Терапевтические связывающие молекулы

Терапевтические связывающие молекулы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к органическим соединениям, таким как связывающие молекулы изоформ антигена CD45, таким, например, как моноклональные антитела (МАт).

Предпосылки создания изобретения

Один из подходов к лечению различных заболеваний состоит в устранении или инактивации патогенных лейкоцитов и в возможности индукции толерантности к инактивации патологических иммунных реакций.

Отторжение трансплантатов органа, клетки и ткани и различные аутоиммунные заболевания, вероятно, являются, прежде всего, результатом опосредуемого Т-клеткой иммунного ответа, который запускается Т-клетками-хелперами, обладающими способностью распознавать специфические антигены, которые они захватывают, процессируют и представляют Т-клеткам-хелперам с помощью антигенпрезентирующих клеток (АПК), таких как макрофаги и дендритные клетки, в форме комплекса антиген-ГКС (главный комплекс гистосовместимости), т.е. распознавание специфических антигенов приводит к стимуляции Т-клетки-хелпера в отношении производства цитокинов, таких как IL-2, и экспрессии или повышающей регуляции некоторых рецепторов цитокинов и активации других молекул и пролиферации. Некоторые из этих активированных Т-клеток-хелперов могут действовать непосредственно или опосредовано, т.е. помогая эффекторным цитотоксическим Т-клеткам или В-клеткам разрушать клетки или ткани, экспрессирующие отобранный антиген. После прекращения иммунного ответа некоторые зрелые клонально отобранные клетки сохраняются в виде хелперных или цитотоксических Т-клеток памяти, которые циркулируют в организме и быстро распознают антиген, если он появляется вновь. Если антиген, запускающий этот ответ, представляет собой безвредный существующий во внешней среде антиген, то результатом является аллергия, если антиген представляет собой не чужеродный антиген, а аутоантиген, то он может привести к возникновению аутоиммунного заболевания; если антиген представляет собой антиген трансплантированного органа, то в результате может произойти отторжение трансплантата.

Иммунная система предназначена для распознавания «своего» от «не своего, чужого». Это свойство позволяет организму выживать в условиях постоянного заражения патогенами из окружающей среды. Эта специфичность в отношении «чужого» и толерантность в отношении «своего» возникает в процессе развития популяции Т-клеток в тимусе в виде процесса позитивного и негативного отбора, что включает также распознавание и элиминацию аутореактивных Т-клеток. Этот тип толерантности обозначают как основная толерантность. Однако некоторые из указанных аутореактивных клеток избегают этого механизма отбора и являются потенциально опасными с точки зрения развития аутоиммунных заболеваний. Для уничтожения аутореактивных Т-клеток, которые оказались на периферии, иммунная система имеет периферические регуляторные механизмы, обеспечивающие защиту от аутоиммунитета. Эти механизмы являются основой периферической толерантности.

Антигены клеточной поверхности, распознаваемые специфическими МАт, обычно обозначают как CD (дифференцировочный антиген лейкоцитов, выявляемых кластером моноклинальных антител) с им присваивают Международными комитетами по типированию лейкоцитов последовательные номера, а понятие CD45 в контексте настоящего описания относится к общему лейкоцитарному антигену CD45, находящемуся на клеточной поверхности, и МАт к этому антигену обозначено в контексте настоящего изобретения как «антитело к CD45 («анти-CD45»)».

Общий лейкоцитарный антиген (ЛОА) или CD45 представляет собой основной компонент антилимфоцитного глобулина (АЛГ). CD45 принадлежит к семейству трансмембранных тирозинфосфатаз и является как позитивным, так и негативным регулятором клеточной активации в зависимости от взаимодействия с рецептором. Фосфатазная активность CD45, вероятно, необходима для активации киназ Src-семейства, связанных с рецептором антигена В- и Т-лимфоцитов (Trowbridge I.S. и др., Annu Rev Immunol., 12 (1994), cc.85-116). Так, в механизме Т-клеточной активации CD45 имеет решающее значение для сигнала 1, и клетки с дефицитом CD45 обладают выраженными дефектами в отношении опосредуемого TCR (Т-клеточный рецептор) процесса активации.

Антиген CD45 существует в виде различных изоформ, представляющих собой семейство трансмембранных гликопротеинов. Различные изоформы CD45 отличаются по структуре их внеклеточного домена, что происходит в результате различного сплайсинга трех вариабельных экзонов, кодирующих часть внеклеточной области CD45 (Streuli M.F. и др., J. Exp. Med., 166 (1987), cc.1548-1566). Различные изоформы CD45 имеют различные внеклеточные домены, но несут одинаковые трансмембранный и цитоплазматический сегменты, которые имеют два гомологичных высококонсервативных фосфатазных домена, состоящих примерно из 300 остатков. Различные комбинации изоформ по-разному проявляются в субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов (Thomas M.L. и др., Immunol. Today, 9 (1988), cc.320-325). Некоторые моноклональные антитела распознают эпитоп, общий для всех различных изоформ, а другие МАт имеют ограниченную (CD45R) специфичность, в зависимости от этого они распознают полученные в результате альтернативного сплайсинга экзоны (А, В или С). Например, моноклональные антитела, распознающие продукт экзона А, обозначают соответственно как CD45RA, антитела, распознающие различные изоформы, содержащие экзон В, были обозначены как CD45RB (Beverley P.C.L и др., Iimnunol. Supp. 1988; I: cc.3-5). Антитела, такие как UCHL1, избирательно связываются с имеющей молекулярную массу 180 кДа изоформой CD45RO (без каких-либо вариабельных экзонов А, В или С), которая, вероятно, ограничена поднабором активированных Т-клеток, клеток памяти и кортикальных тимоцитов и не присутствует на В-клетках (Terry L.A. и др., Immunol., 64 (1988), cc.331-336).

Описание чертежей

На фиг.1 показано, что ингибирование первичной MLR (реакция лимфоцитов в смешанной культуре) «МАт-кандидатом» зависит от дозы в диапазоне от 0,001 до 10 мкг/мл. «Концентрация» обозначает концентрацию «МАт-кандидата».

На фиг.2 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-G1 HuAb-VHQ, содержащего тяжелую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:12 (3921-4274), входящую в состав полной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:15 экспрессионного вектора.

На фиг.3 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-G1 HuAb-VHE, содержащего тяжелую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11 (3921-4274), входящую в состав полной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:16 экспрессионного вектора.

На фиг.4 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-K HuAb-humV1, содержащего легкую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14 (3964-4284), входящую в состав нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:17 экспрессионного вектора.

На фиг.5 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-K HuAb-humV2, содержащего легкую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 (3926-4246), входящую в состав нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 экспрессионного вектора.

Описание изобретения

При создании изобретения была выявлена связывающая молекула, которая содержит полипептидную последовательность, связывающуюся с CD45RO и CD45RB, далее в контексте настоящего описания обозначенная также как «CD45RO/RB-связывающая молекула». Эти связывающие молекулы по изобретению могут индуцировать иммуносуперессию, ингибировать первичные Т-клеточные ответы и индуцировать Т-клеточную толерантность. Кроме того, связывающие молекулы по изобретению ингибируют первичные реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR). Клетки, полученные из культур, обработанных СD45RO/RD-связывающими молекулами, предпочтительно дают также ослабленные пролиферативные ответы во вторичных MLR даже при отсутствии СD45RO/RD-связывающих молекул во вторичных MLR. Такие ослабленные пролиферативные ответы во вторичных MLR являются показателем способности связывающих молекул по изобретению индуцировать толерантность. Кроме того, введение in vivo СD45RO/RD-связывающей молекулы мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) с последующим введением человеческих РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), что сопровождалось реакцией «ксенотрансплантат против хозяина») (ксено-РТПХ), может удлинять время выживания мышей по сравнению с контрольными обработанными мышами, хотя даже у мышей, обработанных СD45RO/KD-связывающей молекулой, в кровотоке все еще могут присутствовать человеческие Т-клетки.

Понятие «СD45RO/RB-связывающая молекула» обозначает любую молекулу, которая обладает способностью специфично связываться с изоформами CD45RB и CD45RO антигена CD45 либо индивидуально, либо в сочетании с другими молекулами. Реакцию связывания можно обнаруживать с помощью стандартных методов (качественный анализ), включая, например, любой тип анализа связывания, такой как прямой или косвенный анализ иммунофлуоресценции в сочетании с флуоресцентной микроскопией или цитофлуориметрический (FACS [флуоресцентный метод разделения клеток лимфоцитов]) анализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ, с помощью которых можно визуализировать связывание молекулы с клетками, экспрессирующими конкретную изоформу CD45. Кроме того, связывание этой молекулы может привести к изменению функции клеток, экспрессирующих эти изоформы. Например, можно определять ингибирование первичной или вторичной реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR), в том числе с помощью анализа in vitro или биологического анализа, предназначенного для оценки ингибирования первичной или вторичной MLR, в присутствии СD45RO/RB-связывающей молекулы или без нее и определения различий в ингибировании первичной MLR.

В другом варианте можно также определять функциональные модулирующие действия in vitro путем оценки пролиферации РВМС или Т-клеток или CD4⁺ -Т- клеток, производства цитокинов, изменения экспрессии молекул клеточной поверхности, например, после активации клеток с помощью MLR или после стимуляции специфическим антигеном, таким как токсоид столбняка, или другими антигенами, или с использованием поликлональных стимуляторов, таких как фитогемагглютинин (ФГА) или антитело к CD3 и антитело к CD28 или сложные форболовые эфиры и Са²⁺ - ионофоры. Культуры создают таким же образом, как это описано для MLR, за исключением того, что вместо аллогенных клеток в качестве стимуляторов используют растворимые антигенные или поликлональные стимуляторы, например описанные выше стимуляторы. Т-клеточную пролиферацию предпочтительно оценивают описанным выше методом путем включения ³Н-тимидина.

Производство цитокинов предпочтительно оценивают с помощью сэндвич-ELISA, при осуществлении которого иммобилизованным антителом к цитокину сенсибилизируют поверхность 96-луночного планшета, добавляют супернатанты культур и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре и затем добавляют идентифицирующее антитело, специфическое для конкретного цитокина, а затем вторичное антитело, конъюгированное с ферментом, таким как пероксидаза из хрена, и далее добавляют соответствующий субстрат и с помощью планшетридера оценивают абсорбцию. Изменение молекул клеточной поверхности предпочтительно можно оценивать с помощью прямого или косвенного метода иммунофлуоресценции после окрашивания клеток-мишеней антителами, специфическими для конкретной молекулы клеточной поверхности. Антитело можно либо метить непосредственно с помощью флуорохрома или можно использовать флуоресцентномеченное вторичного антитело, специфическое для первого антитела, и анализировать клетки с помощью цитофлуориметра.

Связывающая молекула по изобретению обладает способностью специфично связываться как с CD45RO, так и с CD45RB («CD45RB/RO-связывающая молекула»).

Предпочтительно связывание связывающей молекулы с изоформами CD45RO характеризуется величиной константы диссоциации (Kd) <20 нМ, предпочтительно Kd<15 нМ или <10 нМ, более предпочтительно Kd<5 нМ.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению связывается с теми изоформами CD45, которые

1) включают эпитопы А и В, но не включают эпитоп С молекулы CD45, и/или

2) включают эпитоп В, но не включают ни эпитоп А, ни эпитоп С молекулы CD45, и/или

3) не включают никакой из эпитопов А, В или С молекулы CD45.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению не связывается с изоформами CD45, которые включают

1) все эпитопы А, В и С молекулы CD45, и/или

2) эпитопы В и С, но не включают эпитоп А молекулы CD45.

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению дополнительно

1) распознает обладающие памятью и in vivo аллоактивированные Т-клетки, и/или

2) связывается со своей мишенью на человеческих Т-клетках, таких, например, как PEER-клетки; причем это связывание предпочтительно характеризуется Kd<15 нМ, более предпочтительно Kd<10 нМ, наиболее предпочтительно Kd<5 нМ, и/или

3) ингибирует in vitro функцию аллореактивной Т-клетки, предпочтительно при этом величина IC₅₀ составляет примерно 5 нМ, более предпочтительно IC₅₀ составляет примерно 1 нМ, наиболее предпочтительно IC₅₀ составляет примерно 0,5 нМ или даже 0,1 нМ, и/или

4) индуцирует толерантность аллоантигенспецифической Т-клетки in vitro и/или

5) предупреждает летальную реакцию «ксеногенный трансплантат против хозяина (РТПХ), вызванную у SCID-мышей инъекцией человеческих РВМС, при введении в эффективном количестве.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело «А6», описанное у Aversa и др., Cellular Immunology 158 (1994), cc.314-328.

Благодаря описанным выше способностям к связыванию и их биологическим активностям такие связывающие молекулы по изобретению особенно пригодны для применения в медицине для лечения и/или профилактики. Болезни, при которых предпочтительно применять связывающие молекулы по изобретению, включают аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, псориаз, воспалительное заболевание кишечника и аллергии, как это будет описано ниже.

При создании изобретения было установлено, что молекула, которая содержит полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, представляет собой CD45RO/RB-связывающую молекулу. Также были выявлены гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3' в CD45RO/RB-связывающей молекуле, имеющей последовательность SEQ ID NO:1, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), CDR2' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) и CDR3' имеет аминокислотную последовательность Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT).

Также были выявлены гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 в CD45RO/RB-связывающей молекуле, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT).

CDR представляют собой 3 специфичные «определяющие комплементарность области», называемые также гипервариабельными участками, которые в основном определяют антигенсвязывающие характеристики. Эти CDR являются частью вариабельной области, например последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 соответственно, причем эти CDR чередуются с каркасными областями (FR), например константными областями SEQ ID NO:1 является частью легкой цепи, например, SEQ ID NO:3, a SEQ ID NO:2 являются частью тяжелой цепи, например, SEQ ID NO:4, в химерном антителе по настоящему изобретению. CDR тяжелой цепи в сочетании с CDR соответствующей легкой цепи в основном формируют антигенсвязывающий центр молекулы по настоящему изобретению. Известно, что вклад вариабельной области легкой цепи в энергетику связывания мал по сравнению с вкладом вариабельной области соответствующей тяжелой цепи и что выделенные вариабельные области тяжелой цепи сами обладают антигенсвязывающей активностью. Такие молекулы обычно обозначают как антитела с одним доменом.

Одним из объектов настоящего изобретения является молекула, включающая по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например CD45RO/RB-связывающая молекула, содержащая последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, например, где указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe -Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT), и ее непосредственные эквиваленты.

Следующим объектом настоящего изобретения является молекула, включающая по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например, CD45RO/RB-связывающая молекула, которая включает

а) первый домен, содержащий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGYAWFDT), и б) второй домен, содержащий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', например, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), CDR2' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) и CDR3' имеет аминокислотную последовательность Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT), и ее непосредственные эквиваленты.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения первый домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, представляет собой тяжелую цепь иммуноглобулина, а второй домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', представляет собой легкую цепь иммуноглобулина.

Следующим объектом настоящего изобретения является молекула, например CD45RO/RB-связывающая молекула, включающая полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 и/или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, предпочтительно несущая в одном домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, и в другом домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, например, химерное моноклональное антитело, а еще одним объектом является молекула, например CD45RO/RB-связывающая молекула, содержащая полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, и/или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4, предпочтительно несущая в одном домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, и в другом домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4, например, химерное моноклональное антитело.

Когда антигенсвязывающий сайт включает первый и второй домены или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 соответственно, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4 соответственно, то они могут быть локализованы на одном и том же полипептиде или предпочтительно каждый домен может быть расположен на различных цепях, например первый домен может представлять собой часть тяжелой цепи, например тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а второй домен представлять собой часть легкой цепи, например легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.

При создании изобретения было установлено, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению представляет собой СD45RO/RB-связывающую молекулу из окружающей среды организма млекопитающего, например человека. Таким образом, CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению можно обозначить как моноклональное антитело (МАт), при этом связывающая активность определяется главным образом CDR-участками, как описано выше, например, указанные CDR-участки могут быть связаны с другими молекулами, которые не обладают способностью к специфичному связыванию, такими как каркасные участки, например константные области, которые в основном являются человеческими.

Еще одним объектом настоящего изобретения является CD45RO/RB-связывающая молекула, которая не представляет собой моноклональное антитело «А6», описанное у Aversa и др., Cellular Immunology 158 (1994), cc.314-328.

Следующим объектом настоящего изобретения является CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению, которая представляет собой химерное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

Примеры СD45RO/PRB-связывающих молекул включают химерные или гуманизированные антитела, например, полученные из антител, продуцируемых В-клетками или гибридомами, и их любые фрагменты, например F(ab')₂- или Fab-фрагменты, а также одноцепочечные антитела или антитела с одним доменом. Одноцепочечное антитело состоит из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антитела, ковалентно связанных с пептидным линкером, как правило, состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно 15-25 аминокислот. Таким образом, такая структура не включает константную часть тяжелых и легких цепей и, можно предположить, что небольшой пептидный спейсер должен обладать меньшими антигенными свойствами по сравнению с полной константной областью. Под химерным антителом понимают антитело, в котором константные области тяжелых и легких цепей или и тех и других цепей получают из антитела человека, а вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей получают из антитела организма, кроме человека (например, мыши). Под гуманизированным антителом понимают антитело, в котором гипервариабельные участки (CDR) получают из организма кроме человека (например, мыши), в то время как все или практически все другие составляющие, например константные области и высококонсервативные участки вариабельных областей, имеют происхождение из организма человека. Однако гуманизированное антитело может включать небольшое количество аминокислот из последовательности мыши в участках вариабельных областей, примыкающих к гипервариабельным участкам.

Гипервариабельные участки, т.е. CDR, по настоящему изобретению могут быть связаны с любым типом каркасных участков, например, константных областей тяжелых и легких цепей, полученных из организма человека. Приемлемые каркасные участки описаны, например, в «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Kabat E.A. и др., US Department of Health и Human Services, Public Health Service, National Institute of Health. Предпочтительно константная область человеческой тяжелой цепи может быть IgG1-типа, включая подтипы, предпочтительно константная область человеческой легкой цепи может быть κ- или λ-типа, более предпочтительно κ-типа. Предпочтительной константной областью тяжелой цепи является полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4 (без участков последовательностей CDR1', CDR2' и CDR3', описанных выше), а предпочтительной константной областью легкой цепи является полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3 (без участков последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, описанных выше).

Также было создано гуманизированное антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, которая содержит CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность SEQ:ID NO: 9 или SEQ:ID NO:10, которая содержит CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению.

Следующим объектом настоящего изобретения является гуманизированное антитело, которое включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

Еще одним объектом настоящего изобретения является гуманизированное антитело, которое включает

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7,

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8,

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, или

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8.

Полипептид по настоящему изобретению, например, имеющий указанную последовательность, например, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', CDR3', или SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, включает непосредственные эквиваленты указанных (поли)пептидов (последовательности); например, включает функциональное производное указанного полипептида. Функциональное производное может включать ковалентные модификации конкретной последовательности и/или функциональное производное может включать варианты аминокислотной последовательности конкретной последовательности.

Если не указано иное, то понятие «полипептид» включает любой пептид или протеин, состоящий из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями, аминокислотная последовательность которых начинается на N-конце и заканчивается на С-конце. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, более предпочтительно химерное (с трансплантированными вариабельными областями [V-трасплантированное]) или гуманизированное (с трансплантированными гипервариабельными участками [CDR-трансплантированное]) моноклональное антитело. Гуманизированное (CDR-трансплантированное) моноклональное антитело может включать дополнительные мутации, интродуцированные в каркасные (FR) последовательности антитела-акцептора или может не включать такие мутации.

В контексте настоящего описания функциональное производное полипептида включает молекулу, которая обладает качественной биологической активностью, соответствующей активности полипептида по настоящему изобретению, т.е. которая обладает способностью связываться с CD45RO и CD45RB. Функциональное производное включает фрагменты и пептидные аналоги полипептида по настоящему изобретению. Фрагменты представляют собой области внутри последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, имеющего конкретную представленную в настоящем описании последовательность. В контексте настоящего описания понятие «производное» относится к вариантам аминокислотной последовательности и ковалентным модификациям полипептида по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Функциональные производные полипептида по настоящему изобретению, например, имеющие конкретную представленную в настоящем описании последовательность, предпочтительно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 75%, еще более предпочтительно примерно по меньшей мере на 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% гомологичны полной последовательности аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, имеющей конкретную представленную в настоящем описании последовательность, и сохраняют в целом способность связываться с CD45RO и CD45RB.

Понятие «ковалентная модификация» включает модификации полипептида по настоящему изобретению, например, имеющего конкретную представленную в настоящем описании последовательность; или его фрагмента с использованием органического белкового или небелкового дериватизирующего агента, слияния с гетерологичными полипептидными последовательностями и посттрансляционные модификации. Ковалентно модифицированные полипептиды, например, имеющие конкретную представленную в настоящем описании последовательность, все еще сохраняют способность связываться путем поперечной связи с CD45RO и CD45RB. Как правило, ковалентные модификации интродуцируют путем взаимодействия аминокислотных остатков-мишеней с органическим дериватизирующим агентом, который обладает способностью взаимодействовать с выбранными боковыми или концевыми остатками, или путем принятых механизмов посттрансляционных модификаций, функционирующих в выбранных рекомбинантных клетках-мишенях. Определенные посттрансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток-мишеней на экспрессирумый полипептид. Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто деамидируют после трансляции с получением соответствующих глутамильных и аспартильных остатков. В другом варианте эти остатки деаминируют в мягких кислотных условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила, тирозина или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см., например, Т.Е.Creighton, Proteins: Structure и Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, cc.79-86 (1983)). Ковалентные модификации включают, например, слияние протеинов, содержащих полипептид по настоящему изобретению, например, имеющий конкретную представленную в настоящем описании последовательность, и их вариантов аминокислотных последовательностей, например, с использованием иммуноадгезинов, и N-концевые слияния с гетерологичными сигнальными последовательностями.

Понятие «гомология» применительно к нативному полипептиду и его функциональному производному в контексте настоящего описания обозначает процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных остаткам соответствующего нативного полипептида, после выравнивания последовательностей и при необходимости введения брешей для достижения максимального процента гомологии, и при оценке гомологии не учитываются никакие консервативные замены в качестве одного из критериев идентичности последовательностей. Никакие N- или С-концевые удлинения или инсерции не рассматриваются в качестве элементов, снижающих идентичность или гомологию. Методы и компьютерные программы, применяемые для сравнительного анализа, хорошо известны.

Понятие «аминокислота(ы)» относится ко всем встречающимся в естественных условиях, например, L-α-аминокислотам и включает D-аминокислоты. Аминокислоты обозначают либо с помощью хорошо известного однобуквенного кода, либо с помощью трехбуквенного кода.

Понятие «вариант аминокислотной последовательности» относится к молекулам, которые имеют некоторые отличия по аминокислотным последовательностям по сравнению с полипептидом по настоящему изобретению, например, имеющим конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Варианты аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, например конкретной представленной в настоящем описании последовательности, все еще сохраняют способность связываться с CD45RO и CD45RB. Полученные с помощью замены варианты представляют собой варианты, у которых по меньшей мере один аминокислотный остаток удален и вместо него другая аминокислота встроена в это же положение в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Эти замены могут быть одиночными, когда заменена только одна аминокислота в молекуле, или они могут быть множественными, когда в одной и той же молекуле заменены две или большее количество аминокислот. Полученные с помощью инсерции варианты представляют собой варианты, в которых одна или несколько аминокислот встроены непосредственно по соседству с аминокислотой в определенном положении в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Понятие «непосредственно по соседству с аминокислотой» обозначает соединение либо с α-карбокси-, либо с α-амино- функциональной группой аминокислоты. Полученные с помощью делеции варианты обозначает варианты, в которых одна или несколько аминокислот в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность, удалены. Как правило, полученные путем делеции варианты должны иметь одну или две делеции аминокислот в конкретной области молекулы.

При создании изобретения были также выявлены полинуклеотидные последовательности

- GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR1,

- TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR 2,

- ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR 3,

- TTATATTATCCACTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR1',

- TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR2',

- AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR3',

- SEQ ID NO:5, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, т.е. вариабельную область легкой цепи МАт по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:6, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, т.е. вариабельную область тяжелой цепи МАт по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:11, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, т.е. варибельную область тяжелой цепи, включая CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению;

SEQ ID NO:12, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, т.е. вариабельную область тяжелой цепи, включая CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:13, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, т.е. вариабельную область легкой цепи, включая CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению, и

- SEQ ID NO:14, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, т.е. вариабельную область легкой цепи, включая CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению. Другим объектом настоящего изобретения являются выделенные полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют CD45RO/RB- связывающую молекулу, например, которые кодируют аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению и/или предпочтительно и полинуклеотиды, которые кодируют аминокислотную последовательность CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению; и полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, и/или предпочтительно и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:6; и полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, например, кодирующие

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9,

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10,

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, или

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и

- полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13, или полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14, предпочтительно содержащие

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13,

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14,

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13, или

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14.

Если не указано иное, то понятие «полинуклеотид» в контексте настоящего описания включает любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может представлять немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК, включая (но не ограничиваясь ими) одно- и двухцепочечную РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей.

Полинуклеотид по настоящему изобретению, например полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', CDR3', или SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, такой как полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 соответственно, включает его аллельные варианты и/или их комплементы; например, включает полинуклеотид, который гибридизуется с нуклеотидной последовател