Антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека

Антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к химерному антителу человека/мыши, содержащему вариабельную область (V-область) моноклонального антитела мыши против белка, родственного паращитовидному гормону, и константную область (С-область) антитела человека; к очеловеченному антителу, в котором гипервариабельные участки, V-областей легкой цепи (L-цепь) и тяжелой цепи (Н-цепь) моноклонального антитела мыши против белка, родственного паращитовидному гормону (PTHrP), трансплантированы в антитело человека; к L- и Н-цепям указанного антитела, а также к полипептиду, который имеет V-область, состоящую из L- или Н-цепи указанного антитела.

Настоящее изобретение относится также к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую вышеуказанное антитело, в частности, его V-область, и к ДНК, кодирующей L- или Н-цепь, образующую V-область. Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантному вектору, содержащему данную ДНК, и к хозяину, трансформированному указанным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения химерных и очеловеченных антител против PTHrP. Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции и лекарственному средству для подавления гиперкальциемии или улучшения при гипофосфатемии, которое содержит антитело против PTHrP в качестве активного ингредиента.

Предпосылки изобретения

Гиперкальциемия, обусловленная злокачественной опухолью, является серьезным осложняющим симптомом, обнаруженным у 5-20% всех субъектов, имеющих злокачественную опухоль. Это считается терминальным симптомом злокачественной опухоли и неизбежно ведет к смерти субъекта при отсутствии соответствующего лечения. Контролирование гиперкальциемии может в значительной степени повлиять на прогноз и качество жизни субъекта, поэтому его назначение очень велико.

Как правило, гиперкальциемию у субъектов, имеющих злокачественную опухоль, можно грубо классифицировать как гуморальную гиперкальциемию злокачественного заболевания (ННМ), возникающую под воздействием опухолеобразующих гуморальных факторов резорбции костной ткани, и как локальную остеолитическую гиперкальциемию (LOH), возникающую в результате местного воздействия опухоли, перенесенной или инфильтрованной в костную ткань. Считается, что в случае гуморальной гиперкальциемии злокачественного заболевания, содержание потока кальция повышается из-за резорбции костной ткани или из-за остеолизации, ведущих к гиперкальцемии в сочетании с ухудшением способности почек выводить кальций (S.Wada and N.Nagata, Internal Medicine, 69, 644-648).

Симптомы гиперкальциемии обычно проявляютя при концентрации кальция в сыворотке более 12 мг/мл; хотя ее неспецифические симптомы, такие как анорексия (отсутствие аппетита), тошнота и рвота, наблюдаются уже на ранней стадии злокачественного заболевания. По мере развития гиперкальциемии у субъекта снижается способность концентрировать воду вследствие поражения почечных периферических канальцев, что ведет к повышенному выделению мочи (полиурии), при этом анорексия и тошнота сопровождаются обезвоживанием организма из-за недостаточного поглощения воды.

Мозелей Дж.М. и др. обнаружили, что одним из гуморальных факторов, вызывающих гуморальную гиперкальциемию злокачественного заболевания, является белок, родственный паращитовидному гормону (РТН) (далее определяется как "PTHrP") (Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1987) 8-4, 5048-5052).

Вслед за этим был выделен ген, кодирующий PTHrP (Suva L.J. et al.. Science (1987) 237, 893). Анализ этого гена показал наличие трех типов PTHrP человека, имеющих 139, 141 и 173 аминокислоты, вследствие поочередного сплайсинга этого гена, и присутствие в крови различных фрагментов в результате ограниченного расщепления PTHrP (1-139) с полной структурой (Baba, H., Clinical Calcium (1995)5,229-223). В PTHrP 8 аминокислот из N-концевых 13 аминокислот идентичны указанным аминокислотам паращитовидного гормона. Из этого следует, что аминокислотный сайт, соответствующий положениям 14-34, имеет пространственную структуру, которая также подобна паращитовидному гормону. Таким образом, PTHrP и РТН связываются с общим рецептором РТН/PTHrP по крайней мере в N-концевой области (Jueppner, H. et al., Science (1991) 254, 1024-1026; Abou-Samra, A-B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1992) 89, 2732-2736.

Как известно, PTHrP продуцируется разными опухолевыми тканями, при этом установлено, что PTHrP вырабатывается не только в опухоли, но и в разных нормальных тканях начиная с плода и кончая взрослыми субъектами. К таким тканям относятся кожа, центральная нервная система, матка, плацента, молочные железы в период лактации, щитовидная железа, пара-щитовидная железа, надпочечник, печень, почки и мочевой пузырь (Burtis, W.J., Clin. Chem. (1992) 38, 2171-2183; Stew-art. A.F. & Broadus, A.E., J.Clin. Endocrmol. (1991)71, 1410-1414). Кроме того, считается, что PTHrP играет важную роль в метаболической регуляции кальция, содержание которого выше у плода и новорожденного, чем у матери.

Известно, что рецепторы РТН/PTHrP находятся главным образом в костях и почках (C.Shigeno, Clinical Calcium (1995) 5, 355-359) и активируют несколько систем внутриклеточной передачи сигналов путем связывания PTHrP с рецепторами. Одним из них является аденилатциклаза, а другим - фосфолипаза С. Активация аденилатциклазы увеличивает концентрацию внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (уАМФ), активирующего протеинкиназу А. Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфонат с образованием инозитол-1,4,5-трифосфоната и диацилглицерола. В указанных системах передачи сигналов используется G-белок (Coleman, D.T. et al., Biochemical mechanisms of parathyroid hormone action. In: "The parathyroids" (Bilezikian, J.P. et al), Raven Press, New York (1994) 239).

Под воздействием этих систем передачи сигналов PTHrP вызывает гиперкальциемию и гипофосфатемию, снижает способность резорбцию фосфата почками, увеличивает выделения уАМФ почками и определяет другие подобные процессы, которые имеют место в случае гиперкальциемии злокачественного заболевания (ННМ).

Таким образом, установлено, что PTHrP имеет непосредственное отношение к гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью. Для лечения гиперкальциемии, связанной со злокачественной опухолью, используют кальцитонин, стероидные средства, индометацин, неорганические соли фосфата, бифосфонаты и тому подобные средства, а также средства для восполнения жидкости. Однако для указанных средств характерно снижение эффективности при длительном применении, возникновение серьезных побочных эффектов и медленное проявление их фармакологического действия, поэтому необходимы новые лекарственные средства, обладающие более сильным терапевтическим действием и менее выраженными побочными эффектами.

Кукрейя С.С. и др. (Kukreja, S.C. et al.) сообщили, что для лечения гиперкальциемии, обусловленной злокачественной опухолью, они использовали нейтрализующую антисыворотку против PTHrP. При введении этой антисыворотки бестимусным мышам, которым были трансплантированы клетки рака легкого или гортани человека, вызывающего гиперкальциемию, наблюдалось снижение содержания кальция в крови и уровня уАМФ в моче (J.Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802). Каньи Сато и др. сообщили, что при введении антитела против PTHrP (1-34) "голым" мышам, которым была имплантирована PTHrP-продуцирующая опухоль человека, симптомы гиперкальциемии стали менее выраженными и срок жизни мышей существенно увеличился (J.Bone &. Mine. Res. (1993) 8, 849-860). Далее, в открытой публикации заявки на патент Японии №4-228089 описываются химерные антитела мыши/человека против PTHrP человека (1-34).

Моноклональные антитела мыши оказывают в организме человека сильное иммуногенное действие (иногда оно определяется как "антигенное"), что ограничивает использование моноклональных антител для лечения людей. Например, антитело мыши, введенное человеку, может быть метаболизировано как чужеродное вещество; поэтому период полувыведения антитела мыши из организма человека является относительно коротким, и оно не оказывает требуемого действия. Кроме того, повышение уровня вырабатывающихся в организме человека антител против мыши (НАМА), при введении антител мыши может вызвать иммунные реакции, которые неприемлемы или опасны для пациента, например, сывороточные болезни и другие аллергические реакции. Поэтому моноклональные антитела мыши часто непригодны для введения людям.

Чтобы решить эти проблемы, были разработаны методы, направленные на снижение иммуногенности нечеловеческих антител, в частности, моноклональных антител мыши. Одним из таких методов является создание химерного антитела, в котором вариабельная область (V-область) выделена из моноклонального антитела мыши и константная область (С-область) выделена из соответствующего антитела человека.

Поскольку полученное химерное антитело имеет интактную вариабельную область исходного антитела мыши, можно ожидать, что данное химерное антитело будет связываться с антигеном с той же специфичностью, что и исходное антитело мыши. Кроме того, такое химерное антитело имеет значительно меньшую часть аминокислотной последовательности, полученной у животного; из вышесказанного следует, что иммуногенность этого антитела должна быть ниже по сравнению с исходным антителом мыши. Хотя химерное антитело связывается со своим антигеном подобно исходному моноклональному антителу мыши, характеризуясь при этом более низкой иммуногенностью, некоторые иммунные реакции на вариабельную область мыши по-прежнему могут иметь место (LoBuglip, A.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

Второй метод уменьшения иммуногенности антител мыши является более сложным, но, как считается, позволяет еще больше снизить потенциальную иммуногенность антител мыши. В соответствии с этим методом в вариабельную область человека трансплантируют только гипервариабельный участок (CDR) вариабельной области антитела мыши с целью создания реконструированной вариабельной области человека. При необходимости в вариабельную область человека можно трансплантировать частичную аминокислотную последовательность каркасной области (FR), содержащей гипервариабельные участки в вариабельной области антитела мыши, с целью создания структуры гипервариабельных участков в реконструированной вариабельной области человека, которая ближе структуре исходного антитела мыши.

Затем эти очеловеченные реконструированные вариабельные области человека соединяют с константными областями человека. В окончательно реконструированном очеловеченном антителе чужеродными аминокислотными последовательностями являются только гипервариабельные участки и очень небольшая часть каркасной области. Гипервариабельные участки состоят из гипервариабельной аминокислотной последовательности и не имеют каких-либо видоспецифичных последовательностей. Поэтому очеловеченное антитело, содержащее гипервариабельные участки мыши, обладает не более сильной иммуногенностью, чем натуральное антитело человека, содержащее гипервариабельные участки человека.

Использование очеловеченных антител рассматривается в следующих ссылках: Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C.A. et al. Protein Engng, 4, 773-783, 1991; Maeda, H. et al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; German, S.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et al., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, M.S. et al., J. Immunol, 148, 1149-1154, 1992 and Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

Хотя считается, что очеловеченные антитела должны быть полезны для лечебных целей, в вышеуказанных ссылках отсутствуют какие-либо упоминания об очеловеченном антителе против PTPrH. Кроме того, до сих пор не разработан стандартизированный метод, который мог быть применен к любым антителам для получения очеловеченных антител; поэтому существует необходимость в создании эффективных методов получения очеловеченного антитела, характеризующегося достаточной активностью связывания и нейтрализации специфического антигена (см., например, Sato, К. et al., Cancer Res., 53, 851-856, 1993).

Краткое изложение существа изобретения

Объектом настоящего изобретения является химерное антитело человека/мыши, содержащее вариабельную область (V-область) моноклонального антитела мыши против PTPrH и константную область (С-область) антитела человека; очеловеченное антитело, в котором гипервариабельные участки V-областей легкой цепи (L-цепи) и тяжелой цепи (Н-цепи) моноклонального антитела мыши против PTPrH трансплантированы в антитело человека; L- и Н-цепи указанного антитела, а также полипептид, содержащий V-область, состоящую из L- или Н-цепи указанного антитела.

Другим объектом настоящего изобретения является получение ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую вышеуказанное антитело, в частности, его V-область, и ДНК, кодирующей L- или Н-цепь, содержащего полипептида, содержащего V-область. Еще одним объектом настоящего изобретения является создание рекомбинантного вектора, содержащего указанную ДНК, и хозяина, трансформированного указанным вектором. Еще одним объектом настоящего изобретения являются способы получения химерных и очеловеченных антител против PTPrH. Еще одним объектом настоящего изобретения является получение антитела против PTPrH, обладающего сильной нейтрализующей активностью. Еще одним объектом настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции и средства для подавления гиперкальциемии, или улучшения при гипофосфатемии и алкалозе содержащего антитело или очеловеченное антитело против PTPrH в качестве активного ингредиента.

В результате всестороннего исследования, направленного на достижение вышеуказанных целей, авторами настоящего изобретения было получено антитело с низкой иммуногенностью моноклональных антител мыши против PTPrH в организме человека; так было завершено данное изобретение.

Объектом настоящего изобретения является химерная L-цепь, содержащая С-область L-цепи антитела человека и V-область L-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. V-область L-цепи содержит одну аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №45, и С-область L-цепи включает Сλ-область.

Объектом настоящего изобретения является также химерная Н-цепь, содержащая С-область Н-цепи антитела человека и V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. V-область Н-цепи содержит аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №46, и С-область включает Сγ 1-область.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является химерное моноклональное антитело против PTPrH, содержащее указанную химерную L-цепь и указанную химерную Н-цепь.

Объектом настоящего изобретения далее является полипептид, имеющий V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит каркасные области 1-4 V-области L-цепи антитела человека и гипервариабельные участки 1-3 V-области L-цепи моноклонального антитела мыши против PTPrH. Гипервариабельные участки 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№59-61; каркасные области 1-3 получены из каркасных областей 1-3 антитела человека HSU03868 и каркасная область 4 получена из каркасной области 4 антитела человека S25755; или каркасные области 1-3 по существу идентичны каркасным областям 1-3 антитела человека HSU03868, и каркасная область 4 по существу идентична каркасной области 4 антитела человека S25755.

Термин "по существу идентичный" означает, что каркасные области антитела человека, используемые в очеловеченном антителе, могут иметь делеции, замены и/или добавления аминокислот, необходимые для образования гипервариабельных участков моноклонального антитела мыши, в результате чего очеловеченное антитело должно обладать активностью, которая эквивалентна активности моноклонального антитела мыши.

Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, в которой 36-я и 49-я аминокислоты в каркасных областях в соответствии с рекомендациями Кабата (Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) являются соответственно тирозиновой и аспарагиновой кислотой.

Настоящее изобретение относится также к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№48-51.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, где 45-я и 87-я аминокислоты в каркасных областях в соответствии с рекомендациями Кабата являются соответственно лизином и изолейцином.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№52-55.

Настоящее изобретение далее относится к полипептиду, имеющему V-область Н-цепи очеловеченного антитела, которая содержит каркасные области 1-4 V-области Н-цепи V-области антитела человека и гипервариабельные участки 1-3 V-области Н-цепи V-области моноклонального антитела мыши против PTPrH человека. Гипервариабельные участки 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№62-64, каркасные области 1-4 выделены из каркасных областей 1-4 антитела человека, относящегося к человеческой подгруппе III (HSG III, Kabat, E.A. et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991), в частности, из каркасных областей 1-4 антитела человека S31679 соответственно, или они по существу идентичны каркасным областям 1-4 антитела человека S31679, соответственно.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, имеющему V-область Н-цепи очеловеченного антитела, которая содержит аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №56.

Настоящее изобретение относится также к L-цепи очеловеченного антитела против PTHrP человека, которая содержит полипептид, имеющий V-область L-цепи указанного очеловеченного антитела, и полипептид, имеющий С-область L-цепи антитела человека. С-область включает Сλ-область, каркасные области 1-3 по существу идентичны каркасным областям 1-3 антитела человека HSU03868, каркасная область 4 по существу идентична каркасной области 4 антитела человека S25755, и аминокислотные последовательности гипервариабельных участков 1-3 выражены соответственно последовательностями с идентификационными №№59-61.

Настоящее изобретение далее относится к Н-цепи очеловеченного антитела против PTHrP человека, которая содержит полипептиды, имеющие С-область Н-цепи и V-область Н-цепи указанного антитела человека. С-область включает Сγ 1-область, каркасные области 1-4 выделены из каркасных области 1-4 антитела человека, относящегося к HSGIII, и гипервариабельные области 1-3 содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№62-64.

Настоящее изобретение далее относится к антителу против PTHrP со слабой антигенностью и высокой нейтрализующей активностью. Антитело против PTHrP включает антитело человека, очеловеченное антитело, химерное антитело и приматированное антитело, которые можно использовать для лечения заболеваний человека. Указанное антитело характеризуется низкой константой диссоциации. Кроме того, антитело по настоящему изобретению обладает высокой нейтрализующей активностью благодаря низкой константе диссоциации, поэтому его можно использовать для лечения заболеваний человека.

Антитело по настоящему изобретению имеет константу диссоциации, равную 1,86×10^-7 [М] или меньше, константу скорости диссоциации, равную 1,22×10^-1 [1/сек] или меньше, и константу скорости ассоциации, равную 6,55×10⁴ [1/М.сек] или больше. Эти константы можно измерить с помощью анализа Скатчарда, используя меченные радиоактивным изотопом лиганды или резонансный сенсор поверхностного плазмона.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи или V-область Н-цепи моноклонального антитела мыши против PTHrP человека. V-область L-цепи и V-область Н-цепи содержат аминокислотные последовательности, выраженные соответственно последовательностями с идентификационными №№45-46;

ДНК, кодирующая V-область L-цепи, содержит, например, последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №65, и ДНК, кодирующая V-область Н-цепи, содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №57.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК, кодирующей указанную химерную L- или Н-цепь. ДНК, кодирующая L-цепь, содержит, например, последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №65, и ДНК, кодирующая Н-цепь, содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №57.

Настоящее изобретение относится также к ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи или V-область Н-цепи указанного очеловеченного антитела. ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи, выражена любой последовательностью с идентификационными №№66-74, и ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область Н-цепи, выражена последовательностью с идентификационным №58.

Настоящее изобретение относится также к ДНК для V-области L-цепи очеловеченного антитела, которая содержит последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, выраженную любой последовательностью с идентификационными №№47-55. Указанная ДНК содержит последовательность оснований, выраженную одной из последовательностей с идентификационными №№66-74.

Настоящее изобретение далее относится к ДНК для V-области Н-цепи очеловеченного антитела, которая кодирует аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №56. Указанная ДНК содержит последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №58.

Настоящее изобретение далее относится к рекомбинантному вектору, содержащему любые указанные ДНК.

Настоящее изобретение относится также к трансформанту, преобразованному с помощью указанного рекомбинантного вектора.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения химерного или очеловеченного антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека, который включает: культивирование указанного трансформанта и выделение из полученной культуры химерного или очеловеченного антитела против белка, родственного паращитовидному гормону человека.

Настоящее изобретение далее относится к фармацевтической композиции или средству, предназначенному для подавления гиперкальциемии или улучшения при гипофосфатемии, которые содержат указанное антитело в качестве активного ингредиента. Кальциемия возникает вследствие злокачественного заболевания и гипофосфатемия часто наблюдается у субъектов, страдающих гиперкальциемией, обусловленной злокачественной опухолью. Таким образом, антитело по настоящему изобретению можно использовать для лечения злокачественной опухоли или ослабления симптомов гиперкальциемии или гипофосфатемии. Злокачественная ткань может включать, но не ограничиваться, по крайней мере одной, выбранной из группы рака поджелудочной железы, легкого, глотки, гортани, языка, десны, пищевода, желудка, желчных протоков, молочной железы, почек, мочевого пузыря, матки и предстательной железы, а также злокачественной лимфомы. Средство по настоящему изобретению, предназначенное для подавления гиперкальциемии, можно использовать в случае любого злокачественного заболевания, вызывающего гиперкальциемию.

Подробно настоящее изобретение будет описано ниже.

1. Получение моноклональных антител мыши против PTHrP человека

Моноклональные антитела мыши против PTHrP человека можно получить путем создания гибридом в результате слияния миеломных клеток и антителообразующих клеток, выделенных у животных, иммунизированных антигеном, и выбора из полученных гибридом клонов, продуцирующих антитела, которые специфически ингибируют активность PTHrP.

(1) Получение антигенов

PTHrP, используемый для иммунизации животных, включает пептиды, содержащие всю или часть аминокислотной последовательности PTHrP, полученного с помощью технологии получения рекомбинантных ДНК или химического синтеза, и PTHrP, выделенного из супернатантов раковых клеток, вызывающих гиперкальциемию. Например, в качестве антигена можно использовать пептид [PTHrP(1-34)], содержащий аминокислоты 1-34 известного PTHrP (Kemp, B.E. et al., Science (1987) 238, 1568-1570). PTHrP (1-34) человека имеет аминокислотную последовательность, выраженную последовательностью с идентификационным №75.

Полученный PTHrP присоединяют к белку-носителю, такому как тироглобулин, с последующим добавлением адъюванта. Можно смешивать любой адъювант, включая полные и неполные адъюванты Фрейнда.

(2) Иммунизация и выделение антителообразующих клеток

Полученный выше антиген вводят млекопитающему, такому как мышь, крыса, лошадь, обезьяна, кролик, коза или овца. Иммунизацию можно осуществлять любыми известными методами, включая внутривенные, подкожные и внутрибрюшинные инъекции. Временные интервалы между инъекциями с целью иммунизации не имеют каких-либо конкретных ограничений и могут составлять от нескольких дней до нескольких недель, предпочтительно от 4 дней до 21 дня.

Через два или три дня после последней иммунизации выделяют антителообразующие клетки. Антителообразующими клетками являются клетки селезенки, лимфатического узла и периферической крови; причем обычно используют клетки селезенки. Однократная доза антигена, предназначенного для иммунизации, составляет 100 мкг/мышь.

(3) Определение титров антител

Чтобы определить уровни иммунной реакции иммунизированных животных и выбрать представляющие интерес гибридомы из клеток, подвергнутых слиянию, измеряют титр антител в крови иммунизированного животного или титр антител в супернатанте антителообразующих клеток.

Методы детектирования антител хорошо известны и включают иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

(4) Слияние клеток

Миеломные клетки, используемые для слияния с антителообразующими клетками, включают линии клеток, которые получают у разных животных, таких как мыши, крысы и человек, и, как правило, могут быть легко получены специалистами в этой области. Приемлемые линии клеток характеризуются лекарственной устойчивостью, неспособностью выживать в избирательной среде, такой как НАТ-среда, в несвязанном состоянии, и способностью выживать в указанной среде только в связанном состоянии. Обычно используют линии клеток, устойчивые к 8-азагуанину, у которых отсутствует гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза и которые не могут расти в гипоксантин-аминоптерин-тимидиновой (HAT) среде.

Пригодными для использования миеломными клетками являются разные известные линии клеток, такие как Р3 (P3x63Ag8.653) (J.Immunl. (1979) 123:1548-1550); P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7); NS-1 (Kohler, G and Milstein, C., Eur. J.Immunol. (1976) 6:511-519); MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8:405-415); SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276:269-170); FO (de St. Groth, S.F. et al., J.Iinmunol. Methods (1980) 35:1-21); S194 (Trowbridge, I.S, J.Exp.Med. (1978) 148:313-323) и R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277:131-133).

Антителообразующие клетки можно получить из клеток селезенки, лимфатического узла или подобных клеток. С этой целью у любого из вышеуказанных животных удаляют селезенку, лимфатический узел или другой орган и ткань измельчают. Полученный измельченный материал суспендируют в среде или буфере, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) или RPMI1640, фильтруют через фильтр из нержавеющий стали или тому подобный и центрифугируют с получением требуемых антителообразующих клеток.

Затем указанные миеломные клетки и антителообразующие клетки подвергают слиянию.

Слияние клеток можно осуществлять путем соединения миеломных и антителообразующих клеток в отношении от 1:1 до 1:10 в среде для культивирования животных клеток, такой как минимальная поддерживающая среда (MEM), DMEM или RPME-1640, в присутствии акселератора слияния при температуре 30-37°С в течение 1-15 минут. Для ускорения слияния клеток можно использовать любой акселератор слияния или вирус, такой как полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 1000-6000, поливиниловый спирт или вирус Сендай. Слияние антителообразующих и миеломных клеток можно также осуществлять в промышленно доступном аппарате для слияния клеток с использованием электрической стимуляции, такой как электропорация.

(5) Отбор и клонирование гибридом

Представляющие интерес гибридомы отбирают из клеток после слияния клеток, например, по методу селективного выращивание клеток в селективных средах.

С этой целью суспензию клеток разводят в приемлемой среде и инокулируют на титрационном микропланшете. В каждую лунку добавляют селективную среду, такую как НАТ-среда, и инкубируют, периодически заменяя указанную селективную среду свежей средой.

Выращенные клетки собирают и используют в качестве гибридом.

Эти гибридомы затем исследуют посредством ограниченного разведения, клеточного сортера, активируемого флуоресценцией, или другим способом. И, наконец, получают гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело.

(6) Выделение моноклональных антител

Для получения моноклональных антител из полученных гибридом обычно используют способы культивирования клеток и образования асцита.

В соответствии со способом культивирования клеток, гибридомы культивируют в среде для выращивания животных клеток, такой как RPMI-1640, содержащая 10-20% сыворотки плода коровы, минимальная поддерживающая среда или бессывороточная среда, в приемлемых условиях (например, 37°С, 5% СО₂) в течение 2-14 дней, после чего антитела выделяют из супернатанта.

В соответствии со способом образования асцита, гибридомы внутрибрюшинно инокулируют млекопитающему того же вида, который используют в качестве источника миеломных клеток, для достижения обильного роста гибридом. Через 1-4 недели получают асцит или сыворотку.

Для получения очищенных антител используют отдельно или в сочетании такие известные способы, как осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию.

2. Конструирование химерных антител

(1) Клонирование ДНК, содержащей последовательность оснований, кодирующую V-область моноклоналъного антитела мыши против PTHrP человека.

(i) Получение мРНК

Чтобы клонировать ДНК, содержащую последовательность оснований, кодирующую V-область моноклонального антитела мыши против PTHrP человека, полученные гибридомы обрабатывают известным способом, например, гуанидин-ультрацентрифугированием (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) или методом AGPC (Chomczynski, P. et al., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159), с получением полной РНК, из которой выделяют мРНК, например, в разделительной колонке с олиго(тимидин)целлюлозным наполнителем, которая входят в набор для очистки мРНК (Pharmacia). Для получения мРНК можно также использовать набор для очистки мРНК Quick Prep (Pharmacia AB), при этом не нужно выделять полную РНК.

(ii) Получение и амплификация кДНК

Из полученной выше (i) мРНК синтезируют кДНК в V-областях L- и Н-цепей с использованием обратной транскриптазы. В процессе синтеза кДНК можно использовать затравку, такую как олиготимидин, или любую другую приемлемую затравку, которая гибридизирует с С-областью L- или Н-цепи, например, затравку МНС2, имеющую последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №1.

Для синтеза кДНК указанную мРНК и затравку смешивают и подвергают взаимодействию в присутствии обратной транскриптазы, например, при температуре 52°С в течение 30 минут.

Амплификацию кДНК как L-цепи, так и Н-цепи можно осуществлять путем полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) по методу 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nu-cleic Acids Res., 17, 2919-2932, 1989) с использованием набора 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH Inc.). Таким образом, связывающий фрагмент Ampli FINDER (последовательность с идентификационным №42) присоединяют к 5' концу синтезированной выше кДНК и осуществляют полимеразную реакцию синтеза цепи в отношении ДНК, содержащей последовательности оснований, кодирующие V-области L- и Н-цепей. (ДНК, содержащая последовательность оснований, кодирующую V-область L-цепи, далее иногда определяется как "ДНК для V-области L-цепи" или "ДНК, кодирующая V-область L-цепи". То же самое относится к V-области Н-цепи, С-области и т.д.).

Приемлемой затравкой для амплификации ДНК, кодирующей V-область L-цепи, может быть, например, связывающая затравка (последовательность с идентификационным №2) и затравки, полученные из консервативных последовательностей в константной области Lλ-цепи (Сλ-область) антител мыши, такие как затравка MLC, имеющая последовательность оснований, выраженную последовательностью с идентификационным №4. Приемлемой затравкой для амплификации ДНК, кодирующей V-область Н-цепи, может быть, например, связывающая затравка (последовательность с идентификационным №2) и затравка MHC-G1 (последовательность с идентификационным №3) (S.Т.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88, 1991).

(iii) Очистка ДНК и определение последовательности оснований

Продукты полимеразной реакции синтеза цепи (PCR) подвергают электрофорезу в агарозном геле известными способами с целью вырезания представляющих интерес фрагментов ДНК, которые затем выделяют, очищают и лигируют с векторной ДНК.

Очистку ДНК можно осуществлять с помощью промышленно доступных наборов, таких как GENECLEAN II; BIО101. Векторная ДНК, несущая фрагменты ДНК, известна; с этой целью можно, например, использовать pUC19 или Bluescript.

Указанную ДНК и векторную ДНК лигируют с помощью известного набора для лигирования (Takara Shuzo) с получением рекомбинантного вектора.

Полученный рекомбинантный вектор вводят в Escherichia coli JM109 и в устойчивые к ампициллину колонии; таким образом, векторную ДНК получают известным способом (J.Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). После расщепления векторной ДНК одним или несколькими рестрикционными ферментами, последовательность оснований требуемой ДНК определяют известным способом, таким как дидезокси способ (J. Sambrook, et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). При осуществлении настоящего изобретения можно использовать автоматическое устройство для определения последовательности оснований (секвенатор ДНК 373А; ABI Inc.).

(iv) Гипервариабельный участок

V-области Н- и L-цепи образуют антигенсвязывающий сайт, и их полные структуры обладают некоторым сходством. То есть, четыре участка каркасной области (FR) связаны тремя гипервариабельными участками (CDR). Аминокислотная последовательность в каркасной области является достаточно консервативной, в то время как аминокислотная последовательность гипервариабельного участка отличается высокой вариабельностью (Kabat, E.A. et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983).

Многие участки указанных четырех каркасных областей имеют β-складчатую структуру, вследствие чего три гипервариабельных участка образуют петлю. Гипервариабельный участок может иногда составлять часть β-складчатой структуры. Поэтому три гиперварибельных участка в пространственном отношении расположены очень близко друг к другу из-за указанной структуры каркасных областей, которые образуют антигенсвязывающий сайт вместе с тремя гипервариабельными участками в спаренных областях.

С учетом этих факторов гипервариабельные участки можно обнаружить путем сравнения аминокислотной последовательности в вариабельной области моноклонального антитела мыши против PTHrP человека с базой данных по структуре аминокислотных последовательностей для антител, полученных по методу Кабата и др. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983), с целью исследования их гомологии.

(2) Конструирование экспрессирующего вектора химерного антитела

После клонирования фрагментов ДНК, кодирующей V-области L- и Н-цепи моноклонального антитела мыши (далее L- или Н-цепь антитела иногда определяется как "L-цепь мыши" и т.д. для антител мыши и "Н-цепь человека" и т.д. для антител человека), ДНК, кодирующие V-области мыши, и ДНК, кодирующие конст