Т_m при выполнении вычислений Болтона и МакКартни (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) в 0,9 М NaCl, 0,09 М трис-HCl c рН 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1 объем раствора Денгардта, 1 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ одноосновного фосфата натрия, 0,1 мМ АТФ и 0,2 мг РНК дрожжей на мл в соответствии со стандартными методами саузерн-блоттинга.

Для получения коротких зондов длиной от около 15 нуклеотидов до около 70 нуклеотидов носитель один раз промывают в 6-кратном объеме SCC с 0,1% SDS в течение 15 минут и дважды промывают 6-кратным объемом SSC в течение 15 минут при температуре на 5°С-10°С ниже вычисленной температуры Т_m.

Настоящее изобретение относится также к вариантам полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот 1-177, -159-177 или -178-177 SEQ ID No.2, включающим замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот.

Аминокислотные последовательности вариантных полипептидов могут отличаются от аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислот 1-177, -159-177 или -178-177 SEQ ID No.2, вследствие инсерции или делеции одного или более аминокислотных остатков и/или замены одного или более аминокислотных остатков другими аминокислотными остатками. Замены аминокислот предпочтительно должны быть незначительными, например консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают существенного влияния на укладку цепи и/или активность белка, небольшие делеции обычно от одной до около 30 аминокислот, небольшие удлиняющие фрагменты у амино- или карбоксильного конца, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид, содержащий примерно 20-25 остатков; или небольшой удлиняющий фрагмент, облегчающий очистку благодаря изменению суммарного заряда или другой функции, такой как полигистидиновый хвост, антигенный эпитоп или домен связывания.

Примеры консервативных замен относятся к группе основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и аминокислот с короткой цепью (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Замены аминокислот, которые фактически не изменяют удельную активность, известны в данной области и описаны, например, в публикации H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, а также указанные замены в обратном порядке.

Настоящее изобретение относится также к выделенным полипептидам, обладающим протеазной активностью, которые выбраны из группы, состоящей из:

(f) полипептидов, имеющих

(i) вычисленную молекулярную массу от около 17 до около 22 кДа, предпочтительно от около 18 до около 21 кДа или от около 19 до около 20 кДа; или экспериментально установленную молекулярную массу (методом SDS-PAGE) от около 19 до около 27 кДа, предпочтительно от около 20 до около 26 кДа, от около 21 до около 25 кДа или от около 22 до около 24 кДа;

(ii) pI от около рН 7 до около рН 10, предпочтительно от около рН 7,5 до около рН 9,5 или от около рН 8,0 до около рН 9,0;

(iii) оптимальный показатель рН от около рН 5,5 до около рН 8,0, предпочтительно от около рН 5,5 до около рН 7,0 или от около рН 5,5 до около рН 6,5, определяемый при помощи анализа с использованием AZCL-казеина при 45°С и буферной системы с янтарной кислотой; и/или

(iv) оптимальную температуру от около 45°С до около 90°С, предпочтительно от около 50°С до около 85°С или от около 60°С до около 80°С, определяемую при помощи анализа с использованием AZCL-казеина при рН9;

(g) полипептидов, не ингибируемых

(v) SSI (ингибитором субтилизина Streptomyces) и/или

(vi) EDTA

при определении при помощи анализа с использованием AZCL-казеина при рН 9 и 45°С;

(h) полипептидов, устойчивых в интервале от около рН 3,5 до около рН 10,5, предпочтительно в интервале от около рН 3,5 до около рН 9,0 или в интервале от около рН 4,0 до рН 5,0 после инкубации в течение 2 часов при 37°С в буферной системе с янтарной кислотой, при этом остаточную активность измеряют при помощи анализа с использованием AZCL-казеина при рН9 и 45°С;

(k) полипептидов, синтезированных с использованием N-концевого пропептида; и

(l) полипептидов, имеющих мотив НЕХХН.

Стабильность полипептида по (h) означает, что остаточная активность равна по крайней мере 40%, 50%, 60%, 70% или 80% по сравнению с контрольным образцом, который не подвергали предварительной инкубации в течение 2 часов. Полипептиды, которые являются устойчивыми в соответствии с данным определением, могут быть определены как кислотостойкие полипептиды.

Полипептид по настоящему изобретению может быть бактериальным полипептидом. Например, такой полипептид может быть полипептидом грамоположительных бактерий, таким как полипептид Bacillus или полипептид Streptomyces; или полипептидом грамотрицательных бактерий, например полипептидом E. coli или Pseudomonas sp.

Полипептид по настоящему изобретению может быть грибковым полипептидом и более предпочтительно дрожжевым полипептидом, таким как полипептид Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или более предпочтительно полипептидом нитевидного грибка, таким как полипептид Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma.

В другом варианте осуществления изобретения полипептид является полипептидом Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thermoascus aurantiacus, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

В другом варианте осуществления изобретения полипептид является полипептидом, выделенным из нитевидного грибка типа Ascomycota, предпочтительно класса Pezizomycotina, более предпочтительно отряда Eurotiomycetes, еще предпочтительнее подсемейства Eurotiales и наиболее предпочтительно семейства Trichocomaceae.

В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид выделяют из грибка рода Thermoascus, например вида Thermoascus aurantiacus, такого как штамм CGMCC №0670 Thermoascus aurantiacus, например, полипептид с аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислоты -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2.

Очевидно, что в объем данного изобретения входят вышеуказанные виды в совершенном и дефектном состояниях и другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, независимо от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области могут легко установить идентичность соответствующих эквивалентов.

Штаммы указанных видов могут быть получены в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Norhern Regional Research Center (NRRL).

Кроме того, такие полипептиды могут быть идентифицированы и получены из других источников, включающих микроорганизмы, выделенных из природных источников (например, почвы, компоста, воды и т.д.) с использованием вышеуказанных зондов. Методы выделения микроорганизмов из естественных мест обитания хорошо известны в данной области. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть выделена в результате аналогичного скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК другого микроорганизма. После обнаружения при помощи зонда (зондов) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, указанную последовательность можно выделить или клонировать методами, известными специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, приведена выше).

Как указано в данном описании изобретения, "выделенный" полипептид является полипептидом, который по существу не содержит других непротеазных полипептидов, например, указанный полипептид является чистым по крайней мере примерно на 20%, предпочтительно по крайней мере примерно на 40%, более предпочтительно примерно на 60%, еще предпочтительнее примерно на 80%, наиболее предпочтительно примерно на 90% и особенно предпочтительно примерно на 95% при определении методом SDS-PAGE.

Полипептиды, кодированные последовательностями нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включают также слитые полипептиды или расщепляемые слитые полипептиды, в которых другой полипептид слит с N-концом или C-концом данного полипептида или его фрагмента. Слитый полипептид получают слиянием последовательности нуклеиновой кислоты (или ее части), кодирующей другой полипептид, с последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее частью) по настоящему изобретению. Методы получения слитых полипептидов известны в данной области и включают лигирование последовательностей, кодирующих полипептиды, при котором они находятся в рамке считывания и экспрессия слитого полипептида контролируется тем же промотором (промоторами) и терминатором.

Последовательности нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение относится также к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид по настоящему изобретению. Типичные последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению содержат нуклеотиды 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 и, в частности, нуклеотиды 559-1089 SEQ ID No.1, причем последние нуклеотиды соответствуют области, кодирующей зрелый полипептид. Другой типичной последовательностью нуклеиновых кислот по данному изобретению является последовательность, предпочтительно ее область, кодирующая зрелый полипептид, которая встроена в плазмиду, введенную в депонированный микроорганизм Escherichia coli DSM 14652. В объем настоящего изобретения входят также последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, включающую аминокислоты 1-177, -159-177 или -178-177 SEQ ID No.2, которые отличаются от соответствующих частей SEQ ID No.1 вследствие вырожденности генетического кода. Настоящее изобретение относится также к субпоследовательностям SEQ ID No.1, которые кодируют фрагменты SEQ ID No.2, обладающие протеазной активностью.

Настоящее изобретение относится также к выделенным последовательностям нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептид по настоящему изобретению. Типичными последовательностями нуклеиновых кислот по данному изобретению являются SEQ ID No.10 или нуклеотиды 2-1129, 2-1195, 2-1267, 71-1129, 71-1195, 71-1267, 599-1129, 599-1195 или 599-1267, нуклеотиды 71-1129 SEQ ID No.10, соответствующие области, кодирующей зрелый полипептид.

Субпоследовательность SEQ ID No.1 является последовательностью нуклеиновой кислоты, входящей в SEQ ID No.1, за исключением делеции одного или более нуклеотидов у 5'- и/или 3'-конца. Субпоследовательность предпочтительно содержит по крайней мере 225 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 300 нуклеотидов, еще предпочтительнее по крайней мере 375, 450, 500, 531, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 или 1300 нуклеотидов.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям с степенью идентичности к нуклеотидам 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 или предпочтительно нуклеотидам 559-1089 SEQ ID No.1, равной по крайней мере 69%, 70%, 72%, 74%, 76% или 80%. В конкретном варианте осуществления изобретения степень идентичности равна по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%. Для определения степени идентичности нуклеотидов можно использовать вышеуказанную программу "align".

Конкретный вариант осуществления изобретения относится к нуклеотидным последовательностям со степенью идентичности к нуклеотидам 25-1089, 1-1089, 1-1344 или 25-1344 SEQ ID No.1, равной по крайней мере 55%, 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76% или 80%. В конкретном варианте осуществления изобретения степень идентичности равна по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%. Для определения степени идентичности нуклеотидов можно использовать вышеуказанную программу "align".

Настоящее изобретение относится также к мутантным последовательностям нуклеиновых кислот, содержащим по крайней мере одну мутацию в нуклеотидах 25-1089, 1-1089, 1-1344, 25-1344, 559-1344 или 559-1089 SEQ ID No.1, где мутантная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который (i) состоит из аминокислот -178-177, -159-177 или +1-177 SEQ ID No.2, (ii) является вариантом любой последовательности (i), который включает замену, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот, (iii) является аллельным вариантом любой последовательности (i) или (iv) является фрагментом любой последовательности (i).

Методы, используемые для выделения или клонирования последовательности нуклеиново