Бета-глюканазы talaromyces emersonii

Бета-глюканазы talaromyces emersonii

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к новым (β-)глюканазам (и, таким образом, также к целлюлазам) из гриба Talaromyces, в частности Talaromyces emersonii, и к их применению для расщепления глюкана в целлюлозе.

Предпосылка изобретения

Состав клеточной стенки растений сложен и изменчив. Полисахариды главным образом выявляют в форме длинных цепей целлюлозы (основного структурного компонента клеточной стенки растений), гемицеллюлозы (содержащей различные цепи β-ксилана, такие как ксилоглюканы) и пектина.

Бета-глюкан (или более точно, (1→3)(1→4)β-D-глюкан), М.м. от 10 до 14 кДа, является компонентом гемицеллюлозы растений (М.м. примерно 700 кДа) и состоит из основной цепи остатков глюкопиранозы, соединенных β-1,4 и 1,3-связями. Другим компонентом является ксилан, который состоит из β-1,4-связанных остатков ксилозы, необязательно замещенных боковыми цепями, такими как остатки арабинозы и/или глюкуроновой кислоты.

Основные различия существуют между однодольными (например, злаковые и травы) и двудольными (например, клевер, рапс и соя) и между семенами и вегетативными частями растения. Однодольные характеризуются наличием арабиноксиланового комплекса в качестве основной цепи гемицеллюлозы, а основная структура гемицеллюлозы у двудольных представляет собой ксилоглюкановый комплекс. У двудольных обнаружены более высокие концентрации пектина, чем у однодольных. В семенах, как правило, высокое содержание пектиновых веществ, но относительно низкое содержание целлюлозного материала.

Ферменты, разрушающие целлюлозу, используют для обработки растительного материала в корме, а также в пищевых добавках, или в качестве корма или пищевой добавки благодаря их способности действовать на основные компоненты клеточной стенки растений.

Большинство разрушающих целлюлозу ферментов, имеющихся в промышленности, по-видимому, являются глюканазами с относительно низкой молекулярной массой и средней стабильностью при высоких температурах. Однако для некоторых применений желательно использовать глюканазу с относительно высокой термостабильностью. В том случае, если глюканазу необходимо использовать в качестве пищевой добавки для животных, то высокая термостабильность предпочтительна из-за высокотемпературных условий, применяемых во время гранулирования корма для животных.

Сущность изобретения

В данном изобретении представлены новые β-глюканазы (или целлюлазы), которые способны расщеплять β-D-глюкан (или целлюлозу), такой, который присутствует в растительном материале.

В самом широком смысле изобретение относится к β-глюканазам (или целлюлазам) из Talaromyces, такого как Talaromyces emersonii (гриб). Указанные β-глюканазы могут расщеплять β-D-глюкан или целлюлозу, например, они являются β-1,4-эндоглюканазами, или обладают активностью EC 3.2.1.4.

Глюканазы могут иметь:

а. оптимум рН ниже 7,0 или 5,4, такой как ниже 5,0, например от 4,4 до 5,2 или от 3,0 до 6,0 или 7,0; или

b. оптимум температуры, по меньшей мере, 72, 75 или даже 81°С, такой как от 78 до 85°С или от 83 до 87°С.

Более конкретно данное изобретение относится к (выделенному) полипептиду β-глюканазы, содержащему:

(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 4 или 6; или

(ii) вариант (i), который способен расщеплять β-D-глюкан; или

(iii) фрагмент (i) или (ii), который способен расщеплять β-D-глюкан.

Согласно другому аспекту изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит:

(а) последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или последовательность, кодирующую полипептид согласно изобретению;

(b) последовательность, которая комплементарна, или которая гибридизуется с любой последовательностью, охарактеризованной в (а);

(с) фрагмент любой последовательности по п.(а) или (b);

(d) последовательность, обладающая, по меньшей мере, 60% идентичностью с любой последовательностью, которая определена в (а), (b) или (c); или

(e) последовательность, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к любой из последовательностей, которые определены в пп. с (а) по (d).

Изобретение также относится к следующему:

- вектор (например, экспрессирующий), который содержит полинуклеотид согласно изобретению и который может обладать способностью экспрессировать полипептид согласно изобретению;

- линия клеток или штамм, содержащий вектор согласно изобретению;

- способ получения полипептида согласно изобретению, причем указанный способ включает в себя поддержание линии клеток или штамма согласно изобретению в условиях, подходящих для достижения экспрессии полипептида, и, при необходимости, выделение полипептида;

- способ расщепления β-D-глюкана, причем указанный способ включает в себя осуществление контакта материала, содержащего β-D-глюкан, с полипептидом согласно изобретению;

- способ идентификации соединения, которое модулирует активность β-глюканазы, причем указанный способ включает в себя осуществление контакта полипептида согласно изобретению с тестируемым соединением в присутствии β-D-глюкана и наблюдение или регистрацию любой модуляции активности;

- способ лечения субъекта с гиперлипидемией, причем указанный способ включает в себя введение субъекту эффективного количества полипептида согласно изобретению; и

- применение полипептида в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность ДНК первой β-глюканазы (СЕА) согласно изобретению из Talaromyces emersonii;

SEQ ID NO: 2 является аминокислотной последовательностью первой β-глюканазы (СЕА);

SEQ ID NO: 3 является последовательностью ДНК второй β-глюканазы (СЕВ) из того же организма;

SEQ ID NO: 4 является аминокислотной последовательностью второй β-глюканазы (СЕВ);

SEQ ID NO: 5 является последовательностью ДНК третьей β-глюканазы (СЕС) также из того же самого организма;

SEQ ID NO: 6 является аминокислотной последовательностью третьей β-глюканазы (СЕС); и

SEQ ID NO: 7 и 8 представляют собой праймеры ПЦР, которые гибридизуются с SEQ ID NO: 1 (и были использованы для того, чтобы повторно клонировать вставки кДНК в ходе генетического анализа позитивных трансформантов).

Подробное описание изобретения

А. Полинуклеотиды.

Данное изобретение относится к полинуклеотиду (например, выделенному и/или очищенному), кодирующему полипептиды согласно изобретению. Таким образом, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему β-глюканазу, аминокислотная последовательность которой указана в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. Кроме того, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, обладающий значительной гомологией аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. Также в изобретение включен полинуклеотид, выбранный из следующей группы:

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или комплементарную ей последовательность;

(b) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться (например, избирательно) с нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или ее фрагмент;

(с) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, способную гибридизоваться (например, избирательно) с последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или ее фрагмент; и/или

(d) полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к полинуклеотиду, охарактеризованному в (а), (b) или (с).

Полинуклеотид согласно изобретению также включает в себя полинуклеотид, который:

(а) кодирует полипептид, обладающий активностью β-глюканазы, и этот полинуклеотид представляет собой

(1) кодирующую последовательность SEQ ID NO: 1, 3 или 5;

(2) последовательность, которая избирательно гибридизуется с комплементом последовательности, определенной в (1); или

(3) последовательность, которая является вырожденной в результате свойства генетического кода по отношению к последовательности, определенной в (1) или (2); или

(b) является последовательностью, комплементарной полинуклеотиду, определенному в (а).

Гибридизующиеся последовательности

Термин "способен к гибридизации" означает, что полинуклеотид-мишень согласно изобретению может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, используемой в качестве зонда (например, нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или ее фрагментом или ее комплементом) на уровне, значимо превышающем фон. Изобретение также включает в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют β-глюканазу или ее варианты, а также нуклеотидные последовательности, которые им комплементарны. Нуклеотидная последовательность может представлять собой РНК или ДНК, и таким образом, включает геномную ДНК, синтетическую ДНК или кДНК. Предпочтительно нуклеотидная последовательность является последовательностью ДНК и наиболее предпочтительно последовательностью кДНК. Обычно полинуклеотид согласно изобретению содержит непрерывную последовательность нуклеотидов, которая при селективных условиях способна соответствующим образом гибридизоваться с кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Такие нуклеотиды можно синтезировать способами, известными в данной области¹.

Полинуклеотид согласно изобретению может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5 (соответствующим образом) на уровне, значимо превышающем фон. Фоновая гибридизация может иметь место, например, вследствие наличия в библиотеке кДНК других кДНК. Уровень сигнала (например, создаваемого при взаимодействии между полинуклеотидом согласно изобретению и кодирующей последовательностью или комплементом кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5) обычно, по меньшей мере, в 10 раз, предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз интенсивнее, чем взаимодействия между другими полинуклеотидами и кодирующей последовательностью SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Интенсивность взаимодействия можно, например, измерить, с помощью радиоактивного мечения зонда, например, ³²Р. Избирательной гибридизации обычно можно достичь, используя условия низкой жесткости (0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия примерно при 40°С), средней жесткости (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия примерно при 50°С) или высокой жесткости (например, 0,3 М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия примерно при 60°С). Гибридизацию можно проводить при любых подходящих условиях, известных в данной области¹, и в качестве инструкции условиями низкой жесткости могут быть 2 × SSC при 55°С, условиями средней жесткости могут быть от 0,5 до 1,0 × SSC при 60°С и условиями высокой жесткости могут быть 0,1 или 0,2 × SSC при 60°С или выше (например, при 68°С), во всех случаях в 0,5% SDS.

Модификации

Полинуклеотиды согласно изобретению могут содержать ДНК или РНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Они также могут быть полинуклеотидами, которые содержат внутри себя один или несколько синтетических или модифицированных нуклеотидов. В данной области известен ряд разных типов модификаций полинуклеотидов. Модификации включают метилфосфатную или фосфоротиоатную основную цепь и/или присоединение акридина или цепей полилизина на 3'- или 5'- концах молекулы. Следует понимать, что для целей данного изобретения описанные здесь полинуклеотиды могут быть модифицированы любым способом, имеющимся в данной области.

Следует понимать, что специалисты в данной области, используя обычные способы, могут делать нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательности полипептида, кодируемого полинуклеотидами согласно данному изобретению, чтобы отразить использование кодонов любым конкретным организмом-хозяином, например организмом, в котором необходимо экспрессировать полипептиды согласно изобретению.

Кодирующую последовательность SEQ ID NO: 1, 3 или 5 можно модифицировать нуклеотидными заменами, например, от или в пределах 1, 2 или 3 до 10, 25, 59 или 100 замен. Полинуклеотид альтернативно или дополнительно можно модифицировать одной или несколькими инсерциями, и/или делециями, и/или удлинением любого или обоих концов. Модифицированный полинуклеотид, как правило, кодирует полипептид, который обладает β-глюканазной активностью. Можно произвести вырожденные замены и/или можно сделать замены, результатом которых при трансляции модифицированной последовательности могла бы быть консервативная замена аминокислоты, например, как обсуждается при обращении к полипептидам далее.

Гомологи

Нуклеотидная последовательность, которая способна избирательно гибридизоваться (например, комплементарная последовательность) с кодирующей последовательностью ДНК SEQ ID NO: 1, 3 или 5, может обладать 50% или 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности (или гомологией) с кодирующей последовательностью SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Это может иметь место на протяжении района, по меньшей мере, из 20, предпочтительно, по меньшей мере, из 30, например, по меньшей мере, из 40, по меньшей мере, из 60, более предпочтительно, по меньшей мере, из 100 следующих друг за другом нуклеотидов, или оптимально на протяжении полной длины SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Для SEQ ID NO: 1 идентичность последовательностей предпочтительно составляет, по меньшей мере, 75% или 80%, для SEQ ID NO: 3 предпочтительно, по меньшей мере, 85% и для SEQ ID NO: 5 предпочтительно, по меньшей мере, 85%.

Любую комбинацию указанных выше степеней гомологии и минимальных размеров можно использовать для того, чтобы определить полинуклеотиды согласно изобретению, при этом предпочтительны более жесткие комбинации (т.е. более высокая гомология при больших длинах участков). Таким образом, например, полинуклеотид, который, по меньшей мере, на 80% или 90% гомологичен на протяжении 25, предпочтительно на протяжении 30 нуклеотидов, составляет один аспект изобретения, как и полинуклеотид, который, по меньшей мере, гомологичен на 90% на протяжении 40 нуклеотидов.

Гомологи полинуклеотидных (или белковых) последовательностей обычно обладают, по меньшей мере, 70% гомологией, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 97% или 99% гомологией, например, на протяжении района, по меньшей мере, из 15, 20, 30, 100 и более следующих друг за другом нуклеотидов (или аминокислот). Гомологию можно рассчитать на основе идентичности аминокислот (иногда называемой "строгой гомологией").

Пакет программ UWGCG, например, предоставляет программу BESTFIT, которую можно использовать для расчета гомологии (например, используя ее при настройках по умолчанию⁵). Алгоритмы PILEUP и BLAST можно использовать для расчета гомологии или выравнивания последовательностей (а именно для идентификации эквивалента или соответствующих последовательностей, например при их настройках по умолчанию^6,7).

Компьютерная программа для выполнения BLAST-анализа находится в открытом доступе через National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Указанный алгоритм включает в себя сначала идентификацию пары последовательностей с высоким количеством очков (HSP) благодаря идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторому пороговому количеству положительных очков Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности базы данных. Т называют порогом количества очков для слов в определенной окрестности^6,7. Указанные исходные совпадения соседних слов в окрестности действуют как начало для инициации поисков, для того чтобы найти содержащие их HSP. Поиск совпадения слов продолжают в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное количество очков выравнивания можно увеличивать. Продолжение поиска совпадения слов в каждом направлении прекращают, когда: суммарное количество очков выравнивая уменьшается на количество Х по сравнению с его достигнутым максимальным значением; суммарное количество очков опускается до нуля или ниже, вследствие суммирования одного или нескольких отрицательно оцениваемых выравниваний остатков; или достигается конец какой-либо последовательности. Параметры W, T и Х алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLAST по умолчанию используется длина слов (W), равная 11, выравнивания в матрице подсчета очков BLOSUM 62⁸ (B) - 50, ожидание (Е) - 10, M=5, N=4 и сравнение обоих нитей.

Алгоритм BLAST выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями⁹. Одной из мер сходства, даваемых алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая является показанием вероятности, с которой случайно может иметь место совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, последовательность считается сходной с другой последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью примерно составляет меньше 1, предпочтительно примерно меньше 0,1, более предпочтительно примерно меньше 0,01 и наиболее предпочтительно примерно меньше 0,001.

Праймеры и зонды

Полинуклеотиды согласно изобретению включают и могут быть использованы в качестве праймера, например ПЦР-праймера, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, или полинуклеотиды можно клонировать в векторах. Такие праймеры, зонды или другие фрагменты будут иметь длину, по меньшей мере, равную или до 20, например, по меньшей мере, 25, 30 или 40 нуклеотидов. Как правило, они будут составлять в длину до 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 или 300 нуклеотидов, или даже до длины на нескольких нуклеотидов (как, например, 5 или 10 нуклеотидов) короче кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5.

В общем, праймеры будут получены синтетическими способами, включающими в себя поэтапную сборку требуемой последовательности нуклеиновой кислоты по одному нуклеотиду за один раз. Способы выполнения этого с использованием автоматизированных методов легкодоступны в данной области. Примеры праймеров согласно изобретению указаны в SEQ ID NO: 7 и 8.

Более длинные полинуклеотиды, как правило, будут получены с использованием рекомбинантных способов, например с использованием способов клонирования на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции). Этот способ будет включать в себя получение пары праймеров (например, длиной примерно 15-30 нуклеотидов) к району β-глюканазы, который необходимо клонировать, осуществление контакта праймеров с мРНК или кДНК, полученной из клетки-мишени (например, дрожжевой, бактериальной, растительной, прокариотической клетки или клетки гриба), предпочтительно штамма Talaromyces, выполнение полимеразной цепной реакции при условиях, которые вызывают амплификацию требуемого района, выделение амплифицированного фрагмента (например, очисткой реакционной смеси в агарозном геле) и извлечение амплифицированной ДНК. Праймеры можно сконструировать так, чтобы они содержали подходящие сайты узнавания ферментами рестрикции, с тем, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящем клонирующем векторе.

Такие способы можно использовать для того, чтобы получить всю или часть описанной здесь последовательности β-глюканазы. Геномные клоны, соответствующие кДНК SEQ ID NO: 1, 3 или 5, или гену β-глюканазы, содержащему, например, интроны и промоторные районы, также находятся в рамках изобретения и также могут быть получены аналогичными способами (например, рекомбинантными способами, ПЦР, способами клонирования), исходя из геномной ДНК клетки грибов, дрожжевой, бактериальной, растительной или прокариотической клетки.

Полинуклеотиды или праймеры могут нести обнаруживаемую метку, например, радиоактивную или нерадиоактивную метку. Подходящие метки включают радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵S, ферментные метки или другие белковые метки, такие как биотин. Такие метки можно присоединять к полинуклеотидам или праймерам согласно изобретению и можно выявлять, используя по существу известные способы.

Полинуклеотиды, меченые или немеченые, можно использовать в основанных на нуклеиновых кислотах тестах для выявления или секвенирования β-глюканазы или ее варианта в образце (например, образце гриба). Такие тесты для выявления, как правило, включают в себя осуществление контакта образца (например, образца гриба), (предположительно) содержащего ДНК, с зондом или праймером согласно изобретению в условиях гибридизации и выявление любого дуплекса, образованного между зондом и нуклеиновой кислотой в образце. Такое выявление можно осуществить, используя такие способы, как ПЦР, или посредством иммобилизации зонда на твердой подложке, удаления нуклеиновой кислоты в образце, которая не гибридизуется с зондом, и затем регистрацией нуклеиновой кислоты, которая гибридизовалась с зондом. Альтернативно нуклеиновую кислоту образца можно иммобилизовать на твердой подложке, и можно регистрировать количество зонда, связанного с такой подложкой.

Зонды согласно изобретению можно удобно упаковать в форме тест-набора в подходящей таре. В таких наборах зонд может быть связан с твердой подложкой, в тех случаях, когда форма анализа, для которого предназначен набор, требует такого связывания. Набор также может содержать подходящие реагенты для обработки образца, который необходимо исследовать, гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой в образце, реагенты для контроля, инструкции и тому подобное.

Предпочтительно полинуклеотид согласно изобретению получают из того же самого организма, что и полипептид, такого как гриб, в частности гриб рода Talaromyces.

Полинуклеотид согласно изобретению также включает варианты последовательности SEQ ID NO: 1, 3 или 5, которые обладают активностью β-глюканазы. Варианты могут быть образованы присоединениями, заменами и/или делециями, и могут обладать способностью расщеплять полимер β-D-глюкана.

Получение полинуклеотидов

Полинуклеотиды, которые не обладают 100% идентичностью с SEQ ID NO: 1, 3 или 5, но попадают в рамки изобретения, можно получить рядом способов. Такие варианты описанной здесь β-глюканазной последовательности можно получить, например, посредством зондирования библиотек геномных ДНК, полученных для ряда организмов, например, организмов, которые обсуждались как источники полипептидов согласно изобретению. Кроме того, можно получить другие гомологи β-глюканазы из грибов, растений или прокариот, и такие гомологи и их фрагменты, как правило, будут обладать способностью гибридизоваться с SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Такие последовательности можно получить зондированием библиотек кДНК или библиотек геномной ДНК других видов, и зондированием таких библиотек зондами, содержащими все или части SEQ ID NO: 1, 3 или 5 в условиях от средней до высокой жесткости (как описано ранее). Зонды на основе нуклеиновых кислот, содержащие все или части SEQ ID NO: 1, 3 или 5, можно использовать для исследования библиотек кДНК других видов, таких как виды, описанные в качестве источников полипептидов согласно изобретению.

Видовые гомологи также можно получить, используя вырожденную ПЦР, в которой будут использоваться праймеры, сконструированные к последовательностям-мишеням в пределах вариантов и гомологов, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности. Праймеры могут содержать одно или несколько вырожденных положений, и их будут использовать в условиях более низкой жесткости, чем условия, используемые для клонирования последовательностей с праймерами с единственной последовательностью против известных последовательностей.

Альтернативно, такие полинуклеотиды можно получить сайт-направленным мутагенезом β-глюканазных последовательностей или их вариантов. Это может быть полезным, например, в том случае, когда требуются молчащие замены кодонов в последовательностях, чтобы оптимизировать предпочтительность кодонов для конкретной клетки-хозяина, в которой полинуклеотидные последовательности экспрессируются. Другие изменения последовательностей могут требоваться для того, чтобы ввести сайты узнавания ферментами рестрикции, или для того, чтобы изменить свойство или функцию полипептидов, кодируемых полинуклеотидами.

Изобретение включает в себя двухцепочечные полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид согласно изобретению и комплементарную ему последовательность.

Данное изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды согласно изобретению, описанные ниже. Поскольку такие полинуклеотиды будут использоваться в качестве последовательностей для рекомбинантного получения полипептидов согласно изобретению, нет необходимости в том, чтобы они обладали способностью гибридизоваться с последовательностью SEQ ID NO: 1, 3 или 5, хотя, как правило, это будет желательным. В остальном такие полинуклеотиды при необходимости можно метить, использовать и получать, как описано выше.

В. Полипептиды

Данное изобретение относится к β-глюканазам (или целлюлазам) и их вариантам (например, очищенным (в значительной степени) и/или выделенным). Полипептиды согласно изобретению могут по существу состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 4 или 6, или варианта указанной последовательности. Полипептиды также могут кодироваться полинуклеотидом согласно изобретению, который описан выше.

Полинуклеотид согласно изобретению может быть в изолированной или в значительной степени очищенной форме. Следует понимать, что полипептид может быть смешан с носителями или разбавителями, которые не препятствуют достижению планируемой цели и/или функции полипептида, и, тем не менее, считаться по существу изолированным. Как правило, он будет включать в себя полипептид в препарате, в котором более 20%, например, более 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% или 99% по массе полипептида в препарате составляет полипептид согласно изобретению. Для очистки и/или синтеза белков согласно изобретению можно применять обычные способы¹. Для некоторых композиций (например, для нефармацевтических применений) количество присутствующего полипептида может быть небольшим, например от 0,01 до 10%, как, например, от 0,1 до 5%, или 2%, или даже от 0,2 до 1%.

Предпочтительно полипептид согласно изобретению получают из микроорганизма, который имеет ген, кодирующий фермент с активностью β-глюканазы (или целлюлазы). Более предпочтительно микроорганизм является грибом, или оптимально нитчатым грибом. Предпочтительными организмами являются организмы рода Talaromyces, такие как организмы вида Talaromyces emersonii.

Активность

Полипептид согласно изобретению может обладать одним или несколькими из следующих характеристик, а именно он:

(1) обладает β-глюканазной (или целлюлазной) активностью;

(2) имеет пределы оптимума рН от 3 до 6,5 или 7,0, такие как от 4 до 5,5 или 6,0, оптимально от 4,5 до 5,0;

(3) имеет оптимальную активность при температуре от 30 до 100°С, как, например, от 60 до 95°С, оптимально от 75 или 80 до 90°С. Предпочтительно оптимальная температура составляет, по меньшей мере, 75°С, как, например, по меньшей мере, 85°С.

(4) имеет молекулярную массу (дегликозилированная форма) от 20 до 60 кДа, предпочтительно от 20 до 25, от 35 до 45 или от 23 до 50 кДа, оптимально от 36 до 40 кДа или (гликозилированная форма) от 40 до 45 кДа.

(5) имеет изоэлектрическую точку от 3,0 до 3,6 или 5,0; от 3,8 до 4,5; от 4,5 до 5,0 или от 6,0 до 7,0; и/или

(6) обладает гидролитической активностью по отношению к β-глюкану злаковых или проявляет гидролитическую активность ниже рН 7,0.

Полипептид может обладать активностью ЕС.3.2.1.4 (или активностью эндоглюканазы). В общем, это может быть эндогидролиз 1,4-β-D-глюкозидной связи в целлюлозе. "Активность β-глюканазы" представляет собой способность расщеплять целлюлозу или полимер β-глюкана (например, которые обнаружены в растениях, например овсе и ячмене). Таким образом, активность обеспечивает расщепление между близлежащими концом глюкопиранозы и/или неконцевыми единицами. Предпочтительно расщепление происходит по месту связи [глюкоза(1-4), (1-3) или (1-6) глюкоза]. Полипептид предпочтительно может расщеплять в положении между двумя близлежащими единицами (например, незамещенной глюкозы). Таким образом, он может обладать эндоактивностью (т.е. являться эндоглюканазой). Полимерный субстрат может быть замещенным или незамещенным. Предпочтительно полипептид не будет обладать активностью ксиланазы.

Полипептид также может обладать активностью целлюлазы, то есть он активен по отношению к целлюлозе, или может расщеплять целлюлозу. Так как β-глюкан является компонентом целлюлозы, все глюканазы подпадают под более широкий термин целлюлазы. Поэтому полипептиды согласно данному изобретению являются целлюлазами, так как они относятся к подклассу глюканаз. Другими типами классов активности в пределах целлюлаз, отличными от эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4, как указано выше) являются экзоглюканаза/целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91), β-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21), эндо-1,6-глюканаза (ЕС 3.2.1.75), экзо-1,3-глюканаза (ЕС 3.2.1.58), маннаназа (ЕС 3.2.1.78) и эндогликоцерамидаза (ЕС 3.2.1.123). Считают, что некоторые полипептиды обладают одной, двумя или большим количеством указанных дополнительных активностей, на основании их структуры и последовательности при сравнении с известными ферментами и семейством гидролаз, к которому они относятся. Таким образом, в описании в случае соответствующего контекста активность глюканазы может означать активность целлюлазы. Список (целлюлазных) активностей полипептидов приведен далее в примере 11.

Предпочтительно полипептид относится к одному из семейств 5, 7 или 45 в соответствии с классификацией гидролаз гликозидов (CAZy). Полипептид может быть нуклеофилом/донором протонов glu/glu или asp/asp.

Варианты и гомологи

Полипептид согласно изобретению может содержать аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, 4 или 6, или в значительной степени гомологичную последовательность, или фрагмент любой последовательности, и может обладать активностью β-глюканазы. В общем, предпочтительна аминокислотная последовательность природного происхождения, показанная в SEQ ID NO: 2, 4 или 6.

В частности, полипептид согласно изобретению может включать в себя:

а. полипептидную последовательность SEQ ID NO: 2, 4 или 6;

b. ее вариант природного происхождения или видовой гомолог; или

с. белок с последовательностью, идентичной, по меньшей мере, на 70, по меньшей мере, на 80, по меньшей мере, на 90, по меньшей мере, на 95, по меньшей мере, на 98 или, по меньшей мере, на 99% с последовательностью по (а) или (b).

Вариант может быть вариантом природного происхождения, например, в клетках грибов, бактерий, дрожжей или растений, и который может функционировать в значительной степени сходным образом с белком SEQ ID NO: 2, 4 или 6, например, он обладает активностью β-глюканазы. Подобным образом, видовой гомолог белка будет эквивалентом белка, который имеет природное происхождение у другого вида и который может функционировать как фермент β-глюканаза. Варианты включают аллельные варианты либо из того же самого штамма, что и полипептид согласно изобретению, либо из другого штамма, но того же рода, или того же самого вида.

Вариант и видовые гомологи можно получить посредством следующих описанных здесь процедур получения полипептида SEQ ID NO: 2, 4 или 6, и проводя такие процедуры на подходящем источнике клеток, например, на клетке бактерий, дрожжей, грибов или растений. Также можно использовать зонд, который охарактеризован выше для того, что исследовать библиотеки, полученные из клеток дрожжей, бактерий, грибов или растений для того, чтобы получить клоны, содержащие варианты или видовые гомологи. Клоны можно обрабатывать обычными способами, чтобы создать полипептид согласно изобретению, который в таком случае можно получить по существу известными рекомбинантными или синтетическими способами.

Полипептид согласно изобретению предпочтительно обладает, по меньшей мере, 70% идентичностью последовательности с белком SEQ ID NO: 2, 4 или 6, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности при этом, например, на протяжении района, по меньшей мере, из 60, по меньшей мере, из 100, 150, 200 или 300 следующих друг за другом аминокислот, или на протяжении всей длины SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В случае SEQ ID NO: 2 идентичность последовательностей предпочтительно составляет, по меньшей мере, 70%, в случае SEQ ID NO: 4, по меньшей мере, 60% и в случае SEQ ID NO: 6, по меньшей мере, 65%.

Таким образом, последовательность полипептида SEQ ID NO: 2, 4 или 6 и вариантов и видовых гомологов можно модифицировать, чтобы получить полипептиды согласно изобретению. Можно осуществить замены аминокислот, например, от или на уровне 1, 2, или 3 до 10, 20, 30, 50 или 100 замен. Также можно сделать такое же количество делеций и инсерций. Указанные изменения можно произвести вне районов, необходимых для функционирования полипептида, и поэтому в результате можно получить еще активный фермент. Модифицированный полипептид, как правило, сохраняет активность как β-глюканаза.

Полипептиды согласно изобретению включают фрагменты вышеупомянутых полипептидов полной длины и их вариантов, включая фрагменты последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. Такие фрагменты обычно сохраняют активность β-глюканазы. Фрагменты могут составлять в длину, по меньшей мере, 50, 100, 150, 200 ил 250 аминокислот, или могут быть на это количество аминокислот короче последовательности полной длины (которая указана в SEQ ID NO: 2, 4 или 6).

Полипептиды согласно изобретению при необходимости можно получить синтетическими способами, хотя, обычно их будут получать рекомбинантным способом, как описано ниже. Полипептиды можно модифицировать, например, присоединением остатков гистидина или Т7-метки, чтобы способствовать их идентификации и очистке, или присоединением сигнальной последовательности для активации их секреции из клетки.

Термин "варианты" относится к полипептидам, которые имеют такой же существенный признак или основные функциональные возможности, как и β-глюканаза (или целлюлаза), и включает в себя аллельные варианты. Существенным признаком β-глюканазы является то, что она представляет собой фермент, который проявляет активность ЕС 3.2.1.4, или то, что она расщепляет 1→3, 1→4 и/или 1→6 связи в β-D-глюкане, таком как (β)-глюкан зерновых или овсяной полбы. Предпочтительно вариант полипептида обладает такой же активностью, как β-глюканаза. Полипептид, имеющий такой же существенный признак, как и β-глюканза, можно идентифицировать, используя анализ расщепления целлюлозы или β-глюкана, например как описано далее.

Варианты SEQ ID NO: 2, 4 или 6 также включают последовательности, которые отличаются от SEQ ID NO: 2, 4 или 6, но которые не обязательно получены из белка β-глюканазы природного происхождения. Указанные варианты можно описать, как последовательности, имеющие некоторый % гомологии с SEQ ID NO: 2, 4 или 6, или имеющие ряд замен в пределах этой последовательности. Альтернативно вариант может кодироваться полинуклеотидом, который гибридизуется с SEQ ID NO: 1, 3 или 5.

Варианты можно определить подобно определению вариантов SEQ ID NO: 1, 3 или 5. Таким образом, варианты могут включать в себя вариантные последовательности, полученные из других штаммов Talaromyces. Другие варианты из других штаммов Talaromyces можно идентифицировать при исследовании β-D-глюканазной активности и клонировании и секвенировании, как указано ранее. Варианты могут включать в себя делецию, модификацию или присоединение отдельных аминокислот или групп аминокислот в последовательности белка при условии, что пептид сохраняет основные выполняемые функции β-глюканазы.

Консервативные замены можно сделать, например, в соответст