Штамм бактерий vibrio cholerae - продуцент холерного токсина ii типа

Штамм бактерий vibrio cholerae - продуцент холерного токсина ii типа

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к конструированию штамма с повышенной продукцией холерного токсина II типа, и может быть использовано при создании химических вакцин нового поколения, а также при конструировании иммуноферментных диагностических тест-систем. Кроме того, данное изобретение может использоваться в молекулярно-генетических исследованиях, направленных на изучение нового механизма регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности у патогенных бактерий.

Холерный токсин II типа, продуцируемый холерными вибрионами биовара эльтор и отличающийся по антигенным свойствам от холерного токсина I типа, который синтезируют V. cholerae классического биовара, является необходимым компонентом поливалентных химических холерных вакцин, формирующим антитоксический иммунитет при холере. Этот иммуногенный белок входит также в состав иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов холерного вибриона биовара эльтор.

Известен штамм Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии (патент РФ №2169187, С12N 1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин I и II типов - 48-60 мкг/мл, по данным иммуноферментного анализа GM₁ ELISA.

Природные штаммы V.cholerae биовара эльтор, используемые в производстве холерных вакцин, в условиях in vitro образуют незначительное количество холерного токсина II типа - менее 0,1 мкг/мл (Mekalanos J.J., Duplikation and amplifikation of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. - 1983. - V. - 253-263), ввиду чего их использование в промышленных условиях является маловероятным.

Среди экспериментально полученных штаммов известен штамм V.cholerae биовара эльтор серовара Огава КМ1446/рСО107-2, описанный в авторском свидетельстве СССР №1412306, С12N 15/00 и синтезирующий 5 мкг/мл холерного токсина. Довольно высокий уровень продукции этого белка обусловлен присутствием в клетках рекомбинантной плазмиды рСО107-2, несущей клонированные гены холерного токсина (ctxAB) и ген резистентности к канамицину (kan). В то же время при отсутствии селективного давления (канамицина в среде выращивания) стабильность наследования рекомбинантной плазмиды составляет 70-80%, что ведет к снижению продукции XT. Необходимость добавления в среду выращивания антибиотика затрудняет технологию культивирования штамма в производственных условиях.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм V.cholerae KM195 - продуцент холерного токсина II типа (патент РФ №2172776, МКИ: С12N 1/20, 1/21, А61К 39/106). Штамм получен экспериментальным путем, при инфицировании клеток V.cholerae биовара эльтор умеренным холерным фагом 139. Полученные лизогенные клетки продуцировали в среду выращивания 7,0 мкг/мл (по данным GM₁ ELISA). Однако указанный штамм содержит в хромосоме умеренный фаг 139, способный индуцировать вторичные генетические перестройки в геноме, которые могут привести к возникновению нетоксигенных вариантов.

Сущность изобретения состоит в конструировании штамма холерного вибриона биовара эльтор с высокой и стабильной продукцией холерного токсина II типа.

Для создания штамма с заданными свойствами был использован транспозонный мутагенез профага СТХϕ, содержащего гены асе, zot и ctxAB, в результате которого повысилась экспрессия структурных генов холерного токсина (ctxAB). Штамм сконструирован путем введения в клетки природного штамма V.cholerae MAK757 биовара эльтор конъюгативной плазмиды pSUP5011 (Ap^RCm^R), несущей транспозон Tn5-Mob (Km^R). При последующем культивировании плазмидного штамма при 4°С в бульоне с добавлением канамицина отбирают трансконъюганты Km^RAp^SCm^S, утратившие плазмиду, но сохранившие транспозон, внедренный в ген zot профага СТХϕ. В результате реорганизации генома профага в полученном штамме MAK757 zot::TnMob (Km^RTox⁺) происходит значительное усиление экспрессии генов холерного токсина.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (г.Саратов) под номером КМ234.

Заявленный штамм характеризуется следующими признаками:

- имеет высокий уровень продукции холерного токсина II типа - 45,0 мкг/мл (по данным иммуноферментного анализа GM₁ELISA);

- генетически маркирован за счет внедрения транспозона Tn5-mob в ген zot;

- стабилен - сохраняет указанные свойства при хранении и культивировании на питательных средах.

Культурально-морфологические признаки.

Слабоподвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах через 18-24 часа роста при 37°С формируют круглые серовато-голубые полупрозрачные колонии с ровными краями; в бульоне образуют равномерное помутнение. Штамм растет на простых питательных средах и на средах с добавлением канамицина (50 мг/мл). Прототроф.

Физиологические свойства.

Не лизирует эритроциты барана, агглютинирует куриные эритроциты, растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Не ферментирует лактозу и арабинозу, ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу до кислоты без газа. Агглютинируется до титра специфическими диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу «Эльтор». Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Пример 1, свидетельствующий о высокой продуктивности штамма.

Определение продукции холерного токсина. Продукцию холерного токсина определяют с помощью радиального пассивного гемолиза (РПИГ) на плотной среде и иммуноферментным методом GM₁ ELISA.

РПИГ, чувствительность которого составляет 0,2 мкг/мл, ставят по методу Bramucei M.G., Holmes R.K. (1978), модифицированному Шагиняном И.А., Маракушей Б.М. (Шагинян И.А., Маракуша Б.М. // Журн. Микробиол. - 1983. - №7. - С.92-96). Колонии изучаемых штаммов методом реплик переносят на чашки с 1,0% синказным агаром, содержащим 1,0% отмытых в синказном бульоне эритроцитов барана. Посевы инкубируют 18 ч при 30°С, заливают слоем 0,5% синказного агара, содержащего азид натрия, комплемент морской свинки и монорецепторную антитоксическую сыворотку (АТС) и помещают в термостат на 1-2 ч при 37°С. По истечении указанного срока вокруг макроколоний созданного штамма КМ234 формируется четкая зона иммунного гемолиза размером в 2-2,5 мм, тогда как вокруг макроколоний исходного штамма МАК757 эта зона отсутствует.

Для количественного определения холерного токсина применяют иммуноферментный метод GM₁ ELISA (Svennerholm A.-M., Wikland G., 1983). В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Исходную культуру штамма КМ234 выращивают в казаминовом бульоне (казаминовые кислоты - 30 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, рН 7,6) в течение 16-18 часов в условиях интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут и в супернатанте определяют содержание холерного токсина следующим образом. Пробы инкубируют в течение двух часов при 37°С в лунках микроплат, предварительно заблокировав неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37°С. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченные пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS (2.2 azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulphonate). Чуствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ234 рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток.

Согласно данным иммуноферментного метода GM₁ ELISA, заявленный штамм продуцирует в 2250 раз больше холерного токсина (45 мкг/мл) по сравнению с исходным (0,02 мкг/мл). По сравнению с известным штаммом продуцентом холерного токсина II типа V.cholerae eitor KM195 по патенту РФ №2172776 (7 мкг/мл) уровень продукции холерного токсина у заявленного штамма в 6,4 раза выше.

Пример 2, указывающий на присутствие в геноме профага СТХϕ транспозона Тп5-mob.

Используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) со специфическими с праймерами на гены ctxA, ctxB, асе, zot, входящие в состав профага СТХϕ. Клетки 18-часовой культуры, выращенные на LB агаре, ресуспензируют в 1 мл физиологического раствора до концентрации 10⁹ клеток в 1 мл, затем титрованием в дистиллированной воде доводят до конечной концентрации 10⁷ клеток в 1 мл. Далее клетки лизируют путем кипячения в течение 30 минут и после центрифугирования при 12000 g в течение 5 мин супернатант в количестве 10 мкл используют для исследования в ПЦР. К образцу добавляют растворы олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе нуклеотидных последовательностей генов ctxA, ctxB, асе, zot - по 0,4 мкл каждого, 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера, 2,5 мкл раствора дНТФ, 1 мкл 50 мМ раствора хлорида магния, 0,25 мкл Tag-полимеразы и 7,95 мкл деионизированной воды.

В качестве положительного контроля используют ДНК из типичного токсигенного штамма 0139-серогруппы V. cholerae PI 6064, а также исходного штамма V. cholerae МАК757. В отрицательный контроль вносили 10 мкл деионизированной воды.

ПЦР проводят при следующих температурных режимах: 1-й цикл - 95°С - 5 мин; 2-35-й циклы, включающие: денатурацию при 95°С - 30 сек, отжиг при 60°С - 30 сек и синтез при 72°С - 30 сек; 36-й цикл - синтез в течение 7 минут при 72°С.

Результаты ПЦР учитывают с помощью электрофореза при 80 В в течении 35 минут в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мкл/мл бромида этидия, с последующим просмотром геля в УФ-свете. По данным ПЦР-анализа в геноме исходного штамма МАК757 присутствуют все тестируемые гены профага асе, zot, ctxA и ctxB. В созданном штамме КМ234 при наличии генов ctxA, ctxB, асе специфический амплификат гена zot отсутствует, что свидетельствует о внедрении в него транспозона Tn5-mob.

Пример 3, свидетельствующий о стабильности продукции холерного токсина.

Штамм V. cholerae KM234 культивируют 18 часов в бульоне без антибиотиков, а затем рассевают на плотные среды до получения изолированных колоний. Последующая проверка 700 колоний на продукцию токсина методом РПИГ показывает, что все изученные клоны были Кm^R и синтезировали этот белок в значительном количестве - зона иммунного гемолиза вокруг макроколоний составляла 2-2,5 мм. Эти данные подтверждают стабильность продукции токсина и стабильность наследования транспозона Tn5-mob штамма KM234. Иммуноферментный анализ 100 произвольно выбранных клонов подтвердил высокий уровень продукции XT (45-48 мкг/мл). В процессе производственных испытаний созданный штамм также характеризовался стабильной продукцией токсина и стабильным наследованием генетического маркера Кm^R.

Таким образом, заявленный штамм Vibrio cholerae KM234 обладает высоким и стабильным уровнем продукции холерного токсина II типа. Штамм может быть использован в производстве для получения химических вакцин нового поколения, содержащих более полный набор протективных антигенов и применяемых для профилактики холеры, вызванной холерным вибрионом как классического, так и эльтор вибрионов. Кроме того, штамм может быть использован для выделения очищенного холерного токсина II типа, используемого для получения антитоксических сывороток, входящих в состав иммунодиагностических тест-систем, которые предназначены для выявления природных токсигенных штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Более того, штамм рекомендуется использовать при проведении генетических исследований для изучения нового механизма регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерных вибрионов.

Штамм бактерий Vibrio cholerae, депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» под номером КМ234 - продуцент холерного токсина II типа.