Пассивная иммунизационная терапия на основе пептидов для лечения атеросклероза

Пассивная иммунизационная терапия на основе пептидов для лечения атеросклероза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым изолированным антителам человека против пептидов, являющихся производными аполипопротеина B, в особенности к антителам, используемым для иммунизационной терапии для лечения атеросклероза, к способу их получения и к способу пассивной иммунизации с использованием упомянутых антител.

В частности, настоящее изобретение включает в себя применение любого изолированного антитела против окисленной формы пептидов, перечисленных в таблице 1, в особенности MDA-модифицированных пептидов, преимущественно вместе с подходящим носителем и вспомогательным средством, в качестве иммунотерапии или «анти-атеросклеротической «вакцины» для профилактики и лечения ишемических сердечно-сосудистых заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Защитный эффект гуморального иммунитета, как известно, опосредован семейством структурно связанных гликопротеинов, именуемых антителами. Биологическая активность антител инициируется при связывании последних с антигенами. Антитело, связанное с антигеном, является в общем специфичным для одного антигена, и связывание, как правило, является высокоаффинным. Антитела вырабатываются B-лимфоцитами. Кровь содержит много различных антител, причем каждое происходит из клона B-клеток и каждое имеет различную структуру и специфичность в отношении антигена. Антитела находятся на поверхности B-лимфоцитов, в плазме, во внутритканевой жидкости и в секреторных жидкостях, таких как слюна и слизь на поверхности слизистых оболочек.

Все антитела являются сходными по своей общей структуре с учетом определенного сходства в физико-химических свойствах, таких как заряд и растворимость. Все антитела имеют общую структуру ядра, включающую две идентичные легкие цепи около 24 килодальтон каждая, и две идентичные тяжелые цепи, приблизительно 55-70 килодальтон каждая. К каждой из тяжелых цепей присоединена одна легкая цепь, причем две тяжелые цепи соединены друг с другом. Как легкие, так и тяжелые цепи содержат последовательность повторяющихся гомологических единиц, каждая длиной приблизительно в 110 аминокислотных остатков, которые свернуты непосредственно в обычный глобулярный фрагмент, именуемый иммуноглобулиновым (Ig) доменом. Область антитела, сформированная объединением двух тяжелых цепей, является гидрофобной. Как известно, антитела, в особенности моноклональные антитела, в случае когда они подвергаются неблагоприятным физическим или химическим условиям, расщепляются в области, в которой легкая цепь присоединяется к тяжелой цепи. Поскольку антитела содержат многочисленные остатки цистеина, в них имеется большое количество цистеин-цистеиновых дисульфидных связей. Все Ig домены содержат два слоя бета-складок с тремя или четырьмя нитями антипараллельных полипептидных цепей.

Вопреки сходству их общей структуры молекулы антител могут быть подразделены на небольшое количество различных классов и подклассов на основании физико-химических характеристик, таких как размер, заряд и растворимость, а также на основании их поведения в отношении связывания с антигенами. У человека классами молекул антител являются: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. О членах каждого класса говорят, что они принадлежат к одному и тому же изотипу. Изотипы IgA и IgG далее подразделяются на субтипы, называемые IgA1, IgA2, а также IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелые цепи всех антител данного изотипа содержат обширные области с идентичными последовательностями аминокислот, но упомянутые области отличаются у антител, принадлежащих к другим изотипам и субтипам. Тяжелые цепи обозначаются буквами греческого алфавита в соответствии с общим изотипом антитела, т.е. IgA содержит альфа, IgD содержит дельта, IgE содержит эпсилон, IgG содержит гамма и IgM содержит мю тяжелые цепи. IgG, IgE и IgD существуют в виде мономеров, тогда как секретированные формы IgA и IgM являются соответственно димерами или пентамерами, стабилизированными J цепью. Некоторые молекулы IgA существуют в виде мономеров или тримеров.

У каждого индивидуума существует от 10⁸ до 10¹⁰ структурно различных молекул антител, каждая с уникальной последовательностью аминокислот в области связывания с антигеном. Разнообразие последовательностей в антителах найдено преимущественно в трех коротких участках внутри аминоконцевых доменов тяжелых и легких цепей, причем такие участки называют вариабельными (V) областями, чтобы отличать их от более консервативных константных (C) областей.

Атеросклероз представляет собой хроническое заболевание, которое вызывает утолщение внутренних слоев (внутренней оболочки) больших и средних артерий. Атеросклероз снижает кровоток и может вызвать ишемию и разрушение тканей в органах, снабжаемых сосудами, которые подверглись заболеванию. Атеросклероз является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, инсульт и болезни периферических артерий. Он является основной причиной смертности в западном мире и, как предсказывают, в течение двух десятилетий станет ведущей причиной смертности во всем мире.

Заболевание инициируется накоплением липопротеинов, в первую очередь липопротеинов низкой плотности (LDL), во внеклеточном матриксе сосудов. Эти частицы LDL агрегируются и подвергаются окислительной модификации. Окисленный LDL является токсичным и вызывает повреждение сосудов. Атеросклероз представляет собой во многих отношениях ответную реакцию на это повреждение, включающую воспаление и фиброзы.

В 1989 году Palinski и сотрудники идентифицировали у человека циркулирующие аутоантитела против окисленного LDL. Это наблюдение навело на мысль, что атеросклероз, возможно, является аутоиммунным заболеванием, вызванным иммунными реакциями против окисленных липопротеинов. В это время несколько лабораторий начали поиски взаимосвязей между титрами антител против окисленного LDL и сердечно-сосудистыми заболеваниями. Однако картина, которая возникла из этих исследований, была далека от ясности. Существовали антитела против большого количества различных эпитопов окисленного LDL, но структура этих эпитопов была неизвестна. Следовательно, термином «антитела окисленного LDL» именовали скорее неизвестную смесь различных антител, чем одно специфическое антитело. Независимые T-клеточные IgM-антитела встречались более часто, чем зависимые T-клеточные IgG-антитела.

Антитела против окисленного LDL имелись в наличии как у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, так и у здоровых людей из контрольной группы. Хотя в некоторых ранних исследованиях сообщалось о взаимосвязи между титрами антител окисленного LDL и сердечно-сосудистыми заболеваниями, в других такой взаимосвязи не было обнаружено. Основной слабой стороной этих исследований являлось то, что с целью определения титров антител применяли тесты ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- Твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием частицы окисленного LDL в качестве лиганда. Состав LDL различен у различных индивидуумов, степень окислительной модификации трудно как регулировать, так и оценивать, и уровни антител против различных эпитопов в окисленных частицах LDL не могут быть определены. До некоторой степени из-за технических проблем было сложно оценить роль реакции антител против окисленного LDL, используя методики, доступные до сих пор, однако невозможно создать четко определенные и воспроизводимые компоненты вакцины, если будут использоваться целые частицы окисленного LDL.

Другой путь исследовать возможность того, что аутоиммунные реакции против окисленного LDL в стенках сосудов играют ключевую роль в развитии атеросклероза, состоит в том, чтобы иммунизировать животных против их собственного окисленного LDL. Идея, стоящая за этим подходом, заключается в том, что если аутоиммунные реакции против окисленного LDL усиливаются при использовании классического способа иммунизации, то это будет приводить к повышенному воспалению сосудов и прогрессированию атеросклероза. Для того чтобы проверить эту гипотезу, кроликов иммунизировали с помощью гомологов окисленного LDL и затем вызывали атеросклероз путем содержания животных на высокохолестериновом рационе в течение 3 месяцев.

Однако в противоположность исходной гипотезе иммунизация с помощью окисленной LDL имела защитный эффект уменьшения атеросклероза примерно в 50% случаев. Сходные результаты были также получены в последующих исследованиях, в которых высокохолестериновый рацион был объединен с повреждением сосудов шариками, чтобы вызвать более агрессивное образование бляшек. Параллельно с нашими исследованиями несколько других лабораторий сообщили об аналогичных наблюдениях. Доступные данные, взятые вместе, ясно демонстрируют, что существуют иммунные реакции, которые защищают от развития атеросклероза, причем они включают аутоиммунную реакцию против окисленного LDL.

Данные наблюдения приводят к мысли о возможности развития иммунной терапии или «вакцины» для лечения сердечно-сосудистых заболеваний человека, основанных на атеросклерозе. Один подход к этому мог бы заключаться в том, чтобы иммунизировать индивида его собственным LDL, после того как данный LDL был окислен под действием, например, меди. Однако данный подход осложняется тем фактом, что неизвестно, какая структура в окисленном LDL является ответственной за формирование защитного иммунитета и, если окисленный LDL также может содержать эпитопы, они могут давать прирост неблагоприятных иммунных реакций.

Идентификация эпитопов в окисленном LDL является важной с нескольких точек зрения.

Во-первых, один или несколько из этих эпитопов, вероятно, являются ответственными за активацию антиатерогенного иммунного отклика, наблюдаемого у животных, иммунизированных окисленным LDL. Пептиды, содержащие эти эпитопы, могут, следовательно, предоставлять возможность для развития иммунной терапии или «атеросклеротической вакцины» у человека. Дополнительно они могут быть использованы для терапевтического лечения атеросклероза, развившегося у человека.

Во-вторых, пептиды, содержащие идентифицированные эпитопы, могут быть использованы для того, чтобы развить способность ELISA определять антитела против определенных структур в окисленном LDL. Такой ELISA мог бы быть более точным и надежным, чем доступный в настоящее время, использующий частицы окисленного LDL в качестве антигена. Это сделало бы также возможным анализы иммунных ответов против различных эпитопов в окисленной LDL, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Патент Соединенных Штатов 5972890 относится к использованию пептидов для диагностики атеросклероза. Способ, представленный в вышеупомянутом патенте, в принципе является формой радиофизической диагностики. В пептидную последовательность вводят радиоактивную метку и вводят последовательность в кровоток. Если данная пептидная последовательность будет идентична последовательности, присутствующей в аполипопротеине B, то она свяжется с тканью, где имеются в наличии рецепторы, действительные для аполипопротеина B. Эта ткань имеется в наличии в сосудах над всеми атеросклеротическими бляшками. Концентрация радиоактивности на стенках сосудов может затем быть определена, например, с помощью гамма-камеры. Следовательно, способ представляет собой радиофизический способ диагностики, основанный на том, что пептидные последовательности, меченные радиоактивностью, будут связываться с соответствующими им рецепторами, имеющимися в наличии в атеросклеротических бляшках, и будут обнаруживаться при использовании анализа внешней радиоактивности. Описываемая техника является способом непосредственного анализа для идентифицикации атеросклеротических бляшек. Это требует того, чтобы пациенту давались радиоактивные соединения.

Опубликованные исследования (Palinski et al., 1995 и George et al., 1998) показали, что иммунизация против окисленного LDL ослабляет развитие атеросклероза. Это показывает, что иммунные реакции против окисленного LDL в целом обладают защитным влиянием. Однако результаты, приведенные здесь, неожиданно показали, что это не всегда так. Например, иммунизация с использованием пептидов # 10, 45, 154, 199 и 240 давала повышение ослабления развития атеросклероза. Иммунизация с использованием других пептидных последовательностей, например пептидных последовательностей #1 и 30-34, не обеспечивала общего влияния на развитие атеросклероза. Такие результаты являются неожиданными, поскольку они служат обоснованием того факта, что иммунные реакции против окисленного LDL в зависимости от того, на какую структуру в окисленном LDL они ориентированы, могут и защищать от развития атеросклероза, и вносить вклад в его развитие, и не иметь вообще никакого влияния. Данные открытия делают возможным развить способы иммунизации, которые выделяют активацию защитных иммунных реакций. Дополнительно они показывают, что иммунизация с использованием неповрежденного окисленного LDL могла бы иметь вредное влияние, если используемые частицы имеют высокое содержание структур, которые дают рост атерогенных иммунных реакций.

Методология настоящего изобретения основана на полностью отличных принципах и способах. В соответствии с п.1 формулы изобретения данное изобретение относится к антителам против окисленных фрагментов аполипопротеина B, причем данные антитела используют для иммунизации против сердечно-сосудистых заболеваний.

В качестве альтернативы активной иммунизации, использующей описанные выше идентифицированные пептиды, пассивная иммунизация предварительно сформированными антителами, направленными на те же пептиды, является привлекательной возможностью. Таким антителам могут быть приданы желаемые свойства, относящиеся, например, к специфичности и перекрестной реактивности, изотипу, аффинности и времени полужизни плазмы. Возможность разработать антитела с предварительно заданными свойствами стала ясной уже появлением технологии моноклонального антитела (Milstein and Kühler, 1975 Nature, 256:495-7). Эта технология использовала клетки мышиной гибридомы, производящие большие количества идентичных, но мышиных антител. Фактически было начато большое количество доклинических и также клинических испытаний с использованием мышиных моноклональных антител для лечения, например, раковых опухолей. Однако из-за того, что эти антитела были нечеловеческого происхождения, иммунная система пациентов распознавала их в качестве чужеродных и вырабатывала к ним антитела. Вследствие этого действенность и время полужизни плазмы мышиных антител оказывались сниженными, и часто посторонние эффекты аллергических реакций, вызванных чужеродными антителами, препятствовали успешному лечению.

Для решения этих проблем, чтобы понизить мышиную составляющую специфичных и потенциально терапевтических антител, было принято несколько подходов. Первый подход включал в себя технологию изготовления так называемых химерных антител, в которых мышиные вариабельные домены антител переносились на человеческие константные области, что приводило к образованию антител, которые были в основном человеческими (Neuberger et al., 1985, Nature 314:268-70). Дальнейшее усовершенствование этого подхода заключалось в разработке гуманизированных антител, в которых области мышиных антител, контактирующие с антигеном, так называемые области, определяющие комплементарность(CDR), переносились на каркас человеческого антитела. Такие антитела являются почти полностью человеческими и редко вызывают вредные иммунные ответы при введении пациентам. Несколько химерных или гуманизированных антител было зарегистрировано в качестве терапевтических лекарственных препаратов, и в настоящее время они широко используются при различных показаниях (Borrebaeck и Carlsson, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 1:404-408).

В настоящее время полностью человеческие антитела могут быть изготовлены с использованием рекомбинантных технологий. Как правило, используют большие библиотеки, включающие миллиарды различных антител. В противоположность предшествующим технологиям, использующим химеризацию и гуманизирование, например, мышиных антител, данная технология не основывается на иммунизации животных для того, чтобы произвести специфические антитела. Вместо того, чтобы рекомбинантные библиотеки включали огромное число вариантов предварительно полученных антител, более вероятно, что библиотека будет иметь по меньшей мере одно антитело, специфичное для любого антигена. Следовательно, при использовании такой библиотеки проблема заключается в том, чтобы найти определенную связку, уже существующую в библиотеке, а не генерировать ее с помощью иммунизации. Для того чтобы эффективным образом найти хорошую связку в библиотеке, были разработаны различные системы, в которых фенотипы, т.е. антитела или фрагменты антител, связаны с их генотипами, т.е. кодирующими генами. Наиболее распространенной из таких систем является так называемая система фагового дисплея, в которой фрагменты отображаемых антител экспрессируются в виде объединения с покровными белками фагов на поверхности нитевидных фаговых частиц при одновременном перенесении генетической информации, кодирующей отображаемую молекулу (McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554). Отображенные на фагах фрагменты антител, специфичные в отношении индивидуального антигена, могут быть отобраны путем связывания с антигеном, о котором идет речь. Изолированный фаг затем может быть амплифицирован, и ген, кодирующий выбранные вариабельные области антитела, может быть необязательно переведен в форматы другого антитела, как, например, полноразмерного иммуноглобулина, и выделен в большом количестве при использовании подходящих векторов и клеток-хозяев, хорошо известных в технике.

Формат специфичности антитела, отображенного на фаговых частицах, может различаться. Наиболее широко используемыми форматами являются Fab (Griffiths et al., 1994. EMBO J. 13:3245-3260) и одиночной цепи (scFv) (Hoogenboom et al., 1992, J Mol Biol. 227:381-388), причем оба содержат вариабельное антигенное связывание областей антител. Формат одиночной цепи состоит из вариабельного тяжелого домена (VH), связанного с вариабельным легким доменом (VL) через гибкий линкер (US 4946778). Перед использованием аналитических реагентов или терапевтических средств отображенную специфичность антитела переводят в растворимый формат, например Fab или scFv, и анализируют как таковую. На более поздних стадиях фрагмент антитела, идентифицированный на наличие желаемых характеристик, уже может быть переведен в другие форматы, такие как полноразмерные антитела.

В последнее время была представлена новая технология для генерирования вариабельности в библиотеках антител (WO98/32845, Soderlind et al., 2000, Nature BioTechnol.18:852-856). Все фрагменты антител, полученных из этой библиотеки, имеют одну и ту же каркасную область и различаются только в CDR. Поскольку каркасные области являются областями эмбриональной последовательности, иммуногенность антител, полученных из библиотеки или сходных библиотек, произведенных с использованием той же самой технологии, как ожидается, будет очень низкой (Soderlind et al., 2000, Nature BioTechnol. 18:852-856). Это свойство, как ожидают, будет очень ценным для терапевтических антител, снижающих для пациента риск формирования антител к введенным антителам, и, таким образом, снижающее риски аллергических реакций, появления блокирующих антител и допускающее длительное время полужизни плазмы антитела. Несколько антител, полученных из рекомбинантных библиотек, в настоящее время доступны в клиниках и, как ожидается, в недалеком будущем обеспечат терапевтические лекарственные препараты.

Таким образом, техника перешла от ранних технологий на основе гибридомы к использованию современной технологии рекомбинантных библиотек, столкнувшись с необходимостью разработки терапевтических антител для использования человеком (Soderlind et al., 2001, Comb.Chem. & High Throughput Screen.4:409-416). Было понято, что идентифицированные пептиды (PCT/SE02/00679), являющиеся составной частью настоящего изобретения, могут быть использованы в качестве антигенов для выработки полностью человеческих антител с предопределенными свойствами. В противоположность более ранней технике (US 6225070), антигенные структуры, т.е. пептиды, используемые в настоящем изобретении, были идентифицированы как особенно подходящие в качестве целевых последовательностей для терапевтических антител (PCT/SE02/00679). Кроме этого, в настоящем изобретении антитела получают из библиотеки антител, при этом исключается необходимость иммунизации липопротеин-дефицитной мыши для выращивания мышиных антител (US 6225070). Более того, итоговые антитела являются полностью человеческими, и не ожидается, что они вызовут любую нежелательную иммунологическую реакцию при введении пациенту.

Использованными и ранее идентифицированными (PCT/SE02/00679) являются следующие пептиды:

ТАБЛИЦА 1

A. Высокий IgG, различие MDA

P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG

P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL

P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS

B. Высокий IgM, нет различия MDA

P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK

P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK

P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK

P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE

P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK

P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK

P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE

P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP

C. Высокий IgG, нет различия MDA

P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY

P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH

D. NHS/AHP, IgG-ak>2, различие MDA

P1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK

P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK

P 148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV

P 162. IREVTQRLNGEIQALELPQK

P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE

E. NHS/AHP, IgM-ak>2, различие MDA

P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM

P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE

P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ

P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK

P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA

P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE

P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ

P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN

P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ

P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ

P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ

F. NHS/AHP, IgG-ak<0,5, нет различия MDA

P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV

P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK

P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF

P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH

P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF

P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI

P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR

или активные области одного или более чем одного из указанных пептидов.

В приведенной выше таблице 1 пунктам A-F соответствует следующее:

(A) Фрагменты, которые вырабатывают высокие уровни антител IgG к MDA-модифицированным пептидам (n=3),

(B) Фрагменты, которые вырабатывают высокие уровни антител IgM, однако не существует различия между исходным и MDA-модифицированным пептидами (n=9),

(C) Фрагменты, которые вырабатывают высокие уровни антител IgG, однако не существует различия между исходными и MDA-модифицированными пептидами (n=2),

(D) Фрагменты, которые вырабатывают высокие уровни антител IgG к MDA-модифицированным пептидам и по меньшей мере вдвое больше антител NHP-пула по сравнению с AHP-пулом (n=5)

(E) Фрагменты, которые вырабатывают высокие уровни антител IgM к MDA-модифицированным пептидам и по меньшей мере вдвое больше антител NHP-пула по сравнению с AHP-пулом (n=11) и

(F) Фрагменты, которые вырабатывают высокий уровень антител IgG, однако не существует различия между исходным и MDA-модифицированным пептидами, но по меньшей мере вдвое больше антител AHP-пула по сравнению с NHP-пулом (n=7).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного изолированного антитела или фрагмента антитела человека, которое направлено по меньшей мере на один окисленный фрагмент аполипопротеина B, в производстве фармацевтических композиций для терапевтического или профилактического лечения атеросклероза посредством пассивной иммунизации.

Далее настоящее изобретение относится к рекомбинантному получению таких антител, равно как и к способу пассивной иммунизации с использованием подобных антител, выращенных с использованием фрагмента окисленного аполипопротеина B в качестве антигена, в особенности фрагментов, идентифицированных выше.

В настоящем изобретении использована библиотека фрагментов изолированных антител для выработки специфических фрагментов антител человека против окисленных, в особенности MDA-модифицированных пептидов, полученных из апо-B100. Идентифицированные фрагменты антител с желаемыми характеристиками затем могут быть встроены в полноразмерный иммуноглобулин человека для использования в терапевтических целях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее последует подробное описание изобретения, примером которого являются, не ограничивая его, антитела человека, полученные из библиотеки фрагментов изолированных антител и направленные на два MDA-модифицированных пептида из апо-B100.

Пример 1

Отбор scFv против MDA-модифицированных пептидов IEIGL EGKGF EPTLE ALFGK (P45 таблица 1) и KTTKQ SFDLS VKAQY KKNKH(P210, таблица 1).

Антигены-мишени подвергают химической модификации, чтобы остатки лизина и гистидина несли на себе малондиальдегидные (MDA) группы. Модифицированные пептиды обозначены IEI (P45) и KTT(P210).

Отборы выполняют с использованием библиотеки BioInvent n-CoDeR^TMscFv, принципы построения и создания которой были описаны Soderlind et al. 2000, Nature BioTechnology. 18,852-856. Вкратце, CDR изолируют из генов иммуноглобулина человека и включают в стационарный каркас. Следовательно, вариабельность в вариабельных областях образовавшегося иммуноглобулина представляет собой последовательность рекомбинации всех шести CDR в стационарный каркас. Области каркаса полностью являются областями эмбриональной последовательности, и они идентичны во всех антителах. Следовательно, вариабельность ограничена CDR, который является полностью натуральным, причем человеческого происхождения. Библиотека содержит приблизительно 2·10¹⁰ независимых клонов, и 2000-кратный избыток клонов, которые используют в качестве исходных для каждого отбора. Отборы выполняют в три тура. В 1-ом туре отбора иммунологические пробирки (NUNC maxisorb 444202) покрывают 1,2 мл раствора 20 мкг/мл MDA-модифицированного пептида-мишени в PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,4 мМ KH₂PO₄) и энергично встряхивают при +4°C в течение ночи. Затем пробирки блокируют 5% TPBSB (5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,02% азид натрия в PBS) в течение 30 минут и перед использованием дважды промывают 3% TPBSB (3% BSA, 0,05% Tween 20, 0,02% азид натрия в PBS). Затем каждую целевую пробирку инкубируют с приблизительно 2·10¹³ CFU фагами из библиотеки n-CodeR^TM в 1,8 мл 3% TPBSB в течение 2 часов при комнатной температуре, используя энергичное встряхивание. Затем пробирки промывают 15×3 мл 3% TPBSB и 2×1 мл PBS, перед тем как связанные фаги элюируют с помощью 1 мл/пробирка 2 мг/мл трипсина (Roche, 109819) в течение 30 минут при комнатной температуре. Данная процедура использует преимущество специфической трипсиновой области в scFv-слитом белке для того, чтобы высвобождать фаг из мишени. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл Aprotein (0,2 мг/мл, Roche, cat. 236624) и иммунологические пробирки промывают 300 мкл PBS, получая конечный объем 1,4 мл.

Для амплификации отобранного фага E.Coli HB101F' клетки экспоненциально выращивают в 10 мл среды LB (Merck, cat. 1.10285) до OD₆₀₀ = 0,5 и инфицируют отобранными и элюированными фагами в основном, как описано (Soderlind et al., 2000, Nature BioTechnol. 18, 852-856). Итоговую кондиционированную среду фага затем осаждают добавлением 1/4 объема 20% PEG₆₀₀₀ в 2,5 M NaCl и инкубируют в течение 5 часов при +4°C. Затем фаги осаждают центрифугированием в течение 30 минут, 13 000g, повторно суспендируют в 500 мкл PBS и используют во втором туре отбора.

Амплифицированный штамм фагов используют во втором туре отбора в окончательном объеме 1,5 мл 5% BSA, 0,05% Tween 20, 0,02 % азида натрия в PBS. Также вводят не модифицированный MDA пептид (4·10^-7 моль) для конкуренции против связывающих компонентов к немодифицированному целевому пептиду. Смесь инкубируют в иммунологических пробирках, приготовленных с антигеном, как описано выше, за исключением того, что пробирки блокируют 1% казеином вместо 3% TPBSB. Инкубирование и промывание иммунологических пробирок производят аналогично описанному выше для отбора 1. Связанные фаги затем элюируют в течение 30 минут, используя 600 мкл 100 мМ трис-глицинового буфера с pH 2,2. Пробирки дополнительно промывают 200 мкл глицинового буфера, элюаты объединяют и затем нейтрализуют 96 мкл 1М Tris-HCl с pH 8,0. Образцы ренатурируют в течение 1 часа при комнатной температуре и используют для 3 тура отбора.

Для третьего тура отбора BSA Tween 20 и азид натрия добавляют к ренатурированному фаговому пулу до итоговой концентрации 3%, 0,05% и 0,02% соответственно. Конкурирующие пептиды, т.е. MDA-модифицированные несвязанные пептиды и исходные пептиды-мишени без модификации, добавляют до концентрации 1·10^-7 M. Смесь фагов (1100 мкл) добавляют в иммунологические пробирки, покрытые антигеном-мишенью, как описано в отборе 1, и инкубируют при 4°C в течение ночи при встряхивании. Затем пробирки промывают 3×3 мл 3% TPBSB, 5×3 мл PBS и в конечном счете связанные фаги элюируют, используя трипсин, как описано выше в туре отбора 1. Все элюаты инфицируют 10 мл логарифмически растущего HB101F' в LB, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, 15 мкг/мл тетрациклина, 0,1% глюкозы, и выращивают в течение ночи при 30°C, 200 об/мин в вибрационном инкубаторе.

Инкубированные в течение ночи культуры используют для маломасштабного синтеза плазмидной ДНК, применяя Biorad mini prep Kit (Cat. 732 6100). Для того чтобы удалить часть фагового гена III из вектора экспрессии, 0,25 мкг плазмида ДНК разрезают в течение 2 часов при 37°C, используя 2,5 ед Eag-1 (New England Biolabs, cat. R050) в буфере, рекомендованном поставщиком. Затем образцы инактивируют в течение 20 минут при 65°C и лигируют в течение ночи при 16°C, используя 1 ед T4 ДНК лигазы в 30 мкл 1х буфера лигазы (Gibco/BRL). Эта процедура соединяет два Eag-1 участка, размещенных на противоположных сторонах фрагмента фагового гена III, создавая, таким образом, свободный scFv, отображающий концевую 6×his метку. После лигирования препараты обрабатывают в течение 2 часов при 37°C в растворе, содержащем 30 мкл лигирующей смеси, 3,6 мкл 10×REACT3 штамма, 0,4 мкл 1 M NaCl, 5 мкл H₂O_2, для того, чтобы разрушить клоны, в которых сегмент фагового гена III был религирован. Двадцать (20) нг конечного продукта трансформируют в химическую компоненту Top10F' и распределяют на 500 см² Q-ячейки LA-планшетов (100 мкг/мл Amp, 1% глюкоза), чтобы сделать возможным сортировку отдельных колоний для дальнейшего скрининга.

Скрининг библиотеки n-CoDeR^TMscFv для связывания фрагментов специфичных антител с MDA-модифицированными пептидами из аполипопротеина B-100.

Для того чтобы идентифицировать scFv, который мог бы осуществлять различие между MDA-модифицированным пептидом IEI (P45) и исходным IEI, а также между MDA-модифицированным пептидом KTT (P210) и исходным KTT соответственно, выполняют скрининги на бактериальных супернатантах из отобранных scFv экспрессирующих клонов.

Отбор колоний одиночных клонов, экспрессию scFv и скрининг номер 1 выполняют на автоматической системе BioInvent в соответствии со стандартными методиками. 1088 и 831 одиночные клоны, отобранные против MDA-модифицированных пептидов IEI и KTT соответственно, выбирают, культивируют и переносят в микротитровальные планшеты в среду 100 мкл LB, содержащую 100 мкг ампициллина/мл.

Для скрининга номер 1 белые аналитические планшеты (Greiner 655074) покрывают 54 пмоль пептида/лунку в покрывающем буфере (0,1 M карбонат натрия, pH 9,5), причем либо MDA-модифицированным пептидом, который служит в качестве положительной мишени, либо соответствующим немодифицированным пептидом, который служит в качестве нецелевого. Экспрессированный scFv определяют методом ELISA с помощью микологической метки, помещенной C-терминально по отношению к scFv, используя 1 мкг/мл моноклонального антитела против c-myc (9E10 Roche 1667 149) в промывочном буфере. В качестве вторичного антитела используют конъюгат козьего антитела против мышиной щелочной фосфатазы (Applied Biosystems Cat# AC32ML) при 25 000-кратном разбавлении. Для люминесцентного определения используют готовый к употреблению стандартный препарат CDP-Star с Emerald II Tropix (Applied Biosystems Cat#MS100RY) в соответствии с рекомендациями поставщика.

Клоны scFv, которые связывают MDA-модифицированный пептид, но не исходный пептид, реэкспрессируют, как описано выше, и подвергают скринингу еще раз в люминесцентном ELISA (Таблица 2 и фиг.1). Тесты выполняют как в отношении непосредственно покрытых пептидов (108 пмоль/лунку, покрытых PBS), так и в отношении более физиологической мишени, причем в качестве мишени используют частицы LDL (1 мкг/лунку, покрытые в PBS + 1 мМ EDTA), содержащие белок апо-B100 с MDA-модификацией или без нее. Положительными клонами являются те, которые связывают окисленный LDL и MDA-модифицированный пептид, но не исходные LDL или пептид. ELISA выполняют, как описано выше, за исключением того, что в качестве антитела детектирования используют anti-His антитела (MaB050 RαD). Как было найдено, двенадцать клонов IEI и 2 клона KTT дают более чем трехкратное увеличение люминесцентного сигнала при 700 нм для MDA-модифицированной формы по отношению к исходной форме как для пептида, так и для LDL.

Идентифицированные клоны в дальнейшем тестируют титрованием относительно фиксированного количества (1 мкг/лунка) MDA-модифицированного LDL и исходного LDL, с тем, чтобы оценить эффект дозы scFv (фиг.2).

ТАБЛИЦА 2.Результаты скрининга. Количество клонов, протестированных на каждой стадии скрининга для каждой мишени. Отмеченные успешные результаты в процентах показаны в скобках.
		Мишень
		IEI	KTT
Скрининг номер 1	Тестированные клоны	1088	831
Отмеченные успешные результаты (%)	64 (5,9%)	33(4,0%)
Скрининг номер 2	Тестированные клоны	64	33
Отмеченные успешные результаты (%)	12 (1,1%)	2 (0,2%)
Эффект дозы	Тестированные клоны	12	2
Отмеченные успешные результаты (%)	8 (0,7%)	2 (0,2%)

Определяют последовательность выбранных клонов scFv, с тем чтобы найти уникальные клоны. Выполняют бактериальный PCR (Polymerase Chain Reaction - Тест с полимеразным усилением) с помощью Boeringer Mannheim Expand kit, используя праймеры (5'-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3') и (5'-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTA TTG C-3') и GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied system), а также используя циклическую температурную программу 94°C 5 мин, 30 циклов 94°C 30 с, 52°C в течение 30 с и 68°C в течение 2 мин и, наконец, 5 мин при 68°C. Реакцию секвенирования выполняют с бактериальным продуктом PCR (разбавленным в 5 раз) в качестве шаблона, используя смесь Big Dye Terminator mix из PE Applied Biosystems и GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied system), а также циклическую температурную программу 25 циклов 10 с 96°C, 50°C в течение 5 с и 60°C в течение 4 минут. Продукты расширения очищают в соответствии с инструкцией производителя и выполняют разделение и определение продуктов расширения при использовании 3100 Genetic analyser (PE Applied Biosystems). Последовательности анализируют с помощью компьютерной программы собственной разработки. Из информации о последовательностях исключают гомологичные клоны и клоны с неподходящими сайтами рестрикции, оставляя 6 клонов для конверсии IgG. Последовательности ДНК тяжелых вариабельных (VH) и легких вариабельных (VL) доменов окончательно отобранных клонов показаны на фиг.3.

Пример 2

Перенос генов, кодирующих вариабельные части отобранных scFv, в полноразмерные IgG1 векторы человека.

Чтобы конвертировать бактерии, содержащие клоны scFv, в Ig-формат, их выращивают в течение ночи в среде LB с добавкой 100 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК получают из выдержанной в течение ночи культуры, используя мини-набор препарата плазмид Quantum Prep от Biorad(# 732-6100). Концентрацию ДНК измеряют с помощью измерения поглощения при 260 нм и ДНК разбавляют до концентрации 2 нг/мкл.

VH и VL из различных scFv-плазмидов амплифицируют PCR для того, чтобы снабдить эти сегменты сайтами рестрикции, совместимыми с векторами экспрессии (см. ниже). 5'-праймеры содержат BsmI, и 3'-праймеры содержат BsiWI сайт рестрикции расщепления энзимов (показанные курсивом). 3'-праймеры также содержат донорный сайт сплайсинга (показанный жирным шрифтом).

Праймеры для амплификации VH-сегментов:

5'VH: 5'-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG (SEQ. ID. NO: 13)

3'VH: 5'-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG (SEQ. ID. NO: 14)

Праймеры для амплификации VL-сегментов:

5'VL: 5'-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG (SEQ. ID. NO: 15)

3'VL: 5'-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT (SEQ. ID. NO: 16)

PCR вводят в общий объем 50 мкл, содержащий 10 нг шаблона ДНК, 0,4 мкМ 5'-праймера, 0,4 мкМ 3'-праймера и 0,6 мкМ dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфат) (Roche,#1 969 064). Использованная полимераза является Expand long template PCR system (Roche# 1 759 060), 3,5 ед на реакцию вместе с каждым из трех поставляемых буферов в 3 отдельных реакциях. Каждый цикл амплификации PCR состоит из стадии денатурирования при 94°C в течение 30 секунд, стадии ренатурирования при 55°C в течение 30 секнд, и стадии расши