Сопряженные с g-белком рецепторы drosophila, нуклеиновые кислоты и способы, имеющие к ним отношение

Сопряженные с g-белком рецепторы drosophila, нуклеиновые кислоты и способы, имеющие к ним отношение

Реферат

Данное изобретение частично относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим новые сопряженные с G-белком рецепторы Drosophila melanogaster (DmGPCR), новым полипептидам, анализам для скрининга соединений, которые связываются с DmGPCR и/или модулируют активность DmGPCR, способам связывания DmGPCR, реагентам, таким как антитела к DmGPCR, праймеры и зонды для выявления нуклеотидных последовательностей, кодирующих DmGPCR, наборам, содержащим антитела, праймеры и зонды согласно изобретению, композициям, содержащим DmGPCR, партнерам, связывающим DmGPCR, и модуляторам DmGPCR, и к способам контролирования популяции насекомых с использованием связывающего партнера или модулятора DmGPCR.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Люди и другие живые формы состоят из живых клеток. Один из механизмов, посредством которых клетки организма обмениваются информацией друг с другом и получают информацию и стимулы из окружающей среды, основан на молекулах рецепторов клеточных мембран, экспрессированных на поверхности клеток. Многие из таких рецепторов идентифицированы, охарактеризованы и иногда их классифицировали в основные надсемейства рецепторов на основании структурных мотивов и характеристик сигнальной трансдукции. Такие семейства включают в себя (но не ограничены указанным) рецепторы управляемых лигандом ионных каналов, рецепторы зависимых от потенциала ионных каналов, рецепторные тирозинкиназы, рецепторные тирозиновые протеинфосфатазы и сопряженные с G-белком рецепторы. Рецепторы являются первым необходимым связующим звеном для преобразования внеклеточного сигнала в физиологический ответ клетки.

Сопряженные с G-белком рецепторы (т.е. GPCR) образуют многочисленное надсемейство поверхностных рецепторов клетки, которые характеризуются аминоконцевым внеклеточным доменом, карбоксиконцевым внутриклеточным доменом и змеевидной структурой, которая проходит через мембрану семь раз. Поэтому также рецепторы иногда также называют рецепторами с семью трансмембранными доменами (7TM). Указанные семь трансмембранных доменов определяют границы трех внеклеточных петель и трех внутриклеточных петель кроме амино- и карбоксиконцевых доменов. Внеклеточные части рецептора играют роль в узнавании и связывании одного или нескольких внеклеточных партнеров в связывании (например, лигандов), тогда как внутриклеточные части играют роль в узнавании и взаимодействии с расположенными ниже в каскаде эффекторными молекулами.

GPCR связывают множество лигандов, включая ионы кальция, гормоны, хемокины, нейропептиды, нейромедиаторы, нуклеотиды, липиды, одоранты и даже фотоны. Не удивительно, что GPCR имеют важное значение в нормальном (и иногда аномальном) функционировании многих типов клеток. В общем смысле см. Strosberg, Eur. J. Biochem., 1991, 196, 1-10; Bohm et al., Biochem J., 1997, 322, 1-18. Когда специфичный лиганд связывается со своим соответствующим рецептором, лиганд обычно стимулирует рецептор, активируя специфичный гетеротримерный связывающий гуаниновый нуклеотид регуляторный белок G (G-белок), который сопряжен с внутриклеточной частью или областью рецептора. G-белок, в свою очередь, передает сигнал к эффекторной молекуле в клетке, либо стимулируя, либо ингибируя активность данной эффекторной молекулы. К указанным эффекторным молекулам относятся аденилатциклаза, фосфолипазы и ионные каналы. Аденилатциклаза и фосфолипазы являются ферментами, которые вовлечены в продукцию молекул вторичных мессенджеров цАМФ, инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Именно через такую последовательность событий стимул внеклеточного лиганда вызывает внутриклеточные изменения посредством сопряженного с G-белком рецептора. Каждый такой рецептор имеет свою собственную характерную первичную структуру, характер экспрессии, профиль связывания лиганда и внутриклеточную эффекторную систему.

Вследствие важной роли сопряженных с G-белком рецепторов в осуществлении коммуникаций между клетками и их окружением, такие рецепторы являются привлекательными мишенями для регуляции, например, посредством активации или антагонистического воздействия на такие рецепторы. В случае рецепторов, имеющих известные лиганды, можно попытаться специально идентифицировать агонисты или антагонисты, чтобы усилить или ингибировать действие лиганда. Например, некоторые сопряженные с G-белком рецепторы играют роль в патогенезе заболеваний (например, некоторые рецепторы хемокинов, которые действуют как корецепторы ВИЧ, могут играть роль в патогенезе СПИДа) и являются привлекательными мишенями для терапевтического вмешательства даже при отсутствии сведений о природном лиганде рецептора. Другие рецепторы являются привлекательными мишенями для терапевтического вмешательства в силу характера их экспрессии в тканях или типах клеток, которые сами по себе являются привлекательными мишенями для терапевтического воздействия. Примеры указанной последней категории рецепторов включают в себя рецепторы, экспрессируемые в иммунных клетках, которые могут быть нацелены на то, чтобы либо ингибировать аутоиммунные ответы, либо усилить иммунные ответы для борьбы с патогенами или злокачественной опухолью; и рецепторы, экспрессируемые в головном мозге и других органах и тканях нервной системы, которые, вероятно, являются мишенями при лечении шизофрении, депрессии, биполярного расстройства или других неврологических расстройств. Указанная последняя категория рецепторов также применима в качестве маркера для идентификации и/или очистки (например, посредством флуоресцентно активируемой сортировки клеток) подтипов клеток, которые экспрессируют рецептор.

Насекомые считаются основными вредителями в сельском хозяйстве и в домашней среде человека. Насекомые также являются паразитами животных и человека, именуемыми в таких случаях эктопаразитами, вызывающими заболевания и смертность. Насекомые также служат переносчиками вирусных и паразитарных заболеваний растениям, животным и человеку. Таким образом, продолжает существовать настоятельная необходимость в открытии новых способов контролирования популяций насекомых и отпугивания и/или уничтожения патогенных и вредных видов. Один из путей контролирования популяций насекомых путем уничтожения или парализации насекомых заключается в применении химических агентов, называемых инсектицидами, которые являются избирательно токсичными по отношению к насекомым и, вероятно, по отношению к другим беспозвоночным. В настоящее время инсектициды имеют огромное значение для контроля насекомых, которые повреждают сельскохозяйственные продукты, включая зерновые и домашний скот. Инсектициды также используют в домашней обстановке человека для борьбы с вредителями газонов и садов, а также насекомыми, которые вредят или раздражают человека, включая жалящих или кусающих насекомых, мух и тараканов. Инсектициды также имеют важное значение для лечения или профилактики патологических состояний, вызванных эктопаразитами, включая блох, вшей, иксодовых клещей, клещей и кусающих двукрылых, у домашнего скота и домашних животных. Однако современные химические средства, используемые в качестве инсектицидов, не оптимальны. Некоторые обладают очевидной токсичностью для млекопитающих, в то время как у некоторых видов-мишеней к некоторым из них возникает резистентность. Поэтому существует необходимость в новых избирательных инсектицидах, которые имеют новые механизмы действия.

Известны примеры GPCR насекомых, которые имеют нейропептидные лиганды (см., например, Li, et al., EMBO Journal, 1991, 10, 3221-3229; Li, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 9-12; Monnier, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 1298-1302; Vanden Broeck, et al., Int. Rev. Cytology, 1996, 164, 189-268; Guerrero, Peptides, 1997, 18, 1-5; Hauser, et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 1002-1010; Birgul et al., EMBO J., 1999, 18, 5892-5900; Torfs et al., J. Neurochem., 2000, 74, 2182-2189; and Hauser et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1998, 249, 822-828; Larsen, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, 286, 895-901; Lenz, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, 286, 1117-1122; Kubiak et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 291, 313-320; Staubli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 3446-3451; Garczynski et al., Peptides, 2002, 23, 773-780), Holmes et al. Insect Molecular Biology, 2000, (5), 457-465; Cazzamali et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 12073-12078; Cazzamali et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 298, 31-36; Radford et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 38810-38817; Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 11423-11428; Kreienkamp et al., J. Biol. Chem, 10.1074/jbc.M206931200 (published online 6 August 2002) and Mertens, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 297, 1140-1148. Новые родственные заявки на выдачу патента: Ebens, Allen James, Jr.; Torpey, Justin; Keegan, Kevin Patrick. Nucleic acids and polypeptides of Drosophila melanogaster G protein-coupled receptor and their use as pesticidal and pharmaceutical targets. PCT Int. Appl. (2001), 43 pp.CODEN: PIXXD2 WO 0170981 A2 20010927 CAN 135:268323 AN 2001:713564 CAPLUS. Kravchik, Anibal. Drosophila G protein-coupled receptors, genomic DNA and cDNA molecules encoding GPCR proteins, and their uses as insecticidal targets. PCT Int. Appl. (2001), 392 pp.CODEN: PIXXD2 WO 0170980 A2 20010927 CAN 135:269068 AN 2001:713563 CAPLUS.

Большим семейством пептидов, как правило, длиной 4-12 аминокислот, обычно обнаруживаемых у беспозвоночных животных (например, насекомых), является класс нейропептидов, известных как FMRFамид-родственные пептиды (т.е. FaRP). Прототипные пептиды FMRFамид (FMRFa) называются так из-за консенсусной аминокислотной последовательности «FMRF» на их C-концах, как правило, состоящих из (F,Y)(M,V,I,L)R(F,Y)NH₂. В качестве нейропептидов указанные молекулы вовлечены в жизненно важные биологические процессы, требующие контролируемой нейромышечной активности. Хотя показано, что некоторые нейромедиаторы и нейромодуляторы (включая нейропептиды) функционируют в качестве лигандов для рецепторов, до настоящего времени не идентифицирован нейропептид FaRP в качестве лиганда GPCR.

Пептиды Drosophila, содержащие консервативный мотив FXGXR-амид, структурно родственны тахикининам млекопитающих и поэтому названы новым термином дротахикининов (Siviter et al., J. Biol. Chem., 2000, 275 (30), 23273-23280). Дротахикинины оказывают мощное стимулирующее действие на сокращение кишечника насекомых (там же).

Лейкокинины представляют собой группу широко распространенных гормонов насекомых, которые стимулируют моторику кишечника и скорости секреции жидкости канальцами. В канальцах их главное действие заключается в повышении проницаемости для хлоридов посредством связывания с рецептором на базолатеральной мембране. Лейкокинин действует, повышая внутриклеточное содержание кальция только в звездчатых клетках (O'Donnell et al., J. Physiol., 1998, 43, R1039-R1049).

Аллатостатины представляют собой важную группу нейрогормонов насекомых, контролирующих разнообразные функции, включая синтез ювенильных гормонов, которые, как известно, играют центральную роль в метаморфозе и репродукции у различных видов насекомых. Самый первый аллатостатин Drosophila, Ser-Arg-Pro-Tyr-Ser-Phe-Gly-Leu-NH₂ (т.е. дростатин-3) (SEQ ID NO: 165) выделяли из экстрактов голов Drosophila (Birgul et al., EMBO J., 1999, 18, 5892-5900). Недавно клонирован ген препрогормона аллатостатина Drosophila, который кодирует четыре аллатостатина Drosophila: Val-Glu-Arg-Tyr-Ala-Phe-Gly-Leu-NH₂ (дростатин-1) (SEQ ID NO: 163), Leu-Pro-Val-Tyr-Asn-Phe-Gly-Leu-NH₂ (дростатин-2) (SEQ ID NO: 164), Ser-Arg-Pro-Tyr-Ser-Phe-Gly-Leu-NH₂ (дростатин-3) (SEQ ID NO: 165) и Thr-Thr-Arg-Pro-Gln-Pro-Phe-Asn-Phe-Gly-Leu-NH₂ (дростатин-4) (SEQ ID NO: 166) (Lenz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2000, 273, 1126-1131). Первый рецептор аллатостатина Drosophila клонирован Birgul et al. и было показано, что он функционально активируется дростатином-3 посредством Gi/Go-путей (Birgul et al., EMBO J. 1999, 18, 5892-5900). Недавно клонирован второй предполагаемый рецептор аллатостатина Drosophila (т.е. DARII) (Lenz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2000, 273, 571-577). кДНК рецептора DARII (номер доступа AF253526) кодирует белок, который является близкородственным первому рецептору аллатостатина Drosophila. Недавно показана функциональная активация DARII аллатостатинами авторами данного изобретения (Larsen et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, 286, 895-901) и другими авторами (Lenz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, 286, 1117-1122). Недавно клонирован ген препрогормона аллатостатина типа C Drosophila, который кодирует аллатостатин-С Drosophila: Gln-Val-Arg-Tyr-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH (Williamson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2001, 282, 124-130). Зрелый пептид должен иметь pGlu на N-конце, образованный в результате циклизации N-концевого Gln, чтобы получить pGlu-Val-Arg-Tyr-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH (SEQ ID NO: 183), и дисульфидный мостик между Cys6 и Cys13, подобно аллатостатину типа C Manduca sexta, pGlu-Val-Arg-Phe-Gln-Cys-Tyr-Phe-Asn-Pro-Ile-Ser-Cys-Phe-OH (SEQ ID NO: 182), который отличается только по положению 4 (Phe4 вместо Tyr4) (Kramer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 9458-9462). Nichols at al. показали сильное и продолжительное ингибирование мышечного сокращения аллатостатином-C Drosophila, который назвали пептидом «ровной линии» (FLT) (Nichols et al. Peptides, 2002, 23, 787-794). Насколько известно авторам, до настоящего времени не идентифицированы рецепторы аллатостатина типа C насекомых.

Сульфакинины представляют собой семейство Tyr-сульфатированных нейропептидов насекомых. Они проявляют сходство последовательностей и функциональное сходство (миотропные эффекты, стимуляция высвобождения ферментов пищеварения) с пептидами позвоночных гастрином и холецистокинином. У Drosophila melanogaster идентифицирован ген, кодирующий два сульфакинина (также называемых дросульфакининами), DSKI [Phe-Asp-Asp-Tyr(SO₃H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-амид] (SEQ ID NO: 160) и DSKII [Gly-Gly-Asp-Asp-Gln-Phe-Asp-Asp-Tyr(SO₃H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-амид] (SEQ ID NO: 161) (Nichols, Mol. Cell Neuroscience, 1992, 3, 342-347; Nichols et al., J. Biol. Chem., 1988, 263, 12167-12170). C-концевая гептапептидная последовательность, Asp-Tyr(SO₃H)-Gly-His-Met-Arg-Phe-амид (SEQ ID NO: 162), идентична во всех сульфакининах, идентифицированных до настоящего времени у насекомых, которые значительно удалены друг от друга в эволюционном смысле. Консервативность гептапептидной последовательности, включая наличие сульфатированного остатка Tyr в значительной степени дивергентном таксоне насекомых, вероятно, отражает функциональное значение данного миотропного «активного кора» (Nachman and Holman, in Insect Neuropeptides: Chemistry, Biology and Action, Menu, Kelly and Massler, Eds., American Chemical Society, Washington, D. C., 1991, pp.194-214). Недавно авторы изобретения идентифицировали сиротский рецептор Drosophila (DmGPCR9) в качестве рецептора дросульфакинина (названного DSK-R1) и подобрали соответствующий ему активирующий пептид, Met5→Leu-модифицированный дросульфакинин-1, Asp-Tyr(SO₃H)-Gly-His-Leu-Arg-Phe-амид (SEQ ID NO: 157) (Kubiak et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 291, 313-320). Новые GPCR Drosophila, которые уже переведены из разряда сиротских, включают рецепторы для пептидов PRXамид, CCAP, коразонина и AKH (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 11423-11428; Cazzamali et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 298, 31-36); лейкокинина (Radford et. al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 38810-38817); дростатина-C (Kreienkamp et al., J. Biol. Chem, 10.1074/jbc. M206931200 (опубликовано в оперативном режиме 6 августа 2002)); FMRFамид (Cazzamali et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 12073-12078) и нейропептида F (Mertens, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2002, 297, 1140-1148).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение заключается в неожиданном открытии новых полипептидов у Drosophila melanogaster, называемых в данном описании DmGPCR (сопряженные с G-белком рецепторы Drosophila melanogaster), которые проявляют различные степени гомологии с другими GPCR нейропептидов. Данное изобретение относится к генам, кодирующим указанные неизвестные ранее сопряженные с G-белком рецепторы, полипептидам DmGPCR, кодируемым данными генами; антителам к полипептидам; наборам, в которых используют полинуклеотиды и полипептиды, и способам получения и применения указанного выше. DmGPCR могут играть роль в качестве ключевого компонента, например, в регуляции связывания нейропептидов и/или передачи сигнала. Таким образом, DmGPCR применимы при поиске новых агентов, которые могут модифицировать и/или регулировать связывание и/или передачу сигнала нейропептидами или другими агентами. Указанные и другие аспекты изобретения описаны ниже.

В некоторых вариантах в изобретении предлагаются очищенные и изолированные полипептиды DmGPCR, содержащие аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24, или ее фрагмент, содержащий эпитоп, характерный для DmGPCR. Под «эпитопом, характерным для» подразумевается часть рецептора DmGPCR, которая узнается антителом, специфичным в отношении DmGPCR, что подробно определено ниже. Один вариант изобретения включает в себя очищенные и изолированные полипептиды, содержащие полные аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24, приведенных в таблице 4 ниже. Указанные аминокислотные последовательности рассчитаны на основе полинуклеотидных последовательностей, кодирующих DmGPCR (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23, приведенных в таблице 4 ниже). Подразумевается, что термин «DmGPCR», используемый в данном описании в единственной форме охватывает любую из десяти аминокислотных последовательностей, приведенных в качестве примера ниже, кодируемых соответствующими полинуклеотидными последовательностями.

Хотя представленные последовательности являются конкретными последовательностями Drosophila, подразумевается, что в объем изобретения включены аллельные варианты, формы DmGPCR позвоночных и беспозвоночных.

В некоторых вариантах в изобретении предлагаются очищенные и изолированные полинуклеотиды (например, кДНК, геномная ДНК, синтетическая ДНК, РНК или их комбинации, либо однонитевые, либо двунитевые), которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность полипептидов согласно изобретению. Такие полинуклеотиды применимы для рекомбинантной экспрессии рецептора, а также для регистрации экспрессии рецептора в клетках (например, с использованием анализов Нозерн-гибридизации и гибридизации in situ). Такие полинуклеотиды также применимы для конструирования антисмысловых и других молекул для супрессии или регуляции экспрессии DmGPCR в культивируемой клетке, ткани или животном. Из определения полинуклеотидов согласно изобретению, в частности, исключены полные изолированные нерекомбинантные нативные хромосомы клеток-хозяев. Полинуклеотиды согласно изобретению могут иметь последовательность любой из последовательностей, указанных SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23, которые соответствуют встречающимся в природе последовательностям DmGPCR. Будет понятно, что существует множество других полинуклеотидных последовательностей, которые также кодируют DmGPCR, имеющих последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24, вследствие хорошо известной вырожденности универсального генетического кода.

Изобретение также относится к очищенному и изолированному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид млекопитающих, при этом полинуклеотид гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23, или с некодирующей нитью, комплементарной данной, в следующих условиях гибридизации:

a) гибридизация в течение 16 часов при 42°C в растворе для гибридизации, содержащем 50% формамид, 1% SDS, 1 М NaCl, 10% сульфат декстрана; и

b) промывка 2 раза по 30 минут, каждая при 60°C в растворе для промывки, содержащем 0,1% SSC, 1% SDS.

Условия гибридизации должны быть такими, чтобы гибридизация в присутствии других молекул нуклеиновых кислот происходила только с генами. В жестких условиях гибридизации гибридизуются только высококомплементарные последовательности нуклеиновых кислот. Такие условия могут препятствовать гибридизации нуклеиновых кислот, имеющих 1 или 2 ошибочных спаривания из 20 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов.

В некоторых вариантах в изобретении предлагаются векторы, содержащие полинуклеотид согласно изобретению. Такие векторы применимы, например, для амплификации полинуклеотидов в клетках-хозяевах для образования достаточных для применения количеств полинуклеотидов. В некоторых вариантах вектор является экспрессирующим вектором, в котором полинуклеотид согласно изобретению оперативно связан с полинуклеотидом, содержащим последовательность регуляции экспрессии. Такие векторы применимы для рекомбинантного получения полипептидов согласно изобретению.

В некоторых вариантах изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые трансформируют или трансфицируют (стабильно или временно) полинуклеотидами согласно изобретению или векторами согласно изобретению. Как указано выше, такие клетки-хозяева применимы для амплификации полинуклеотидов, а также для экспрессии полинуклеотида DmGPCR или его фрагмента, кодируемого полинуклеотидом.

В еще одном варианте изобретение относится к способам получения полипептида DmGPCR (или его фрагмента), включающим в себя стадии выращивания клетки-хозяина согласно изобретению в питательной среде и выделения полипептида или его варианта из клетки или среды. Так как DmGPCR является рецептором с семью трансмембранными доменами, будет понятно, что для некоторых применений, таких как некоторые анализы активности, выделение может заключаться в выделении клеточным мембран, содержащих заключенный в них полипептид, тогда как для других применений может требоваться более полное выделение.

Будет понятно, что внеклеточные эпитопы, в частности, применимы для создания и скрининга антител или других связывающих соединений, которые связываются с рецепторами, такими как DmGPCR. Таким образом, в другом варианте изобретение относится к очищенному и изолированному полипептиду, содержащему по меньшей мере один внеклеточный домен (например, N-концевой внеклеточный домен или одну из трех внеклеточных петель) DmGPCR, такой как N-концевой внеклеточный домен DmGPCR. Также в изобретение включены очищенные полипептиды, содержащие трансмембранные домены DmGPCR, внеклеточную петлю, связывающую трансмембранные домены DmGPCR, внутриклеточную петлю, связывающую трансмембранные домены DmGPCR, C-концевую цитоплазматическую область DmGPCR и их слияния. Такие фрагменты могут представлять собой непрерывные части нативного рецептора. Однако также будет понятно, что сведения о последовательностях гена и белка DmGPCR, которые приведены в данном описании, позволяют осуществлять рекомбинацию различных доменов, которые не следуют друг за другом в нативном белке.

В еще одном варианте изобретение относится к антителам, специфичным в отношении DmGPCR согласно изобретению. Специфичность антител более подробно описана ниже. Однако следует подчеркнуть, что антитела, которые могут быть созданы на основе полипептидов, которые были описаны ранее в литературе и которые способны случайно перекрестно реагировать с DmGPCR (например, вследствие случайного существования сходного эпитопа в обоих полипептидах), считаются «перекрестно-реагирующими» антителами. Такие перекрестно-реагирующие антитела не являются антителами, «специфичными» в отношении DmGPCR. Определение того, является ли антитело специфичным в отношении DmGPCR или перекрестно-реагирующим с другим известным рецептором, осуществляют с использованием любого из нескольких анализов, таких как Вестерн-блоттинг-анализ, который хорошо известен в данной области. Для идентификации клеток, которые экспрессируют DmGPCR, а также для модулирования активности связывания DmGPCR-лиганд можно использовать антитела, которые специфически связываются с внеклеточным эпитопом DmGPCR.

В одном варианте изобретение относится к моноклональным антителам. Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, также считаются аспектами изобретения.

В другом варианте изобретение относится к бесклеточной композиции, содержащей поликлональные антитела, в которой по меньшей мере одно из антител является антителом согласно изобретению, специфичным в отношении DmGPCR. Примером композиции являются антисыворотки, выделенные из животного, также как композиция, содержащая фракцию антител антисыворотки, которая была ресуспендирована в воде или в другом разбавителе, эксципиенте или носителе.

В еще одном связанном варианте изобретение относится к антиидиотипическим антителам, специфичным к антителу, которое специфично в отношении DmGPCR.

Также хорошо известно, что антитела содержат относительно небольшие антигенсвязывающие домены, которые можно выделить химически или рекомбинантными способами. Такие домены сами по себе являются применимыми молекулами, связывающими DmGPCR, а также могут быть слиты с токсинами или другими полипептидами. Таким образом, в еще одном варианте изобретение относится к полипептиду, содержащему фрагмент DmGPCR-специфичного антитела, при этом фрагмент и полипептид связываются с DmGPCR. В качестве неограничивающего примера изобретение относится к полипептидам, которые являются одноцепочечными антителами, CDR-привитыми антителами и гуманизированными антителами.

Также в объем изобретения входят композиции, содержащие полипептиды, полинуклеотиды или антитела согласно изобретению, которые были приготовлены, например, с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение также относится к способам применения антител согласно изобретению. Например, изобретение относится к способам модулирования связывания лиганда DmGPCR, включающим в себя стадию осуществления контакта DmGPCR с антителом, специфичным в отношении DmGPCR, в условиях, при которых антитело связывается с рецептором.

Изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа у субъекта против полипептида, содержащего последовательность из группы SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 24, или его гомолога или фрагмента. Способы включают в себя введение субъекту количества полипептида, достаточного для индуцирования иммунного ответа.

Изобретение также относится к анализам для идентификации соединений, которые связывают DmGPCR. Один из таких анализов включает в себя стадии (a) осуществления контакта композиции, содержащей DmGPCR, с соединением, которое предположительно связывается с DmGPCR; и (b) измерения связывания между соединением и DmGPCR. В одном варианте композиция содержит клетку, экспрессирующую DmGPCR на своей поверхности. В другом варианте используют изолированный DmGPCR или клеточные мембраны, содержащие DmGPCR. Связывание можно измерять непосредственно, например, используя меченое соединение, или можно измерять опосредованно несколькими способами, включая измерение внутриклеточной передачи сигнала DmGPCR, индуцированной соединением (или измерение изменений уровня передачи сигнала DmGPCR).

Изобретение также относится к способам связывания DmGPCR со связывающим партнером. Способы включают в себя стадии (a) осуществление контакта композиции, содержащей DmGPCR, со связывающим партнером и (b) обеспечение возможности для связывания связывающего партнера с DmGPCR. Например, DmGPCR может представлять собой DmGPCR1 (SEQ ID NO: 1), DmGPCR5 (SEQ ID NO: 9), DmGPCR7 (SEQ ID NO: 17) или DmGPCR8 (SEQ ID NO: 19). Связывающим партнером может быть, например, дротахикинин, лейкокинин или аллатостатин-C. Дротахикинин (DTK) может представлять собой, например, DTK-1 (SEQ ID NO: 169), Met8-DTK-2 (SEQ ID NO: 170), DTK-2 (SEQ ID NO: 171), DTK-3 (SEQ ID NO: 172), DTK-4 (SEQ ID NO: 173) и DTK-5 (SEQ ID NO: 174). Лейкокинин (LK) может представлять собой, например, LK-I (SEQ ID NO: 175), LK-V (SEQ ID NO: 176), LK-VI (SEQ ID NO: 177) и LK-VIII (SEQ ID NO: 178), кулекинин (SEQ ID NO: 179), пептид подобный лейкокинину моллюсков, лимнокинин (PSFHSWSa) (SEQ ID NO: 180) и лейкокининподобные пептиды Drosophila DLK-1(NSVVLGKKQRFHSWGa) (SEQ ID NO: 181), DLK-2 (pGlu-RFHSWGa) (SEQ ID NO: 182) и DLK-2A (QRFHSWGa) (SEQ ID NO: 183). Аллатостатин (AST) может представлять собой, например, AST-C (SEQ ID NO: 184) или DST-C (SEQ ID NO: 185). Другие связывающие партнеры включают без ограничения SEQ ID NO: 186 и SEQ ID NO: 187.

Изобретение также относится к способам идентификации модулятора связывания DmGPCR с партнером, связывающим DmGPCR, включающим в себя стадии (a) осуществления контакта партнера, связывающего DmGPCR, и композиции, содержащей DmGPCR, в присутствии и в отсутствие предполагаемого соединения модулятора; (b) регистрации связывания между связывающим партнером и DmGPCR; и (c) идентификации предполагаемого соединения модулятора или соединения модулятора, принимая во внимание уменьшенное или увеличенное связывание между связывающим партнером и DmGPCR в присутствии предполагаемого модулятора по сравнению со связыванием в отсутствие предполагаемого модулятора. Например, DmGPCR может представлять собой DmGPCR5 (SEQ ID NO: 9), DmGPCR7 (SEQ ID NO: 17) или DmGPCR8 (SEQ ID NO: 19). Связывающим партнером может быть, например, дротахикинин, лейкокинин или аллатостатин. Дротахикинин (DTK) может представлять собой, например, DTK-1 (SEQ ID NO: 169), Met8-DTK-2 (SEQ ID NO: 170), DTK-2 (SEQ ID NO: 171), DTK-3 (SEQ ID NO: 172), DTK-4 (SEQ ID NO: 173) и DTK-5 (SEQ ID NO: 174). Лейкокинин (LK) может представлять собой, например, LK-I (SEQ ID NO: 175), LK-V (SEQ ID NO: 176), LK-VI (SEQ ID NO: 177) и LK-VIII (SEQ ID NO: 178), кулекинин (SEQ ID NO: 179), лейкокининподобный пептид моллюсков, лимнокинин (PSFHSWSa) (SEQ ID NO: 180) и лейкокининподобные пептиды Drosophila DLK-1 (NSVVLGKKQRFHSWGa) (SEQ ID NO: 181), DLK-2 (pGlu-RFHSWGa) (SEQ ID NO: 182) и DLK-2A (QRFHSWGa) (SEQ ID NO: 183). Аллатостатин (AST) может представлять собой, например, AST-C (SEQ ID NO: 184) или DST-C (SEQ ID NO: 185). В одном варианте композиция содержит клетку, экспрессирующую DmGPCR на своей поверхности. В другом варианте используют изолированный DmGPCR или клеточные мембраны, содержащие DmGPCR. Связывание можно измерять непосредственно, например, используя меченое соединение, или можно измерять опосредованно несколькими способами, включая измерение внутриклеточной передачи сигнала DmGPCR, индуцированной соединением (или измерение изменений уровня передачи сигнала DmGPCR). Например, функцию можно измерить анализом индуцированного агонистом связывания [35S]GTPγS, анализом цАМФ (индукция или ингибирование продукции цАМФ) или измерением внутриклеточных уровней кальция с использованием анализа с помощью считывающего устройства для флуориметрической визуализации планшетов (FLIPR).

Партнеры, связывающие DmGPCR, которые стимулируют активность DmGPCR, применимы в качестве агонистов для усиления или пролонгирования передачи сигнала DmGPCR и, таким образом, для вмешательства в нормально активируемые пути передачи сигнала рецептора. Партнеры, связывающие DmGPCR, которые блокируют опосредованную лигандом передачу сигнала DmGPCR, применимы в качестве антагонистов DmGPCR для того, чтобы вмешаться в нормальную передачу сигнала DmGPCR и ослабить опосредованные рецептором эффекты. Кроме того, модуляторы DmGPCR, а также полинуклеотиды и полипептиды DmGPCR применимы в диагностических анализах статуса или состояний, при которых активность DmGPCR повышена или ослаблена.

В другом аспекте изобретение относится к способам лечения заболевания или патологического состояния, вызванного эктопаразитом, посредством введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вещества, которое модулирует активность или экспрессию полипептида эктопаразита, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24.

Вещества, применимые для лечения расстройств или заболеваний, вызванных эктопаразитом, могут давать положительные результаты в одном или нескольких анализах in vitro в отношении активности, соответствующей лечению рассматриваемого заболевания или расстройства. Вещества, которые модулируют активность полипептидов, включают, но не ограничены указанным, антисмысловые олигонуклеотиды, агонисты и антагонисты и антитела.

В другом аспекте отличительным признаком изобретения являются способы выявления полипептида в образце в качестве диагностического средства в случае заболеваний или расстройств, вызванных эктопаразитом, при этом способы включают в себя стадии: (a) осуществления контакта образца с зондом нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях анализа гибридизации с областью нуклеиновой кислоты-мишени, кодирующей полипептиды, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24, при этом указанный зонд содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ее фрагменты и/или комплементы последовательностей или фрагментов; и (b) выявления присутствия или количества гибрида зонд:область-мишень в качестве показателя состояния.

Тестируемые образцы, подходящие для способов зондирования нуклеиновых кислот согласно данному изобретению, включают, например, клетки или экстракты нуклеиновых кислот клеток или биологические жидкости. Образцы, используемые в описанных выше способах, будут варьироваться в зависимости от формы анализа, способа регистрации и природы анализируемых тканей, клеток или экстрактов. Способы получения экстрактов нуклеиновых кислот из клеток хорошо известны в данной области и могут быть легко адаптированы для получения образца, который совместим с применяемым способом.

В некоторых вариантах данное изобретение относится к гомологам DmGCPR, таким как гомологи млекопитающих. Гомологи DmGPCR млекопитающих могут экспрессироваться в тканях, включая, но не ограничивая указанным, ткани нервной системы, поджелудочной железы (и особенно ткани островков поджелудочной железы), гипофиза, скелетной мышцы, жировой ткани, печени, желудочно-кишечного (ЖК) тракта и щитовидной железы.

В некоторых вариантах данное изобретение относится к способам идентификации гомолога DmGPCR млекопитающего, включающим в себя стадии скрининга базы данных нуклеиновых кислот или библиотеки нуклеиновых кислот млекопитающего, используя молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 23, или ее часть, и определения того, гомологична ли часть базы данных или библиотеки данной последовательности.

Другой аспект изобретения относится к способам контролирования популяции насекомых посредством введения связывающего партнера или модулятора полинуклеотида или полипептида DmGPCR насекомому, чтобы модифицировать экспрессию или активность DmGPCR. Например, насекомое может быть выбрано из группы, состоящей из мухи, плодовой мушки, иксодового клеща, блохи, вши, клеща и таракана.

Партнером, связывающим DmGPCR, может быть дротахикинин (например, DTK-1 (SEQ ID NO: 169), Met8-DTK-2 (SEQ ID NO: 170), DTK-2 (SEQ ID NO: 171), DTK-3 (SEQ ID NO: 172), DTK-4 (SEQ ID NO: 173) и DTK-5 (SEQ ID NO: 174)), лейкокинин (например, LK-I (SEQ ID NO: 175), LK-V (SEQ ID NO: 176), LK-VI (SEQ ID NO: 177) и LK-VIII (SEQ ID NO: 178), кулекинин (SEQ ID NO: 179), подобный лейкокинину пептид моллюсков, лимнокинин (PSFHSWSa) (SEQ ID NO: 180), DLK-1 (SEQ ID NO: 181), DLK-2 (SEQ ID NO: 182) и DLK-2A (QRFHSWGa) (SEQ ID NO: 183)) или аллатостатин (AST-C (SEQ ID NO: 184) или DST-C (SEQ ID NO: 185)). Другие связывающие партнеры включают без ограничения SEQ ID NO: 186 и SEQ ID NO: 187. Модулятором DmGPCR может быть анти-DmGPCR-антитело или антисмысловой полинуклеотид DmGPCR.

Другие варианты изобретения относятся к способам профилактики или лечения заболевания или состояния, вызванного эктопаразитом у субъекта-хозяина, посредством введения субъекту связывающего партнера или модулятора полинуклеотида или полипептида DmGPCR, чтобы модифицировать экспрессию или активность DmGPCR.

Дополнительные отличительные признаки или варианты изобретения будут очевидны для специалистов в данной области на основании данной заявки в целом, включающей подробное описание, и все такие отличительные признаки считаются аспектами изобретения. Подобным образом, отличительные признаки изобретения, указанные в данном описании, можно перекомбинировать в дополнительных вариантах, которые также рассматриваются как аспекты изобретения, независимо от того упоминается ли указанная выше комбинация отличительных признаков специально в качестве аспекта или варианта осуществления изобретения. Также только те ограничения, которые указаны в данном описании в качестве критически важных ограничений для данного изобретения, следует считать таковыми; подразумевается, что изменения изобретения, лишенные ограничений, которые не приведены в данном описании в качестве критически важных, являются аспектами изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Данное изобретение наряду с прочим относится к изолированным и очищенным полинуклеотидам, которые кодируют сопряженный с G-белком рецептор D. melanogaster (DmGPCR) или его часть, векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, клеткам-хозяевам, трансформированным указанными векторами, способам получения DmGPCR, способам применения указанным выше полинуклеотидов и векторов, к изолированному и очищенному DmGPCR, способам скрининга соединений, которые модулируют активность DmGPCR, и способам идентификации гомологов DmGPCR млекопитающих, позвоночных или беспозвоночных.

На протяжении данного документа приводятся различные определения. Большинство слов имеют значение, которое приписывает данным словам специалист в данной области. Слова, специально определенные либо ниже, либо в другом месте данного документа, имеют значение, которое предусмотрено в контексте данного изобретения в целом, и которое обычно понимается специалистами в данной области.

Необходимо понимать, что когда указаны группы последовательностей, то также специально предполагаются их комбинации и субкомбинации. Например, в случае описания «SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 23» следует понимать, что данное изобретение включает комбинации и субкомбинации, включая, но не ограничивая указанным, SEQ ID NO: 1 и 3; 1 и 5; 1, 3 и 5 и т.д.

«Синтезированный» в используемом в данном описании и понимаемом в данной области смысле относится к полинуклеотидам, полученным исключительно химическими способами, в противоположность ферментативным способам. Следо