Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов

Новые слитые белки тромбомодулина, обеспечивающие направленный перенос к тканевому фактору, в качестве антикоагулянтов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Сохранение надлежащего баланса между прокоагулирующей и антикоагулирующей активностью в кровеносных сосудах существенно для нормального гемостаза (Е.W.Davie и др., Biochemistry, 30 (43), 1991, с. 10363-10370). Нарушение баланса в направлении коагуляции приводит к тромбозам, которые могут вызвать сердечный приступ, инсульт, легочную эмболию и венозный тромбоз. Существует необходимость в создании более эффективных и безопасных антикоагулянтов для лечения специфических тромбозных нарушений.

Тканевой фактор (TF) - это трансмембранный гликопротеин, который является основным инициатором каскада коагуляции (Y.Nemerson, Thromb. Haemost. 74 (1), 1995, с. 180-184). При нормальных физиологических условиях TF не находится в контакте с кровью. При сосудистом повреждении воздействие на кровь субэндотелиального TF и коллагена приводит к активации факторов коагуляции и тромбоцитов и впоследствии к образованию гемостатической пробки. Неуместная индукция экспрессии TF в различных клинических ситуациях может привести к угрожающему жизни тромбозу и/или содействовать патологическим осложнениям. Воздействие TF на последующее разрушение тромбоцита считается ответственным за тромбозную окклюзию, приводящую к острому инфаркту миокарда или инсульту. В этих ситуациях противоспалительные сигнальные пути, активированные факторами коагуляции, содействуют также образованию отека и увеличению объема инфаркта. Сосудистое повреждение, ассоциированное с ангиопластикой, приводит к активации TF на клетках гладкой мышцы (SMC), которая, как считается, индуцирует пути передачи клеточных сигналов, связанные с рестенозом. Сверхэкспрессия TF при раке и грамотрицательном сепсисе приводит к угрожающему жизни тромбозу и активации воспалительных путей.

Комплекс факторов VIIa (FVIIa)/TF включается в патогенетический механизм при различных тромбозных заболеваниях, и циркулирующий уровень TF является фактором риска для некоторых пациентов. Факторы VIIa и TF играют уникальные роли при сосудистом повреждении в сохранении гемостаза и инициации тромбоза. Экспрессируется TF обычно в адвентициальной оболочке, но при сосудистом заболевании несоответственно активируется и экспрессируется в середине и неоинтиме сосуда. Экспрессия TF в атеросклеротических бляшках повышена и экранирована от крови толстым волокнистым слоем, который может разрушаться, высвобождая TF. Хирургические вмешательства, такие как баллонная ангиопластика, установка стента или эндартерэктомия, повреждают сосудистую стенку и высвобождают находящийся под ней TF. В атеросклеротической толстостенной бляшке с высоким содержанием липидов спонтанное разрушение или эрозия эндотелия приводит к воздействию TF и тромбозу, заканчивающимся нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда. TF может циркулировать в происходящих от клеток микрочастицах, и уровни циркулирующего TF при нестабильной стенокардии являются повышенными, допуская предположение о том, что этот циркулирующий TF может содействовать образованию тромба (Н.Soejima и др., Circulation, 99 (22), 1999, с. 2908-2913). Часто злокачественная опухоль ассоциируется с состоянием гиперкоагуляции, объясняемым сверхэкспрессией TF на опухолевых клетках. Это предрасполагает пациента к тромбозу глубоких вен, легочной эмболии и низкой степени коагулопатии потребления (DIC). Коагулопатия потребления приводит к отложениям фибрина в капиллярных сосудах, способствуя повреждению многих органов. Результаты, полученные на моделях тромбоза от острого артериального нарушения, указывают, что основанные на белках ингибиторы FVIIa/TF, такие как ингибитор активного центра фактора VIIa (FVIIai) и ингибитор метаболических путей тканевого фактора (TFPI), являются эффективными антитромбозными средствами с меньшей кровопотерей, по сравнению с ингибиторами тромбина и фактора Ха (FXa). Кроме того, ингибиторы FVIIa/TF превосходят другие антикоагулянты (например, гепарин, ингибиторы FXa) в предотвращении образования утолщения неоинтимы и сосудистого стеноза после нарушения, вызванного баллонной ангиопластикой (Y. Jang и др., Circulation, 92 (10), 1995, с. 3041-3050).

Тромбомодулин (ТМ) - это трансмембранный гликопротеин, который обладает антикоагулирующими свойствами и преимущественно экспрессируется на полостной поверхности эндотелиально-клеточной выстилки кровеносных сосудов (N.L.Esmon и др., J.Biol. Chem. 257 (2), 1982, с. 859-864; H.H. Salem и др., J. Biol. Chem. 259 (19), 1983, с. 12246-12251). Зрелый с полной последовательностью ТМ является модульным белком из 557 аминокислотных остатков, составленным из 5 структурных доменов: N-концевого гидрофобного участка (остатки 1-226); богатого цистеином участка (остатки 226-462); O-гликозилированного Ser/Thr-богатого участка (остатки 463-497); гидрофобного трансмембранного участка (остатки 498-521); и С-концевого цитоплазматического хвоста (остатки 522-557).

Богатый цистеином участок включает шесть повторяющихся структур, гомологичных предшественнику эпидермального фактора роста (EGF), названного EGF-подобный, EGF-гомологичный или EGF-домены. Богатый цистеином участок далее может быть разделен на 3 домена: EGF-подобные повторы 1, 2 и 3 (EGF 123, остатки 226-344), междоменная петля между EGF3 и EGF4 (остатки 345-349) и EGF-подобные домены 4, 5 и 6 (EGF456, остатки 350-462). Функция EGF456 состоит в том, чтобы опосредовать связывание и активацию белка С. Одно исследование предполагает, что пятый и шестой EGF-подобные повторы (EGF5, остатки 390-407 и EGF6, остатки 427-462 соответственно) обладают способностью связывать тромбин (S. Kwosawa и др., J. Biol. Chem. 263 (13), 1988, с. 5993-5996); другое предполагает, что домена EG456 достаточно, чтобы действовать в качестве кофактора опосредованной тромбином активирующей белок С активности (М. Zushi и др., J. Biol. Chem. 264 (18), 1989, с. 10351-10353). Ser/Thr-богатый домен усиливает опосредованное EGF456 связывание тромбина. Третий EGF-подобный повтор (EGF3, остатки 311-344) требуется для активации ингибитора фибринолиза, активируемого тромбином (TAFI). Описано несколько точечных мутантов, которые препятствуют активации TAFI (W. Wang и др., J. Biol. Chem. 275 (30), 2000, с. 22942-22947). Комплекс тромбин/ТМ превращает белок С в активированный белок С (АРС), который, в свою очередь, разрушает факторы Va и Villa, препятствуя тем самым генерации тромбина. Следовательно, ТМ функционирует как молекулярный переключатель, превращая тромбин из прокоагулянта в антикоагулянт.

Значение К_m белка C для комплекса тромбин/ТМ снижается 10-кратно, когда ТМ локализован на поверхности мембраны (C.N.Esmon, ESEB J. 9 (10), 1995, с. 946-955). Концентрация белка С в крови (0,065 мкМ) значительно ниже сообщенного значения К_m (5 мкМ) для растворимого комплекса ТМ/тромбин, отсюда утверждение, что ТМ на прокоагулирующей мембранной поверхности приведет к заметному локальному повышению скорости генерации белка С.

ТМ ингибирует тромбоз по механизму, отличному от гепарина или его производных. Гепарин является кофактором антитромбина III и ингибирует как FXa, так и тромбин по антитромбин III-зависимому механизму. Связанный с тромбом тромбин защищен от действия антитромбина III, который ограничивает антитромбозную эффективность гепарина или гепарина с низкой молекулярной массой (LMWH) на существующих ранее сгустках. Это объясняет отсутствие у гепарина или LMWH способности ингибировать рост тромба, запускаемый связанным со сгустком тромбином или протромбиназой в исследованиях на приматах, кроме человека. В противоположность этому рекомбинантный ТМ ослабляет индуцированную сгустком генерацию тромбина и образование фибрина дозозависимым способом (М. Mohri и др., Thromb. Haemost. 80 (6), 1998, с. 925-929). Ингибирующий эффект ТМ аннулируется антителом к белку С. Подавление связанной со сгустком прокоагулянтной активности является клинически актуальным, т.к. связанная со сгустком прокоагулирующая активность приводит к более быстрому росту тромба и в конечном итоге к сосудистой окклюзии или тромбоэмболическим осложнениям. Ингибирование роста тромба позволяет эндогенной фибринолитической системе удалять сгустки быстрее и полностью. Кроме того, ожидается также, что ТМ более эффективен, чем гепарин, при патологических состояниях, при которых антитромбин в плазме снижен, таких как коагулопатия потребления (DIC). Несмотря на то что как ТМ, так и гепарин ингибируют поглощение тромбоцитов и фибриногена при экспериментальной DIC, только ТМ был эффективен, когда уровни антитромбина III снижались.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает новые слитые белки, которые действуют как антикоагулянты и включают белок, который взаимодействует или с тканевым фактором (TF), или с комплексом фактора VIIa/тканевой фактор (FVIIa/TF), и функционально связан с тромбомодулиновым (ТМ) доменом EGF456, одним или в комбинации с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из домена N-концевого гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4 и O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.

Антикоагулирующий слитый белок по данному изобретению направлен на и связывает TF или комплекс FVIIa/TF в участке повреждения, локализуя ТМ в участке повреждения и таким образом предотвращая образование тромба и в связи с этим действуя более эффективно в качестве антикоагулянта, по сравнению или с растворимым антителом к TF, или растворимым ТМ, или фрагментами ТМ. Слитый белок более эффективен, чем гепарин с низкой молекулярной массой (LMWH), при лечении некоторых заболеваний, включая, но без ограничения, сепсис, коагулопатию потребления, ишемический удар, тромбоз глубоких вен, острые коронарные синдромы, тромбозные осложнения после ангиопластики и коагулопатию при прогрессирующей злокачественной опухоли. Кроме того, слитый белок применяется в хирургических операциях на капиллярных сосудах, в трансплантатах кожи и вен и при пересадке органов.

В другом аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие в качестве объекта слитые белки.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ предохранения пациента от образования тромба, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка, и в связи с этим подавление генерации тромбина без непосредственного воздействия на другие параметры коагуляции, такие как активация и агрегация тромбоцитов.

В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения и лечения тромбоза глубоких вен (DVT) или коагулопатии потребления (DIC), или острого коронарного синдрома, или злокачественной опухоли с проявлением коагулопатии у пациента, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка.

В другом аспекте изобретение относится к способу регулирования воспалительного ответа у пациента, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества слитого белка.

Еще в одном аспекте слитый белок по изобретению может быть использован для образования не являющегося тромбогенным покрытия медицинских инструментов, контактирующих с кровью.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему слитый белок, включающий белок, который обеспечивает направленный перенос и связывает TF или комплекс FVIIa/TF и домены ТМ. Альтернативно набор может включать последовательности ДНК, кодирующие компоненты слитого белка.

Раскрываются также способы получения слитых белков по изобретению как рекомбинантные, так и синтетические.

Описание графиков

Фиг.1. Связывание антитела scFv(TF)3e10 с растворимым TF (sTF) увеличивает кажущееся сродство sTF к FVIIa. Активационный анализ sTF/FVIIa осуществляли, как описано в примере 5, озаглавленном «Анализ активации sTF/FVIIa», используя 2 нМ FVIIa в присутствии и в отсутствие 800 нМ scFv(TF)3e10. Титровали sTF в пробе и определяли скорость расщепления хромогенного субстрата (S-2266). Значение кажущейся K_D для sTF рассчитывали, используя стандартную 4-параметрическую аппроксимацию.

Фиг.2. Измерение сродства связывания scFv(TF)3e10 к sTF. Анализ sTF/FVIIa осуществляли, как описано в примере 5, озаглавленном «Анализ активации sTF/FVIIa», используя 3 нМ sTF и 2 нМ FVIIa. Использованная концентрация sTF была ниже значения K_D для связывания с FVIIa. Связывание антитела scFv (TF)3e10 снижало значение K_D sTF для связывания с FVIIa, приводя к повышению образования комплекса sTF/FVIIa и, следовательно, скорости расщепления хромогенного субстрата S2266. Прибавляли scFv(TF)3e10 при увеличивающихся концентрациях и повышенную скорость реакции использовали, чтобы определить кажущуюся K_D антитела для sTF, используя стандартную 4-параметрическую аппроксимацию.

Фиг.3. Микрокалориметрический анализ показывает, что scFv(TF)3e10 имеет 20-кратно более высокое сродство к комплексу sTF/FVIIa, чем к одному sTF. Комплекс sTF/FVIIa был предварительно получен прибавлением 2,3-кратного молярного избытка FVIIai по отношению к sTF. Гранулометрическую эксклюзионную хроматографию использовали, чтобы подтвердить, что sTF полностью комплексирован. Для определения сродства антитела к комплексу прибавляли 1,2 мкМ комплекса sTF/FVIIa в ячейку микрокалориметра и 65 мкМ антитела scFv(TF)3e10 прибавляли в шприц. Для определения сродства антитела к одному sTF прибавляли 10 мкМ sTF в ячейку и 141 мкМ scFv(TF)3e10 прибавляли в шприц. Анализ данных проводили, используя программу MicroCal Origin. Данные были аппроксимированы к одному сайту связывания.

Фиг.4. Антитело scFv(TF)3e10 дозозависимо ингибирует анализ активации фактора Х (FX). Подробности анализа описаны в примере 5, озаглавленном «Анализ активации фактора X». IC₅₀ означает дозу, требуемую для достижения 50% ингибирования.

Фиг.5. Слитый белок сильнее подавляет коагуляцию, чем антитело TF или один ТМi456. Анализ протромбинового времени (ПВ) проводили, чтобы сравнить слитый белок с антителом TF или одним TMi456. Соответствующий объем концентрированного ингибитора или антитела TF (scFv(TF)3e10), TMi456 или слитого белка (scFv(TF)3e10-TMi456) прибавляли к 100 мкл рекомбинантного человеческого тромбопластина (Ortho Recombiplastin). Приблизительно 2 мин позже прибавляли 100 мкл восстановленной человеческой плазмы. Время коагуляции определяли на коагулометре Haemoliance. Кривые ответа на дозу получали для каждого ингибитора и затем использовали регрессионный анализ, чтобы рассчитать концентрацию (в нМ), необходимую для двукратного увеличения времени свертывания крови.

Фиг.6. Слитый белок сохраняет полную кофакторную активность для активации белка С. Анализ, описанный в примере 5, озаглавленный «Анализ (хромогенный) активации белка С», включал 20 мкл образца ТМ или ТМ1456, который содержал домены EGF4-6 и междоменную петлю между EGF3 и EGF4, или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456), 20 мкл 1,5 мкМ белок С и 20 мкл 3 нМ α-тромбин. Активации давали возможность проходить в течение 1 ч. Фазу активации останавливали путем добавления 20 мкл 0,16 ед/мл гирудина. Затем прибавляли 100 мкл 1 мМ хромогена S2266 и А405 определяли каждые 10 сек в течение 30 мин. Скорость реакции зависит от количества генерированного активированного белка С. Данные выражены в мОП/мин.

Фиг.7. Скорость активации белка С слитым белком повышается на содержащих TF фосфолипидных поверхностях. На скорость активации белка С не оказывает влияния прибавление везикул TF. Образец для анализа, описанного в примере 5, озаглавленном «Анализ активации белка С (на TF-богатой поверхности)», содержал 20 мкл образца ТМ, или ТМ1456, или слитый белок (scFv (TF)3e10-TMi456), 20 мкл 1,5 мкМ белка С, 20 мкл 3 нМ α-тромбина и 20 мкл буфера или везикул TF (инновин, человеческий рекомбинантный TF, 4х нормальная концентрация для ПВ). Активации давали проходить в течение 1 ч. Фазу активации останавливали добавлением 20 мкл 0,16 ед/мл гирудина. Затем прибавляли 100 мкл 1 мМ хромогена S2266 и А405 определяли каждые 10 сек в течение 30 мин. Скорость реакции зависела от количества генерированного активированного белка С. Данные выражены в мОП/мин.

Фиг.8. Слитый белок показывает более высокую специфичность к индуцированной TF коагуляции, чем TMi456. Анализ частичного активированного тромбопластинового времени (ЧАТВ) чувствителен к ингибиторам внутреннего и центрального метаболических путей коагуляции. Коагуляция, которая происходит в данном анализе, независима от TF. Ингибиторы - или антитело TF (scFv(TF)3e10), TMi456, или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) - разбавляли в 50 мкл восстановленной человеческой плазмы до конечной концентрации, которая давала двукратное увеличение в анализе протромбинового времени (ПВ). В коагулометр затем прибавляли 50 мкл реагента АРТТ (кефалин из кроличьего мозга в 0,1 мМ эллаговой кислоте, с буфером, стабилизаторами и консервантами; Alexin HS) и 50 мкл раствора CaCl₂ (0,02 моль/л) и определяли время свертывания крови в сек.

Фиг.9. Слитый белок сильнее подавляет индуцированную TF коагуляцию цельной крови, чем любой из его компонентов в отдельности. Коагуляцию цельной крови анализировали, используя анализатор тромбоэластограф (TEG) Haemoscope. К цельной крови в цитратном буфере прибавляли 120 нМ антитела TF (scFv(TF)3e10), TMi456 или слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) вместе с 10 мкл тромбопластинового реагента (разведение 1:64) и 20 мкл 0,2 М CaCl₂. Значение R (время до начального образования фибрина) получали для каждого образца. Данное значение затем превращали в % не ингибированного контрольного значения R.

Фиг.10. Слитый белок проявляет более предсказуемый дозовый ответ, чем LMWH, в анализе коагуляции цельной крови (TEG). К цельной крови в цитратном буфере прибавляли увеличивающиеся концентрации (15 нМ начальная и увеличенные с помощью инкрементов 2х) слитого белка (scFv(TF)3e10-TMi456) или увеличивающиеся концентрации (0,15 ед/мл начальная и увеличенные 2х) эноксапарина (LMWH) наряду с 10 мкл тромбопластинового реагента (разведение 1:64) и 20 мкл 0,2 М CaCl₂. Значение R (время до начала образования фибрина) получали для каждого образца и строили график зависимости от относительной концентрации (принимали самую низкую концентрацию за 1 для каждого (подобного значения R), затем последующие концентрации увеличивали 2х).

Фиг.11. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 эффективен in vivo на модели коагулопатии потребления (DIC). Антитело TF (scFv(TF)3e10) и слитый белок (scFv(TF)3e10-TMi456) оценивали на крысиной модели тромбоэмболии, описанной в примере 8, по (А) проценту смертности и (Б) количественному показателю распространенность заболевания-смертности. (А) В обработанной наполнителем группе использованная доза TF привела к 60% летальности (LD₆₀). Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 при 0,7 нмоль/кг полностью предотвращал гибель. В противоположность этому, scFv(TF)3e10 при 0,7 нмоль/кг не влияло на гибель. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 был более эффективным, чем 10-кратно более высокая доза scFv(TF)3e10. (Б) В обработанной наполнителем группе применяемая in vivo доза TF приводила к средней количественной оценке распространенности заболевания-смертности в 2,6 балла, основанной на следующей оценке в баллах: 0 - нет воздействия; 1 - слабая дыхательная недостаточность (восстановление в течение 30 мин); 2 - острая дыхательная недостаточность (агонирующее состояние, восстановление требует более чем 60 мин); и 3 - гибель. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 дозозависимым образом предотвращал индуцированную TF гибель и дыхательную недостаточность при значении 50% эффективной дозы ED₅₀ 0,46 нмоль/кг (0,019 мг/кг). В дозе 7,0 нмоль/кг scFv(TF)3e10-TMi456 полностью предотвращал как гибель, так и дыхательную недостаточность, а в дозе 0,7 нмоль/кг полностью предотвращал гибель и значительно уменьшал дыхательную недостаточность. В противоположность этому, scFv(TF)3e10 при 0,7 нмоль/кг не оказывало влияния на гибель и слабо либо совсем не действовало на дыхательную недостаточность. Слитый белок scFv(TF)3e10-TMi456 был более эффективен, чем 10-кратно более высокая доза scFv(TF)3e10.

Подробное описание изобретения

Антикоагулирующий слитый белок по настоящему изобретению включает белок, который обеспечивает направленный перенос и взаимодействует или с тканевым фактором (TF), или с комплексом фактор VIIa/тканевой фактор (FVIIa/TF), который функционально связан с доменом EGF456 тромбомодулина (ТМ), одним или в комбинации по меньшей мере с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из N-концевого домена гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4, O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.

Определения

В описании по настоящему изобретению определены следующие термины, как указано ниже.

Термин «рекомбинантные белки или пептиды» относится к белкам или пептидам, полученным с использованием методик рекомбинантной ДНК, т.е. полученным из микробных клеток и клеток млекопитающих, трансформированных с помощью конструкции экзогенной ДНК, кодирующей требуемый полипептид. Белки или полипептиды, экспрессированные в большинстве бактериальных культур, будут свободны от гликана. Белки и полипептиды, экспрессированные в дрожжевых клетках, имеют гликозилированную структуру, отличную от таковой, экспрессированной в клетках млекопитающих.

Термин «нативные» белки или полипептиды относится к белкам или полипептидам, выделенным из природных источников. Термин «нативный ТМ» будет включать существующий в природе ТМ и его фрагменты.

Термин «кодирующая последовательность» ДНК означает последовательность ДНК, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в полипетид в клетке-хозяине при помещении под контроль соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют с помощью инициирующего кодона на 5'-N-конце и трансляционного терминирующего кодона на 3'-С-конце. Кодирующая последовательность может включать прокариотические последовательности, кДНК из эукариотической мРНК, геномные последовательности ДНК и синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно будет располагаться в положении 3' по отношению к кодирующей последовательности.

Термин «слитый белок» означает белок, возникающий в результате экспрессии по меньшей мере двух функционально связанных гетерологичных кодирующих последовательностей. Слитый белок по изобретению состоит из белка, который обеспечивает направленный перенос и взаимодействует или с TF, или с комплексом FVIIa/TF, который функционально связан только с доменом EGF456 тромбомодулина (ТМ) или находится в комбинации по меньшей мере с другим доменом ТМ, выбранным из группы, состоящей из N-концевого домена гидрофобного участка, домена EGF123, междоменной петли между EGF3 и EGF4, O-гликозилированного Ser/Thr-богатого домена или их аналогов, фрагментов, производных или вариантов.

Термин «белок, который обеспечивает направленный перенос» означает белок, который связывается или взаимодействует с другим белком или белковым комплексом. Белок, обеспечивающий направленный перенос, по данному изобретению означает белок, который связывается или взаимодействует с TF или комплексом FVIIa/TF. Например, антитело к TF или к комплексу FVIIa/TF является белком, обеспечивающим направленный перенос, по данному изобретению. Двумя другими примерами белков, обеспечивающих направленный перенос, являются ингибированный по активному центру фактор VIIa (FVIIai), который может связывать TF, образуя неактивный комплекс FVIIai/TF, и ингибитор метаболизма тканевого фактора (TFPI), который может связывать и инактивировать комплекс FVIIa/TF.

Термин «нуклеотидная последовательность» означает гетерополимер из дезоксирибонуклеотидов (основания - аденин, гуанин, тимин или цитозин). Последовательности ДНК, кодирующие слитые белки по данному изобретению, могут быть составлены из синтетических фрагментов ДНК, происходящих от кДНК, и коротких олигонуклеотидных линкеров, чтобы обеспечить получение синтетического гена, который способен экспрессироваться с помощью рекомбинантного вектор экспрессии. При обсуждении структуры отдельных двухцепочечных молекул ДНК последовательности могут быть описаны в контексте согласно обычному правилу приведения последовательности только в направлении от 5'-конца к 3'-концу вдоль не транскрибированной цепи кДНК.

Термин «рекомбинантный вектор экспрессии» означает конструкцию реплицируемой ДНК, использованную для того, чтобы или амплифицировать, или экспрессировать ДНК, кодирующую слитые белки по настоящему изобретению. Вектор экспрессии содержит контролирующие последовательности ДНК и кодирующую последовательность. Контролирующие последовательности ДНК включают промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, сигналы полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции, расположенные против хода транскрипции домены и энхансеры. Рекомбинантные системы экспрессии, как определено в контексте, будут экспрессировать слитые белки при индукции регуляторных элементов.

Термин «трансформированные клетки-хозяева» относится к клеткам, которые были трансформированы и трансфицированы экзогенной ДНК. Экзогенная ДНК может быть или может не быть интегрирована (ковалентно связана) с хромосомной ДНК, составляющей геном клетки. Например, в прокариотах и дрожжах экзогенная ДНК может сохраняться в эписомальном элементе, таком как плазмида, или устойчиво интегрировать в хромосомную ДНК. Что касается эукариотических клеток, то устойчиво трансформированная клетка означает клетку, в которой экзогенная ДНК стала интегрированной в репликацию хромосом. Эта стабильность демонстрируется способностью линий или клонов эукариотических клеток продуцировать популяцию дочерних клеток, содержащих экзогенную ДНК.

Термин «тромбомодулин (ТМ)» относится к гликопротеину поверхности клеток эндотелия, который образует с высоким сродством к комплексу с тромбином. Гены, кодирующие нативный ТМ (как его геномную форму, так и в форме кДНК), были выделены из бычьего и человеческого источников и секвенированы (R.W.Jackman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 (23), 1986, с. 8834-8838 и R.W. Jackman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (18), 1987, с. 6425-6429, обе ссылки включены в контекст путем цитирования). Последовательности ТМ для быка, человека и мыши обладают высокой степенью гомологии друг с другом. В случае человеческого ТМ кДНК кодирует белок 60,3 кДа из 575 аминокислот, включающий сигнальную последовательность примерно из 18 аминокислот, см., например, патент US 5827824.

Когда тромбин связывается с ТМ, может быть тысячекратное или большее увеличение скорости активации белка С, которая образует активированный антикоагулирующим ферментом белок С. Кроме того, когда тромбин связывается с ТМ, тромбин больше не работает в качестве прокоагулирующего фермента. А именно, катализируемые тромбином образование фибрина, активация фактора V и активация тромбоцитов, - все ингибируются в присутствии ТМ. Таким образом, ТМ превращает тромбин в физиологический антикоагулянт.

Термин «тромбомодулиновый (ТМ) домен» относится к дискретной аминокислотной последовательности, которая может быть ассоциирована с особой функцией или особенностью ТМ, такой как структура, характерная для третичной структуры. Ген ТМ полной протяженности кодирует предшественник или прополипептид, содержащий следующие домены: аминокислоты 18-1 - сигнальная последовательность; аминокислоты 1-226 - N-концевой гидрофобный участок; аминокислоты 227-462 - богатый цистеином участок; состоящий из 6 тандемных EGF-подобных повторов, соединенных небольшими междоменными пептидами или петлями; аминокислоты 463-497 - O-гликозилированный Ser/Thr-богатый участок; аминокислоты 498-521 - гидрофобный трансмембранный участок и аминокислоты 522-557 - С-концевой цитоплазматический хвост. Богатый цистеином участок может быть далее разделен на 3 домена: аминокислоты 226-344 - EGF123, состоящий из EGF-подобных повторов 1, 2 и 3 (остатки 226-344); аминокислоты 345-349 - междоменная петля между EGF3 и EGF4 и аминокислоты 350-462 - EGF456, состоящий из EGF-подобных доменов 4, 5 и 6 (см., например, C.S. Yost и др., Cell, 34 (3): 1983, с. 759-766; D.Z. Wen и др., Biochemistry, 26 (14), 1987, с. 4350-4357, и W. Wang и др., 2000, см. выше, при этом все публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки).

Термины «аналог», «фрагмент», «производное» и «вариант», когда относятся к слитым белкам по данному изобретению, а также к белкам, обеспечивающим направленный перенос и доменам ТМ, означают аналоги, фрагменты, производные и варианты слитых белков, белков, обеспечивающих направленный перенос, и доменов ТМ, которые фактически сохраняют такую же биологическую функцию или активность, как описанные ниже.

Термин «аналог» включает прополипептид, который содержит внутри себя аминокислотную последовательность слитого белка по данному изобретению. Активный слитый белок по данному изобретению может быть отщеплен от дополнительных аминокислот, которые замыкают молекулу предшественника слитого белка, с помощью природных превращений in vivo или с помощью методик, хорошо известных специалистам, таких как энзиматическое или химическое расщепление. Например, нативный ТМ естественно экспрессируется как полипептид из 575 аминокислот, который затем подвергается процессингу in vivo, высвобождая активный зрелый полипептид из 557 аминокислот.

Термин «фрагмент» означает часть слитого белка, белка, обеспечивающего направленный перенос, или доменов ТМ, которые фактически сохраняют одинаковую функциональную активность, как показано в анализах in vivo, раскрытых в контексте, как описано далее.

Термин «производное» включает все модификации слитого белка, которые фактически сохраняют функции, раскрытые в контексте, и включают дополнительную структуру с сопутствующей функцией, например, слитые белки, модифицированные полиэтиленгликолем (PEG), которые имеют большее время полувыведения, O-гликозилированные слитые белки, модифицированные добавлением сульфата хондроитина, и биотинилированные слитые белки, как описано далее.

Термины «по существу подобная функциональная активность» и «по существу та же самая биологическая функция или активность» означают каждый, что интенсивность биологической активности находится в интервале 30-100% или более от биологической активности, продемонстрированной полипептидом, с которым происходит сравнение, когда биологическая активность каждого полипептида определена с использованием той же методики или того же анализа. Например, слитый белок или домен ТМ, который имеет по существу подобную функциональную активность, что и слитый белок примера 2 (последовательность с идентификационным номером 2 (SEQ ID No:2)), означает, что белок при тестировании в анализе (хромогенном) активации белка С, описанном в примере 5, демонстрирует накопление активированного белка С. Белок, который обеспечивает направленный перенос и имеет по существу подобную функциональную активность, что и антитело к TF примера 1 (SEQ ID No:1), означает, что белок при тестировании в анализе sTF/FVIIa или в анализах активации FX, описанных в примере 5, демонстрирует способность связывать или нейтрализовать TF или комплекс FVIIa/TF.

Термин «подобие» между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных заместителей одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Такие консервативные заместители включают таковые, описанные выше в The Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, Dayhoff и Argos (1989) EMBO J. 8, 1987, с. 779-785. Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из следующих групп, представляют консервативные изменения:

-Ala, Pro, Gly, GLN, Asn, Ser, Thr;

-Cys, Ser, Tyr, Thr;

-Val, ILe, Leu, Met, Ala, Phe;

-Lys, Arg, His;

-Phe, Tyr, Trp, His и

-Asp, Glu.

Все другие технические термины, использованные в контексте, имеют такое же значение, которое используют специалисты в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Белок, обеспечивающий направленный перенос

Белок, обеспечивающий направленный перенос, по изобретению означает белок, который обладает способностью специфически связываться с конкретной предварительно выбранной молекулой-мишенью, например TF или комплексом FVIIa/TF, и затем служит для направления слитого белка в клетку или ткань, содержащую предварительно выбранную молекулу-мишень.

В одном варианте воплощения по данному изобретению белок, обеспечивающий направленный перенос, означает антитело, которое может связываться и нейтрализовать TF или комплекс FVIIa/TF. Термин «антитело», как он использован в контексте, включает интактные молекулы иммуноглобулина (Ig), а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂ и Fv, которые способны связывать эпитоп TF или комплекса FVIIa/TF. Обычно требуется по меньшей мере 6, 8, 10 или 12 смежных аминокислот, чтобы образовать эпитоп. Однако для эпитопов, которые включают не являющиеся смежными аминокислоты, может потребоваться больше аминокислот, например, по крайней мере 15, 25 или 50.

Обычно антитело, которое специфически связывается с TF или комплексом FVIIa/TF, обуславливает детектирующий сигнал по меньшей мере 5-, 10- или 20-кратно более сильный, чем детектирующий сигнал, обусловленный другими белками при использовании в иммунохимическом анализе. Предпочтительно антитела, которые связываются специфически с TF или комплексом FVIIa/TF, не детектируют другие белки в иммунохимических анализах и могут образовывать иммунопреципитат TF или комплекса FVIIa/TF из раствора.

TF или комплекс FVIIa/TF могут быть использованы для иммунизации млекопитающего, такого как мышь, крыса, кролик, морская свинка, обезьяна или человек, чтобы продуцировать поликлональные антитела. Если требуется, TF или комплекс FVIIa/TF могут быть конъюгированы с белком-носителем, таким как бычий сывороточный альбумин, тироглобулин и гемоцианин из Megathura crenulata. В зависимости от вида хозяина могут применяться различные адъюванты, чтобы усилить иммунологический ответ. Такие адъюванты включают, но без ограничения, адъювант Фрейнда, минеральные гели (например, гидроксид алюминия) и поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин из Megathura crenulata и динитро фенол). Среди адъювантов, применяемых у человека, особенно полезными являются BCG (bacilli Calmette-Guerin) и Cornybacteriuparvum.

Моноклональные антитела, которые специфически связываются с TF или комплексом FVIIa/TF, могут быть получены с использованием любой методики, которая обеспечивает продукцию молекул антител стабильными клеточными линиями в культуре. Эти методики включают, но без ограничения, гибридомную технику, технику человеческой В-клеточной гибридомы и технику гибридомы вируса Эпштейна-Барра (EBV) (Kohler и др., Nature 256, 1987, с. 495-497; Kozbor и др., J. Immunol. Methods 81, 1985, с. 31-42; Cote и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, с. 2026-2030; и Cote и др., Mol. Cell Biol. 62, 1984, с. 109-120).

Кроме того, могут быть использованы методики, созданные для продукции «химерных антител», сплайсинг генов мышиного и человеческого антител, чтобы получить молекулу с соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison и др., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, с. 6851-6855; Neuberger и др., Nature 312, 1984, с. 604-608; Takeda и др., Nature 314, 1985, с. 452-454). Моноклональные и другие антитела могут быть также «гуманизированы», чтобы предотвратить у пациента формирование иммунного ответа к антителам, когда оно применяется в терапевтических целях. Такие антитела обладают достаточным сходством с последовательностью человеческого антитела, чтобы непосредственно использоваться в слитом белке, или могут потребовать изменения нескольких ключевых остатков. Различия в последовательностях между антителами грызунов и человеческими последовательностями может быть сведено к минимуму путем замены остатков, которые отличаются от таковых в человеческих последовательностях, с помощью сайт-направленного мутагенеза отдельных остатков или с помощью трансплантации полностью комплементарных детерминирующих участков. Альтернативно гуманизированные антитела могут быть продуцированы с использованием рекомбинантных способов, как описано в патенте GB 2188638В. Антитела, которые связываются специфично с TF или комплексом FVIIa/TF, могут содержать антиген-связывающие сайты, которые или частично, или полностью гуманизированы, как раскрывается в патенте US 5565332.

Альтернативно методики, описанные для продуцирования одноцепочечных антител, могут быть адаптированы, используя способы, известные специалистам, для продуцирования одноцепочечных антител, которые специфично связываются с TF или комплексом FVIIa/TF. Антитела с родственной специфичностью, но отличающегося идиотипического состава, могут быть получены путем перестановки цепи из случайных комбинаторных библиотек Ig (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, с. 11120-11123).

Одноцепочечные антитела могут быть также сконструированы с применением способа амплификации ДНК, такого как полимеразная цепная реакция, используя гибридомную кДНК в качестве матрицы (Thirion и др., Eur. J. Cancer Prev.5, 1996, с. 507-511). Одноцепочечные антитела