Рекомбинантные штаммы вируса гриппа, экспрессирующие микобактериальный протективный антиген esat-6, и их использование для профилактики и лечения туберкулеза

Рекомбинантные штаммы вируса гриппа, экспрессирующие микобактериальный протективный антиген esat-6, и их использование для профилактики и лечения туберкулеза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения рекомбинантных вакцинных штаммов для профилактики и лечения туберкулеза.

Настоящее изобретение направлено на решение одной из важнейших задач современной медицины - создание новой, более эффективной, чем БЦЖ, вакцины против туберкулеза. Необходимость создания такой вакцины продиктована несколькими причинами. Во-первых, единственная применяемая в настоящее время вакцина БЦЖ эффективна для профилактики туберкулеза у детей, но, по многочисленным данным, не способна предотвращать реактивацию заболевания у взрослых людей, которая является причиной большинства случаев легочного туберкулеза (Trends Immunol, 2001; 22:160-8). Во-вторых, введение живой вакцины БЦЖ может представлять серьезную угрозу для привитых с нарушениями иммунитета, например, у ВИЧ-инфицированных больных в стадии СПИДа. В этих случаях аттенуированный штамм микобактерии способен вызывать истинный инфекционный процесс с тяжелыми осложнениями (Clin. Infect. Dis., 1997; 24:1139-46).

В настоящее время известны несколько новых подходов к усовершенствованию существующей БЦЖ-вакцины:

1) рекомбинантные аттенуированные микобактерии, представляющие из себя сконструированные генно-инженерными методами делеционные мутанты вирулентных штаммов микобактерии туберкулеза (Science, 1998; 282:759-762). В отличие от БЦЖ, полученной эмпирическим путем, данные штаммы несут меньшие по протяженности делеции участков генома, ответственных за факторы вирулентности, но экспрессируют важные протективные антигены М. tuberculosis и М. bovis, утраченные БЦЖ. В то же время такие вакцины потенциально небезопасны для людей с иммуносупрессией;

2) рекомбинантные БЦЖ-вакцины, экспрессирующие дополнительные протективные белки, утраченные в процессе длительного культивирования данного штамма (Nature medicine, 2003; V.9, N5: 533-539). Данному типу вакцин присущи недостатки, свойственные вакцине БЦЖ, в плане ее небезопасности;

3) субъединичные белковые препараты на основе протективных белков, вводимые парентерально. Следует отметить, что имеющийся опыт по созданию субъединичных и пептидных вакцин, указывает на необходимость введения в состав вакцин мощных адъювантов, поскольку сами по себе белковые или пептидные антигены недостаточно иммуногенны и часто создают лишь кратковременный иммунитет даже при многократных иммунизациях (Infect. Immun., 2000; 68:791-795). Другим недостатком является неспособность подобного типа вакцин стимулировать выработку цитотоксического клеточного иммунитета;

4) ДНК-вакцины. Предназначены для внутриклеточной экспрессии протекивных антигенов и поэтому способны стимулировать Т-клеточное звено иммунитета (Infect. Immun., 1999; 67: 4780-4786). Однако ДНК-вакцины низкоиммуногенны, требуют многократного введения и до сих пор не были лицензированы для применения у людей.

Альтернативой этим подходам, позволяющей повысить иммуногенность протективных микобактериальных антигенов, может служить использование векторной системы на основе рекомбинантного аттенуированного гриппозного вируса, экспрессирующего ранний секреторный микобактериальный антиген ESAT-6, в качестве интраназальной вакцины. С данным антигеном связывают активацию лимфоцитов и начало продукции интерферона, которые играют важную роль в активации макрофагов, тем самым оказывая патогенетическое влияние на формирование иммунитета при инфицировании микобактериями туберкулеза (Infect. Immun., 62:2536-2544).

В отличие от вакцины БЦЖ, предназначенной, прежде всего, для парентерального введения, гриппозная векторная вакцина может применяться интраназально в виде капель или аэрозоля. В результате достигается выработка иммунитета слизистых оболочек (мукозный иммунитет) во входных воротах туберкулезной инфекции. Существование множества антигенных подтипов вируса гриппа позволяет рассчитывать на возможность проведения нескольких иммунизации для достижения максимального профилактического или лечебного эффекта.

Цель изобретения - создание рекомбинантных вакцинных штаммов, обеспечивающих развитие протективного иммунитета против туберкулеза при использовании их в качестве профилактической вакцины или служащих цели лечения туберкулеза, то есть использование их в качестве терапевтической вакцины.

Задача решена с помощью методов обратной генетики, а именно созданием живых рекомбинантных штаммов вируса гриппа А (гриппозных векторов), содержащих вставку чужеродной генетической последовательности в гене NS1 вируса гриппа и экспрессирующих протективные антигены Mycobacterium tuberculosis.

Сущностью данного изобретения является получение химерного продукта на основе штаммов вируса гриппа А различных антигенных подтипов и посторонней генетической последовательности, иммунодоминантного микобактериального белка ESAT-6, применимого в медицинской практике.

Достижение основной цели изобретения иллюстрируется следующими примерами.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА.

Рекомбинантные штаммы вирусы гриппа, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6, получены с помощью методов обратной генетики (J. Virol., 1996; 70: 4188-4192; Adv. Vims Res., 1999; 53: 265-300; J. Virol., 1999; 73: 9679-82).

Конструирование плазмид. Геномная РНК вируса гриппа A/PR8/34 была экстрагирована с помощью реагента Ultraspec (Biotecx Laboratories). кДНК копия NS гена была получена с помощью обратной транскрипции с использованием праймера (5'-ACTACTTCTAGAGAAGACAAAGCAAAAGCAGGGTGACA-3') и M-MuLV обратной транскриптазы (Fermentas). Полученная кДНК использовалась для амплификации фрагмента NS1 гена в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью следующих праймеров:

прямой: (5'-ACTACTTCTAGAGAAGACAAAGCAAAAGCAGGGTGACA-3') и

обратный: (5'-ACTACTCTGCAGATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAG-3').

Амплифицированный фрагмент был клонирован в плазмидный вектор pQBI 25/50-fC1(Qubiogene) по тупым концам между Poll промотором и последовательностью рибозима гепатита дельта (HDV), играющего роль терминатора транскрипции (J. Virol., 1999; 73:9679-9682; Adv. Virus Res., 1999; 53:265-300; J.Virol, 1996; 70(6): 4188-4192). Полученная плазмида получила название pPolI-NS-HDV.

Синтез нуклеотидной последовательности ESAT-6 был осуществлен путем гибридизации эквимолярного количества шести синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов (по 10 пкмоль/мл каждого) (CODON Genetic Systems) при нагревании до температуры 100°С в течение 4 минут с последующим медленным охлаждением смеси до комнатной температуры.

Полученный ДНК-фрагмент, 288 нуклеотидов в длину, амплифицировали с помощью концевых праймеров в ПЦР (прямой праймер: 5'ATGACAGAGCAGCAGTG 3' и обратный праймер: 3'CTATGCGAACATCCCAG 5'), и клонировали в плазмиду pPolI-NS-HDV между нуклеотидами 400-401 в открытой рамке считывания NS1 гена вируса гриппа без удаления участков гена. Данная конструкция получила название pPol-NS-ESAT-6-HDV.

С целью посттрансляционного разделения ESAT-6 белка с N-терминальной областью NS1 белка, между ними была вставлена синтезированная последовательность (51 нуклеотидов), кодирующая участок сайта узнавания клеточными протеазами белка 2А (NFDLLKLAGDVESNLG/P) пикорновируса, который обладает свойством саморазрезания перед последним пролином (J. ViroL, 1994; 68:4486-4492). Данная конструкция получила название pPol-NS125-2A-ESAT-6-HDV.

Структура рекомбинантного NS1 гена представлена на схеме (Фиг.1). После нуклеотидной последовательности NS1 гена, кодирующей 125 аминокислот белка NS1 вируса гриппа, следует последовательность, кодирующая участок белка 2А (NFDLLKLAGDVESNLG/P) пикорновируса вместе с последовательностью ESAT-6 (95 аминокислот). Стрелкой отмечен сайт саморазрезания перед последним пролином, обеспечивающий посттрансляционный выход ESAT-6 белка.

Экспрессионные плазмиды для РВ1, РВ2, РА и NP белков вируса гриппа были получены путем клонирования соответствующих PR8 генов в плазмиду pTriEx-1 (Novagene) под активный промотор цыпленка и названы pTriEx-PB1, pTriEx-PB2, pTriEx-PA и pTriEx-NP соответственно.

Получение рекомбинантных штаммов вирусов гриппа. Система получения вирусов гриппа (H1N1, H2N2), содержащих рекомбинантный NS1 ген представлена на схеме (Фиг.2). Клетки Vero (American Type Culture Collection (ATCC) были трансфецированы плазмидой pPol-NS125-2A-ESAT-6-HDV (1), экспрессирующей химерную РНК NS гена вируса гриппа (2), совместно с набором плазмид pTriEx-PBl, pTriEx-PB2, pTriEx-PA, и pTriEx-NP, экспрессирующих белки полимеразного комплекса вируса гриппа (по 1 мкг каждой плазмиды). Трансфекцию проводили путем электропарации (Nucleofection technique, Amaxa) в соответствии с инструкцией по использованию. 24 часа спустя трансфецированные клетки Vero были заражены хелперными вирусами гриппа A/PR/8-delNS (H1N1) или A/Sing/delNS87 (H2N2) (3), которые содержали частично или полностью удаленный NS1 ген и потому были чувствительны к действию интерферона (Virology; 2004, 324(1):67-73). Через 8 часов после заражения в качестве селективного препарата добавляли человеческий лейкоцитарный интерферон-альфа (NIBSC 1^st International Standard 1999; 3 ед./мл культуральной среды) и инкубировали клетки в течение 48 часов при 37°С. Полученный урожай вирусов был дважды пропассирован на клетках Vero в присутствии интерферона-альфа в концентрации 3 ед./мл. Конечная популяция вирусов (4) содержала рекомбинантный NS1 ген со вставкой ESAT-6, что подтверждалось секвенированием продукта ОТ-ПЦР. После проведения двукратной очистки вирусы изолировали.

Рекомбинантный вирус гриппа, относящийся к подтипу H1N1, получил название FLU/H1-ESAT-6, рекомбинантный вирус гриппа, относящийся к подтипу H2N2 получил название FLU/H2-ESAT-6.

Рекомбинантный вирус гриппа подтипа H3N2 был получен путем генетической реассортации вируса FLU/H1-ESAT-6 с вирусом A/Aichi/1/68 (H3N2) на клетках Vero в присутствии кроличьей антисыворотки к вирусу A/PR/8/34 (H1N1). Полученный вирусный клон содержал 6 фрагментов генома (РВ2, РВ1, PA, NP, M, recNS) от вектора A/PR8-2A-ESAT-6, а гены гликопротеинов (НА, NA) от штамма A/Aichi/1/68 (H3N2). Генотипирование реассортантов проводилось методом ОТ-ПЦР с последующим сравнительным рестрикционным анализом кДНК копий каждого сегмента. Полученный вирус получил название FLU/H3-ESAT-6.

Пример 1. Рекомбинантный вирус A/PR8-2A-ESAT-6 (H1N1) получен с помощью методов обратной генетики на клеточной культуре Vero и характеризуется наличием рекомбинантного NS1 гена, содержащим вставку нуклеотидной последовательности ESAT-6 M. tuberculosis между позициями 400-401 открытой рамки считывания NS гена, что подтверждено секвенированием продукта ОТ-ПЦР.

Вследствие наличия вставки, вирус A/PR8-2A-ESAT-6 отличается от вируса гриппа дикого типа наличием увеличенного размера геномного фрагмента NS 1, что было определено с помощью электрофореза в агарозном геле после амплификации в ПЦР со специфическими праймерами:

5'-ACTACTTCTAGAGAAGACAAAGCAAAAGCAGGGTGACA-3' и 5'-ACTACTCTGCAGATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAG-3' (Фиг.3). На чертеже видно, что размер амплифицированного рекомбинантного фрагмента NS 1 превышает размер амплифицированного фрагмента NS1 гена вируса гриппа дикого типа на расчетную величину.

Другим генетическим маркером, определяющим рекомбинантную природу данного вируса, является экспрессия ESAT-6 белка, определяемого при иммунофлюоресцентном анализе зараженных клеток с помощью моноклональных антител (Фиг.4А). На чертеже отчетливо видно свечение ESAT-6 белка, накопившегося в ядре зараженных рекомбинантным вирусом клеток Vero.

Экспрессия вставки ESAT-6 при заражении клеток Vero подтверждена также анализом лизатов зараженных вирусом клеток методом Вестернблот с использованием моноклональных антител против белка ESAT-6 (Фиг.4В). На чертеже видны окрашенные зоны, соответствующие продуктам с молекулярным весом в 26 kDa и 24 kDa. Наличие нескольких зон определяется посттрансляционным отщеплением карбоксильной части ESAT-6, ранее показанным для этого белка.

Полученный вирус способен размножаться в культуре клеток Vero и MDCK до титров 7.5 log БОЕ/мл и в 10 дневных куриных эмбрионах до титра 9.2 log ЭИД 50/мл при оптимальной температуре 37°С. Вирус не является температурочувствительным и репродуцируются до аналогичных титров при температуре 39°С.

При интраназальном заражении мышей в дозе 5.5 log БОЕ/мышь полученный вирус обладает способностью размножения в легких животных до титров 1,5 БОЕ/мл 10% суспензии легких, не вызывая при этом гибели животных т.е. является аттенуированным по сравнению с исходным родительским штаммом. Отсутствие патологии в легких иммунизированных животных и отсутствие снижения веса мышей подтверждают аттенуацию. Вирус обладает генетической стабильностью в течение, как минимум, 5 последовательных пассажей в культуре клеток Vero.

Характеристика полученного авторами рекомбинантного штамма вируса гриппа A/PR8-2A-ESAT-6 (H1N1) приведена в прилагаемом удостоверении о депонировании штамма (№147) в коллекцию Музея вирусов ГУ НИИ гриппа РАМН.

Пример 2. Рекомбинантный вирус A/Singapore/-2A-ESAT-6 (H2N2) получен с помощью методов обратной генетики на клеточной культуре Vero и характеризуется наличием рекомбинантного NS1 гена, содержащим вставку нуклеотидной последовательности ESAT-6 M.tuberculosis между позициями 400-401 открытой рамки считывания NS гена, что подтверждено секвенированием продукта ОТ-ПЦР.

При заражении клеток Vero данным вирусным штаммом наблюдается экспрессия ESAT-6 белка, что подтверждено иммунофлюоресцентным анализом и иммуноблотингом лизатов зараженных клеток с использованием моноклональных антител к ESAT-6 белку (Фиг.4).

Полученный вирус способен размножаться в культуре клеток Vero и MDCK до титров 7.5 log БОЕ/мл и в 10 дневных куриных эмбрионах до титра 8 log ЭИД 50/мл при оптимальной температуре 37°С. Вирус не является температурочувствительным и репродуцируются до аналогичных титров при температуре 39°С.

При интраназальном заражении мышей в дозе 5.5 log БОЕ/мышь полученный вирус обладает способностью размножения в легких животных до титров 3,5 БОЕ/мл 10% суспензии легких, не вызывая при этом гибели животных т.е. является аттенуированным по сравнению с исходным родительским штаммом.

Вирус обладает генетической стабильностью в течение, как минимум, 5 последовательных пассажей в культуре клеток Vero.

Характеристика полученного авторами рекомбинантного штамма вируса гриппа A/Singapore/-2A-ESAT-6 (H2N2) приведена в прилагаемом удостоверении о депонировании штамма (№149) в коллекцию Музея вирусов ГУ НИИ гриппа РАМН.

Пример 3. Рекомбинантный вирус гриппа A/Aichi-2A-ESAT-6 (H3N2) был получен путем генетической реассортации вируса A/PR8-2A-ESAT-6 с вирусом A/Aichi/1/68 (H3N2) на клетках Vero в присутствии кроличьей антисыворотки к вирусу A/PR/8/34 (H1N1). Полученный вирусный клон содержал 6 фрагментов генома (РВ2, РВ1, PA, NP, M, recNS) от вектора A/PR8-2A-ESAT-6, а гены гликопротеинов (НА, NA) от штамма A/Aichi/1/68 (H3N2).

Вследствие наличия вставки последовательности ESAT-6 полученный вирус отличался от вируса гриппа дикого типа наличием увеличенного размера геномного фрагмента NS1, что было определено с помощью электрофореза в агарозном геле после его амплификации в ПНР со специфическими праймерами:

5'-ACTACTTCTAGAGAAGACAAAGCAAAAGCAGGGTGACA-3' и

5'-ACTACTCTGCAGATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAG-3' (Фиг.3). На чертеже видно, что амплифицированный рекомбинантный фрагмент NS1 имеет вставку последовательности ESAT-6, превышая размер NS1 гена дикого типа вируса на величину размера вставки.

Данный вирус является температурочувствительным и адаптирован к росту в культуре клеток Vero.

При заражении клеток Vero вирусным штаммом A/Aichi-2A-ESAT-6 (H3N2) наблюдается экспрессия ESAT-6 белка, что подтверждено иммунофлюоресцентным анализом и иммуноблотингом лизатов зараженных клеток с использованием моноклональных антител к ESAT-6 белку (Фиг.4).

Полученный вирус способен размножаться в культуре клеток Vero и MDCK до титров 7.5 log БОЕ/мл при оптимальной температуре 34°С, репродуцируется до титров 3 log БОЕ/мл при температуре 39°С.

При интраназальном заражении мышей в дозе 5.5 log БОЕ/мышь полученный вирус обладает способностью размножения в легких животных до титров 1,5 БОЕ/мл 10% суспензии легких, не вызывая при этом гибели животных т.е. является аттенуированным по сравнению с исходным родительским штаммом. Отсутствие патологии в легких иммунизированных животных и отсутствие снижения веса мышей подтверждают аттенуацию.

Вирус обладает генетической стабильностью в течение, как минимум, 5 последовательных пассажей в культуре клеток Vero.

Характеристика полученного авторами рекомбинантного штамма вируса гриппа A/Aichi-2A-ESAT-6 (H3N2) приведена в прилагаемом удостоверении о депонировании штамма (№148) в коллекцию Музея вирусов ГУ НИИ гриппа РАМН.

СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ.

В настоящее время отмечается значительное ухудшение эпидемиологической обстановки по туберкулезу в России и во всем мире в связи с неблагоприятной экологической обстановкой, негативными социальными факторами, ростом иммунодефицитных заболеваний различного генеза и отсутствием надежной специфической профилактики заболевания.

Классическая вакцина БЦЖ, представляющая собой живой аттенуированный штамм M.bovis, эффективна для профилактики туберкулеза у детей, но не способна предотвращать реактивацию заболевания у взрослых людей, которая является причиной большинства случаев легочного туберкулеза (Trends Immunol. 2001; 22:160-8).

Известно, что протективный эффект при развитии туберкулезной инфекции обеспечивают цитокины, вырабатываемые Т-хелперами 1 типа (ТХ-1) - гамма-интерферон (ИФН-γ) интерлейкин-2 (ИЛ-2), которые являются медиаторами клеточно-опосредованного иммунитета. При активной прогрессирующей инфекции обнаруживается стимуляция Т-2 хелперной субпопуляции лимфоцитов (ТХ-2), с высоким уровнем продукции ИЛ-4, расцениваемой в последнее время как показатель снижения сопротивляемости к туберкулезу и о снижении активности CД4⁺ ТХ-1.

Среди многообразия предположений, объясняющих неспособность вакцины БЦЖ защитить популяцию взрослых от туберкулеза, можно выделить отсутствие важных (протективных) антигенов в геноме БЦЖ (в том числе ESAT-6), неспособность стимулировать оптимальное сочетание субпопуляций Т-лимфоцитов для создания протекции, нежелательную стимуляцию выработки ИЛ-4.

К тому же при введении вакцины БЦЖ иммунная система организма человека сталкивается с исключительно сложным набором антигенов, конкурирующих за презентирующие клетки, а иммунодоминирующие антигены не всегда индуцируют максимальную протекцию (J.Immunol, 1996; 157:3039-3045) или их экспрессия транзиторна (Parasite Immunol., 1993; 15:187-193).

Обоснованным и перспективным направлением при разработке новых вакцин против туберкулеза является формирование Th1 иммунного ответа, характерного для благоприятного течения и обратного развития инфекции, обеспечение его высокой активности и целенаправленного переключения на Тh1 в случае доминирования Th2 цитокинов.

Пример 4. Влияние профилактической иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами на развитие и течение острой туберкулезной инфекции у мышей.

Исследование проведено на 240 беспородных белых мышах-самцах с исходной массой тела 18-20 г, полученных из питомника «Рапполово», Всеволожского района. Ленинградской области. Для иммунизации использовались вируссодержащие суспензии рекомбинантных гриппозных векторов FLU/ESAT-6, относящихся к различным антигенным подтипам вируса гриппа A (H1N1, H3N2 и H2N2).

Животные были распределены по 5-и группам. В первой группе мышей двукратно иммунизировали смесью трех рекомбинантных гриппозных векторов различных антигенных подтипов (FLU/ESAT-6(Tri+Tri)). Во второй группе первая иммунизация проводилась рекомбинантным гриппозным вектором подтипа H1N1, вторая - гриппозным вектором разновидности H3N2 (FLU/ESAT-6(H1+H3)). В третьей опытной группе первая иммунизация проводилась рекомбинантным гриппозным вектором подтипа H1N1, вторая - гриппозным вектором разновидности H2N2 (FLU/ESAT-6(H1+H2)). Иммунизацию проводили интраназально, без наркоза, в дозе 10⁶ БОЕ/мышь, с интервалом в 3 недели. Контролем служили интактные животные и невакцинированные зараженные МБТ мыши (контроль заражения).

Генерализованный туберкулез вызывали введением в латеральную хвостовую вену мышей 0,2 мл взвеси трехнедельной культуры М. bovis bovinus 8 в дозе 0,1 мг/мышь через 6 недель после первой иммунизации. Использовался вирулентный штамм М. bovis bovinus 8, полученный в виде лиофилизированной культуры из ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Тарасевича (лаборатория препаратов для профилактики и диагностики туберкулеза и микобактериозов). При заражении белых беспородных мышей этим штаммом очаги специфического воспаления в легких образуются на 14-20 день, а гибель животных отмечается на 30-45 день с момента инокуляции инфекта, что близко к соответствующим показателям у мышей, зараженных М. tuberculosis H37Rv (Першин Г.Н., 1971).

Эффект протективного действия вакцины оценивали по следующим показателям тяжести течения экспериментального туберкулезного процесса: динамика массы мышей (взвешивание 1 раз в неделю), макроскопическая оценка легких и селезенки (индексы поражения легких, коэффициенты масс легких и селезенки), гистологическое исследование срезов легких. Сравнение с контрольными показателями (интактные животные и контроль заражения) проводили в динамике через 30 и 40 дней после заражения МБТ.

Индекс поражения легких высчитывали в соответствии с количеством и выраженностью очагов специфического воспаления, выявляемых при визуальном осмотре. При этом единичные субмилиарные очаги оценивались в 0,5 балла; многочисленные субмилиарные очаги (не более 20) - в 1 балл; многочисленные субмилиарные (более 20) - в 1,5 балла; единичные милиарные - в 1,75 балла; многочисленные сливающиеся субмилиарные и единичные милиарные - в 2 балла; милиарные (не более 10) - в 2,25 балла; многочисленные милиарные, сливающиеся - 2,75 балла, появление мелких казеозных некротических фокусов - в 3 балла; обширный казеоз - 4 балла; сплошное поражение легких - 5 баллов. В случаях серозного пропитывания ткани легких к вычисленному индексу поражения прибавлялись от 0,25 до 1 баллов в зависимости от площади поражения.

Коэффициенты масс органов вычисляли исходя из соотношения массы органа и массы тела животного (КМ=масса органа (г)×100/масса животного (г)) и выражали в условных единицах (усл. ед.).

Для гистологического изучения легких орган фиксировали в 10% формалине. После фиксации и проводки материал заливали в парафин и из парафиновых блоков изготовляли ступенчатые гистологические срезы. Использовались окраски гематоксилином и эозином.

Полученные результаты подвергали статистической обработке, достоверность различий оценивали по непарному t-критерию Стьюдента.

Анализ полученных результатов показал, что у мышей, двукратно иммунизированных рекомбинантными гриппозными векторами, развитие экспериментальной туберкулезной инфекции замедлено, а течение - более благоприятно, чем у зараженных невакцинированных животных.

На 30-й день после заражения у вакцинированных FLU/ESAT-6 мышей отмечалась тенденция к снижению коэффициентов массы органов (легких и селезенки) и статистически значимое (р<0,001, р<0,02 и р<0,05) уменьшение индексов поражения легких по сравнению с зараженными невакцинированными животными, что отражено в таблице 1.

Таблица 1.Показатели тяжести течения экспериментального туберкулеза на 30-й день после заражения МБТ
Условия опыта	Коэффициент массы легких (усл.ед.)	Индекс поражения легких (усл.ед.)
Контроль заражения (n=11)	1,46±0,13	2,25±0,07
FLU/ESAT-6 (H1+H3) (n=5)	1,35±0,2	1,6±0,1 р<0,001
FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) (n=5)	1,98±0,48	1,8±0,16 р<0,05
FLU/ESAT-6 (H1+H2) (n=5)	1,26±0,11	1,65±0,21 р<0,02
Р - достоверность различий с невакцинированными животными (контроль заражения) по непарному t-критерию Стьюдента.

На 40-й день после заражения протективный эффект отмечен при использовании трех вариантов исследуемой вакцины. Коэффициенты массы легких, как и на предыдущем сроке наблюдения, имели лишь тенденцию к снижению, а индекс поражения легких в двух опытных группах был достоверно ниже, чем в контрольной группе (р<0,05). К этому времени у мышей, иммунизированных трехвалентной гриппозной вакциной и вакциной FLU/ESAT-6 (H1+H2), отмечено и снижение коэффициента массы селезенки (р<0,02), что отражено в таблице 2.

Таблица 2.Показатели тяжести течения экспериментального туберкулеза на 40-й день после заражения МБТ
Условия опыта	% прибавки массы тела ко дню забоя	Коэффициент массы легких (усл.ед.)	Индекс поражения легких (усл.ед.)	Коэффициент массы селезенки (усл.ед.)
Контроль заражения (n=10)	6,78	2,3±0,27	2,98±0,31	3,17±0,29
FLU/ESAT-6 (Н1+Н3) (n=7)	12,9	1,77±0,2	2,21±0,11 р<0,05	2,6±0,26
FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) (n=7)	35,4	1,69±0,11	2,21±0,11 р<0,05	2,25±0,14 р<0,02
FLU/ESAT-6 (H1+H2) (n=7)	18,8	1,82±0,22	2,39±0,11	2,11±0,23 р<0,02
Р - достоверность различий с невакцинированными животными (контроль заражения) по непарному t-критерию Стьюдента.

При этом в легких мышей контрольной группы определялись множественные, хорошо выраженные туберкулезные очаги, большое количество крупных сливных некротических очагов, что отражено на макрофотографиях легких мышей сравниваемых групп (Фиг.5А). Туберкулезные изменения в легких вакцинированных животных были выражены слабее и были представлены единичными некрупными туберкулезными очагами серого цвета (Фиг.5 В). Необходимо отметить, что по величине индекса поражения легких ко второму контрольному сроку (40-й день после заражения) во всех группах животных отмечалось нарастание распространенности специфического поражения легких, но у вакцинированных мышей оно было менее выражено и отсрочено по времени (табл.1, 2).

Исследование динамики массы мышей выявило, что к окончанию срока наблюдения масса тела вакцинированных FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) животных соответствовала данным мышей интактной группы (27,9 г против 28,4 г) (Фиг.6). При этом процент прибавки массы тела у вакцинированных мышей ко дню забоя (12,9-35,4%) был в 1,9 (FLU/ESAT-6 (H1+H3), в 2,8 (FLU/ESAT-6 (H1+H2) и в 5,2 (FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) раз соответственно выше, чем в контрольной группе (7,8%), что свидетельствует о меньшей выраженности симптомов интоксикации в обеих группах вакцинированных мышей.

Гистологическое исследование срезов легких на 40-й день после заражения показало, что у всех зараженных животных в ткани легкого имелись специфические инфильтративные изменения различной степени выраженности с накоплением в альвеолах серозного, а чаще фибринозного экссудата, крупных вакуолизированных макрофагов и лимфоидных элементов (альвеолярно-макрофагальный грануломатоз). У зараженных невакцинированных мышей они были представлены полями и крупными сливными очагами инфильтрации (табл.3). При этом преобладали свежие инфильтративные изменения, распространяющиеся как на воздушную паренхиму, так и на перибронхиальные и периваскулярные пространства. Альвеолы, межальвеолярные перегородки и просветы расширенных капилляров были инфильтрированы скоплениями макрофагов, эпителиоидных клеток, лимфоидными элементами.

Таблица 3.Распространенность специфического поражения легочной ткани у мышей с экспериментальным туберкулезом
Группы (кол-во мышей)	Снижение (более, чем на 50%) воздушности легочной ткани	Крупные очаги инфильтрации	Небольшие участки инфильтрации
Контроль заражения (10)	10 (100%)	10	0
FLU/ESAT-6 (H1+H3) (7)	1 (14%)	1 (14%)	6 (86%)
FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) (7)	3 (41%)	3 (41%)	4 (59%)
FLU/ESAT-6 (H1+H2) (7)	1 (14%)	1 (14%)	6 (86%)

При этом у всех животных контрольной группы в паренхиме легких обнаруживались скопления нейтрофильных гранулоцитов, которые в 6 из 10 случаев частично распадались и образовывали ядерный детрит, а в 2-х случаях - фокусы деструкции в центре гранулемы, что отражено на представленных микрофотографиях гистологического среза легкого мыши контрольной группы (Фиг.7А).

Таблица 4.Особенности клеточного состава участков альвеолярно-макрофагального гранулематоза у мышей с экспериментальным туберкулезом
Группы (кол-во мышей)	Скопления эпителиоидных клеток	Единичные нейтрофильные гранулоциты	Скопления нейтрофильных гранулоцитов	Ядерный детрит	Участки некроза
Контроль заражения (10)	10 (100%)	10 (100%)	10 (100%)	6 (60%)	2 (20%)
FLU/ESAT-6 (H1+H3) (7)	7 (100%)	6 (86%)	1 (14%)	0	0
FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) (7)	7 (100%)	4 (59%)	0	0	0
FLU/ESAT-6 (H1+H2) (7)	7 (100%)	4 (59%)	0	0	0

Клеточный состав гранулемы был представлен участками казеозного некроза, ядерным детритом, скоплениями распадающихся нейтрофильных гранулоцитов, макрофагами, эпителиоидными клетками, единичными лимфоцитами (Фиг.7В).

В просвете бронхов у животных с выраженными некротическими изменениями обнаруживались ядерный детрит и слущенные эпителиальные клетки. Лимфогистиоцитарная инфильтрация, свидетельствующая о напряженности местного иммунитета легочной ткани, была выражена очень слабо, значительные периваскулярные инфильтраты зарегистрированы только в 4 из 10 (40%) случаев, крупные перибронхиальные инфильтраты не отмечены (табл.5).

Таблица 5.Выраженность признаков напряженности местного иммунитета легочной ткани у мышей с экспериментальным туберкулезом
Группы (кол-во мышей)	Крупные периваскулярные инфильтраты	Крупные перибронхиальные инфильтраты
Контроль заражения (10)	4 (40%)	0
FLU/ESAT-6 (H1+H3) (7)	7 (100%)	4 (59%)
FLU/ESAT-6 (Tri+Tri) (7)	7 (100%)	4 (59%)
FLU/ESAT-6 (H1+H2) (7)	7 (100%)	7 (100%)

У вакцинированных мышей опытных групп по сравнению с контрольной группой животных наблюдалось повышение воздушности легочной ткани, снижение распространенности специфического воспаления, которое в большинстве случаев (59%-86%) было представлено небольшими отдельными очагами инфильтрации (табл.3). В очагах инфильтрации практически не обнаруживалось скоплений нейтрофильных гранулоцитов, не выявлялись ядерный детрит и участки некроза, значительно уменьшилась встречаемость единичных не распадающихся нейтрофилов (табл.4). Только в одном случае (14%) у мышей, вакцинированных FLU/ESAT-6 (H1+H3), отмечены мелкие скопления нейтрофильных гранулоцитов.

В качестве иллюстрации (Фиг.8) на микрофотографии препарата ткани легкого (в двух увеличениях) одной из вакцинированных FLU/ESAT-6 (Н1+Н3) мышей представлен небольшой очаг альвеолярно-макрофагального гранулематоза с сохранившимися альвеолами, имеющими несколько утолщенные перегородки и инфильтрированные лимфоцитами (Фиг.8А). Клеточный состав инфильтрата представлен лимфоидными элементами, макрофагами, единичными эпителиоидными клетками и единичными не распадающимися нейтрофилами (Фиг.8В).

У всех опытных животных более часто, чем в контрольной группе обнаруживались крупные периваскулярные и перибронхиальные лимфогистиоцитарные инфильтраты, что свидетельствует об активации напряженности местного иммунитета ткани легкого (табл.5).

Таким образом, двукратная интраназальная вакцинация белых беспородных мышей гриппозными векторами, экспрессирующими протективный микобактериальный антиген ESAT-6, проведенная за 3 недели до заражения мышей вирулентным штаммом М. bovis bovinus 8, привела к задержке развития экспериментальной туберкулезной инфекции и более благоприятному ее течению по сравнению с контрольной группой зараженных невакцинированных животных.

Значительный протективный эффект отмечен как при двукратном интраназальном введении смеси трех рекомбинантных гриппозных векторов (FLU/ESAT-6 (Tri+Tri), так и при последовательной интраназальной иммунизации животных рекомбинантными гриппозными векторами, относящимися к H1N1 и H3N2, а также H1N1 и H2N2 антигенным подтипам вируса гриппа.

Под воздействием вакцинации наблюдалось выраженное снижение тяжести течения инфекции: благоприятная динамика массы тела, более низкие коэффициенты массы легких (р<0,05) и селезенки (р<0,02), уменьшение индексов поражения легких (р<0,001).

Оценка морфодинамики острой туберкулезной инфекции белых беспородных мышей выявила в легких вакцинированных животных регрессию воспалительных изменений, что проявилось в уменьшении распространенности специфического воспаления и снижении его альтеративного компонента, а также активации местного иммунитета ткани легкого.

Пример 5. Иммуногенность гриппозных векторов и эффективность профилактической иммунизации рекомбинантными гриппозными векторами при вялотекущей туберкулезной инфекции у С57 black/6 мышей.

Сравнительная оценка эффективности вакцинации рекомбинантными гриппозными штаммами FLU/ESAT-6 и стандартной вакциной БЦЖ на развитие и течение вялотекущей туберкулезной инфекции проведена на 165 мышах-самцах линии С57 black/6 с исходной массой тела 18-20 г, полученных из питомника «Рапполово», Всеволожского района, Ленинградской области.

С целью индукции системного иммунного ответа и иммунитета слизистых оболочек мышей одной из опытных групп последовательно иммунизировали гриппозными векторами, относящимися к двум антигенным подтипам вируса гриппа: (H1N1) и (H3N2). Контролями служили зараженные невакцинированные мыши (контроль заражения); мыши, иммунизированные диким вирусом гриппа A/PR/8/34 (контроль вакцины), БЦЖ-вакцинированные мыши и интактные животные.

Двукратную иммунизацию FLU/ESAT-6 (H1+H3) и диким вирусом гриппа проводили интраназально, без наркоза, в дозе 10⁶ БОЕ/мышь с интервалом в 3 недели. Вакцина БЦЖ вводилась однократно подкожно в дозе 10⁵ БОЕ/мышь в день первой иммунизации.

Генерализованный туберкулез вызывали введением в латеральную хвостовую вену мышей взвеси трехнедельной культуры М. bovis bovinus 8 (10⁶ КОЕ/мышь) через 6 недель после первой иммунизации.

Эффект протективного действия исследуемой вакцины оценивали на 22-й и 35-й дни после заражения МБТ по следующим показателям тяжести течения экспериментального туберкулезного процесса: высеваемость МБТ из легких и селезенки, макроскопическая оценка легких и селезенки (индексы поражения легких, коэффициенты масс легких и селезенки), летальность. Полученные данные сравнивали с аналогичными показателями в контрольных группах животных.

При бактериологическом исследовании легких и селезенки осуществляли дозированный посев гомогената ткани органа на плотную яичную среду Левенштейна-Йенсена методом 10-кратных серийных разведений. Массивность роста микобактерий туберкулеза (МБТ) выражали в десятичных логарифмах (Log₁₀) от числа колониеобразующих единиц (КОЕ).

Иммунологическое исследование проводили через 3 недели после второй иммунизации (до заражения животных M. bovis) и в динамике инфекционного процесса (на 15-й и 35-й дни после заражения M. bovis).

Пролиферация лимфоцитов селезенки и трахеобронхиальных лимфоузлов мышей оценивалась на 96-луночных планшетах в реакции бласттрансформации при индукции клеток КонА (1 мкг/мл) и рекомбинантного белка ESAT-6 (Fusion Antibodies Ltd, Northern Ireland; 5 мкг/мл) на жидкостном сцинтилляционном счетчике по количеству ³H-тимидина, включившегося в ДНК пролиферирующих клеток. Результаты по каждой пробе выражали в виде абсолютных величин пролиферативной активности клеток (число импульсов за 1 минуту).

Определение продукции ИЛ-4 и ИФН-γ в супернатантах культур клеток селезенки и трахеобронхиальных лимфоузлов проводили с использованием иммуноферментных тест систем Quantikine™ (R&D Systems, Minneapolis) в соответствии с инструкцией по использованию. Уровень ИФН-γ и ИЛ-4 (пкг/мл) в исследуемых образцах рассчитывали по калибровочной кривой зависимости оптической плотности от концентрации цитокина.

Определение уровня ИЛ-2 (спонтанной и индуцированной) определяли в первичных культурах спленоцитов после 24 часовой культивации клеток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂ по уровню пролиферации ИЛ-2 - зависимой клеточной линии CTLL-2 (J.Immunol., 120(6): 2027-2032; 1978).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрического теста Стьюдента.

Иммуногенность рекомбинантных гриппозных векторов.

С целью индукции системного иммунного ответа мышей линии С57black/6 двукратно иммунизировали рекомбинантными штаммами вируса гриппа А, экспрессирующими ранний секреторный микобактериальный антиген (ESAT-6). Для усиления иммунного ответа повторную иммунизацию проводили гриппозным вектором другого подтипа.

Т-клеточный иммунный ответ определялся путем измерения пролиферативной активности спленоцитов и их способности к выработке ИФН-γ в ответ на стимуляцию рекомбинан