Новые факторы роста фибробластов

Новые факторы роста фибробластов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой 60/251837 от 8 декабря 2000 г., которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Факторы роста фибробластов играют важную роль в различных биологических функциях, включая, например, пролиферацию, дифференцировку и развитие клеток.

Описание изобретения

Были выявлены новые нуклеотидные, полипептидные последовательности и их регуляторные нуклеиновые кислоты, которые кодируют фактор роста фибробластов (FGF), предпочтительно FGF-20 (обозначенный в предварительной заявке, соответствующей настоящей заявке, как FGF-21) или FGF-23 (обозначенный в указанной выше публикации как FGF-22), которые представляют собой класс полипептидов, участвующих в развитии, дифференцировке и морфогенезе, например в передаче сигнала клетка-клетка, и пролиферации клеток. FGF по настоящему изобретению, его фрагменты и производные обладают одной или несколькими из приведенных далее видов биологической активности, включая (но не ограничиваясь ими): FGF-активность и FGF-специфическую иммуногенную активность. Согласно настоящему изобретению выявлены по меньшей мере два новых класса FGF, например FGF-20 и FGF-23.

Под понятием «FGF-активность» понимают, например, способность ускорять заживление ран; способность увеличивать выживание нейронов; стимуляцию клеточной пролиферации, например пролиферации стволовых клеток, фибробластов, нейронов, клеток глии, олигодендроцитов, клеток Шванна или их клеток-предшественников; модуляцию дифференцировки клеток; индукцию эмбрионального развития; стимуляцию роста невритов; повышение способности восстанавливаться после повреждения нерва или нейрона; стимуляцию миелинизации; стимуляцию ангиогенеза; активность в отношении связывания с рецептором; модуляцию онкогенеза и т.д.

Под понятием «FGF-специфическая иммуногенная активность» понимают, например, способность полипептида FGF вызывать селективный для FGF иммунологический ответ, например, иммунологический ответ, селективный для FGF-20 млекопитающих. Так, стимуляция антител, Т-клеток, макрофагов, В-клеток, дендритных клеток и т.д. аминокислотной последовательностью, выбранной из FGF млекопитающих, например FGF, представленных на фиг.1 и 2, является примером иммуногенной активности. Эти ответы можно оценивать обычными методами.

FGF, такой как FGF-20 или-23, представляет собой полноразмерный полипептид млекопитающих, имеющий аминокислотную последовательность, которую можно получать из природного источника и которая обладает одной или несколькими из вышеперечисленных видов активности. Они могут иметь последовательности, представленные на фиг.1 и 2, с открытыми рамками считывания, которые начинаются инициирующим кодоном и заканчивается стоп-кодоном. Они содержат встречающиеся в естественных условиях нормальные, встречающиеся в естественных условиях мутантные и встречающиеся в естественных условиях полиморфные, в том числе полиморфизмы одного нуклеотида (ОНП), и т.д. последовательности. Природные источники включают, например, живые клетки, например, полученные из тканей или целых организмов, культивированные линии клеток, включая первичные и иммортализованные линии клеток, полученные с помощью биопсии ткани и т.д.

Настоящее изобретение относится также в фрагментам FGF млекопитающих. Фрагменты предпочтительно являются «биологически активными». Под понятием «биологически активный» понимают, что полипептидный фрагмент обладает активностью в живой системе или в сочетании с компонентами живой системы. Виды биологической активности включают указанные выше виды активности, например PGF-активность, активность в отношении связывания с рецептором FGF и FGF-иммуногенную активность. Фрагменты можно получать с помощью любого приемлемого метода, например химического синтеза, генной инженерии, расщепления продуктов и т.д. Биологически активный фрагмент FGF включает полипептиды, которые имеют аминокислотные последовательности, выделенные или модифицированные либо на С-, либо на N-конце протеина.

Любые известные из литературы фрагменты нуклеиновых кислот и полипептидные фрагменты FGF-20 и FGF-23 или гомологи этих фрагментов исключены из объема настоящего изобретения, например фрагмент g5762262, который аналогичен последовательности, описанной для шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Известные из литературы нуклеотидные и аминокислотные последовательности доступных нуклеиновых кислот можно идентифицировать путем анализа опубликованных баз данных.

Настоящее изобретение относится также к FGF-20, который имеет выведенную последовательность аминокислот 1-211, приведенную на фиг.1, и FGF-23, который имеет выведенную последовательность аминокислот 1-169, приведенную на фиг.2. FGF-20 имеет предсказанную молекулярную массу примерно 23,5 кДа и предсказанное значение pI примерно 9,25. FGF-23 имеет предсказанную молекулярную массу примерно 19,6 кДа и предсказанное значение pI примерно 12,32.

Для протеинов степень идентичности означает количество идентичных аминокислот/на общее количество аминокислотных остаток в протеине. Степень аналогичности обозначает (количество идентичных аминокислотных остатков плюс количество замененных в результате консервативных замен аминокислот (типа V на L и т.д))/на общее количество аминокислотных остатков. Для ДНК идентичность означает то же, что и аналогичность, и обозначает количество идентичных нуклеотидов/на всю длину нуклеиновой кислоты.

Полипептид FGF по изобретению, например, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.1 и 2, можно проанализировать с использованием любых пригодных методов в отношении идентичности других структурных и/или функциональных доменов в полипептиде, включая области мембранного спэннинга, гидрофобные области. Например, полипептид FGF можно анализировать с помощью методов, описанных, например, у Kyte и Doolittle, J. Mol. Biol, 157:105, 1982; EMBL Protein Predict; Rost и Sander, Proteins, 19:55-72, 1994.

Другие гомологи FGF по настоящему изобретению можно получать с помощью различных методов из источников, взятых из организма млекопитающих или организмов, не относящихся к млекопитающим. Например, для отбора гомологов можно применять гибридизацию с олигонуклеотидами, выведенными из последовательностей, представленных на фиг.1 и 2, например, с использованием методов, описанных у Sambrook и др., Molecular Cloning, глава 11, 1989. Такие гомологи могут иметь различные количества нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, идентичных и аналогичных GENE. Относящиеся к млекопитающим организмы включают, например, грызунов, мышей, крыс, хомячков, обезьян, свиней, коров и т.д. Организмы, не относящиеся к млекопитающим, включают, например, позвоночных, беспозвоночных животных, полосатую перцину, цыплят, Drosophila, С.elegans, Xenopus, дрожжи, такие как S.pombe, S.cerevisiae, дождевые черви, прокариотические организмы, растения, Arabidopsis, вирусы, артемии и др.

Изобретение относится также к специфическим для FGF аминокислотным последовательностям, например к определенным аминокислотным последовательностям, которые входят в состав конкретных последовательностей, представленных на фиг.1 и 2, мотивам консервативных аминокислот, входящих в состав FGF по настоящему изобретению. Для отбора последовательностей, специфических для FGF, можно применять сравнительные анализы родственных протеинов, таких как другие родственные FGF (см., например, у Venkataraman и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 3658-3663, 1999).

Например, проводили сравнительный анализ последовательностей протеинов FGF-20 и -23 и на основе консервативных областей гомологии, представленных на фиг.1 и 2, получали аминокислотные мотивы. Настоящее изобретение относится к любой нуклеиновой кислоте или ее полипептидным последовательностям, например полипептидам, которые содержат 3 или более консервативных или гомологичных остатков, таких, например, как LYGS, HELP, VQGTR, RIEENGHNTY, QFEENWYNTY, AGTPSA, AAERSA и т.д. Другие специфические и/или консервативные аминокислотные последовательности можно идентифицировать с помощью общепринятых методов, например путем исследования баз данных ген/протеин с использованием набора компьютерных программ BLAST. FGF-специфическую аминокислотную последовательность или мотив можно применять для создания пептидов в виде антигенов с целью получения иммунного ответа на него. Антитела, полученные в результате такой иммунизации, можно применять в качестве специфического зонда для протеина FGF млекопитающих для диагностических или исследовательских целей.

Как отмечалось выше, полипептиды по настоящему изобретению могут содержать различные аминокислотные последовательности FGF (например, полноразмерные последовательности, т.е. последовательности, имеющие стартовый кодон и стоп кодон, как представлено на фиг.1 и 2, зрелую аминокислотную последовательность (т.е. когда полипептид FGF получают в виде предшественника, который процессируется с образованием зрелого полипептида или его фрагментов). Пригодные фрагменты включают, например, фрагменты, которые содержат или состоят практически из любого из вышеуказанных доменов и специфических и консервативных аминокислотных последовательностей.

Можно выбрать фрагмент полипептида FGF по настоящему изобретению, обладающий специфической биологической активностью, например активностью в отношении связывания с рецептором FGF или иммуногенной активностью.

Методы оценки этих активностей описаны ниже и в примерах. Эти пептиды можно идентифицировать и получать согласно методам, описанным в ЕР 496162. Пригодный фрагмент может содержать или практически состоять, например, из 9 последовательных аминокислот, предпочтительно примерно из 10, 15, 20, 30, 40 и т.д. последовательных аминокислот, представленных на фиг.1 и 2.

Полипептид по настоящему изобретению может также иметь 100%-ную или более низкую степень идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2. Для целей последующей дискуссии понятие идентичность последовательностей обозначает, что одни и те же нуклеотиды или аминокислоты, которые присутствуют в последовательности, представленной на фиг.1 и 2, присутствуют в соответствующем положении в последовательности(ях), с которой(ыми) проводится сравнение. Полипептид, последовательность которого идентична менее чем на 100% аминокислотным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, может содержать различные замены относительно встречающейся в естественных условиях последовательности, включая замены гомологичных и негомологичных аминокислот. Ниже приведены примеры замен гомологичных аминокислот. Сумма идентичных и гомологичных остатков, деленная на общее количество остатков в последовательности, с которой осуществляют сравнение полипептида FGF, равна проценту сходства последовательностей. Для расчета идентичности и сходства последовательностей можно их линеаризировывать и производить расчет с использованием любого требуемого метода, алгоритма, компьютерной программы и т.д., включая, например, FASTA, BLAST. Полипептид, последовательность которого идентична менее чем на 100% аминокислотным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, может быть идентичен этим последовательностям на 99, 98, 97, 95, 90,5, 90, 85, 70% и примерно др 60%.

Настоящее изобретение относится также к мутеинам полипептида FGF FGF-21 и -23, т.е. любому полипептиду, аминокислотная последовательность которого отличается от аминокислотной последовательности, получаемой из природного источника (фрагмент FGF млекопитающих не должен отличаться по аминокислотной последовательности от встречающегося в естественных условиях FGF, хотя он отличается по количеству аминокислот). Таким образом, мутеины полипептида FGF содержат аминокислотные замены, инсерции и делеции, включая не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты.

Мутеины аминокислотой последовательности FGF по изобретению можно получать также на основе исследования гомологии с последовательностями из баз данных генетических банков, например из Genbank, EMBL. Исследование гомологии последовательностей можно осуществлять с помощью различных методов, включая алгоритмы, на которых основана серия компьютерных программ BLAST, алгоритма Смита-Уотермана и т.д. Мутеин(ы) можно интродуцировать в последовательность путем идентификации и линеаризации аминокислот внутри определенного домена, которые идентичны и/или гомологичны для полипептидов, и последующей модификации аминокислот на основе такого сравнительного анализа последовательностей. Например, последовательность FGF по настоящему изобретению идентична последовательностям различных известных FGF, например, описанных у Venkataraman и др. в Proc. Natl. Acad. Sci, 96: 3658-3663, 1999. Сравнительный анализ последовательностей этих полипептидов, прежде всего остатков консервативных аминокислот, которые приведены в таблице 1 у Venkataraman с соавторами, позволяет выявить остатки, модификация которых, вероятно, может восстанавливать, снижать или устранять биологическую активность FGF, например способность связываться с рецептором, и т.д. Например, если сравнительный анализ последовательностей позволил выявить консервативные аминокислоты в двух или большем количестве доменов, то можно ожидать, что элиминация или замена этой(их) аминокислоты(т) окажет отрицательное воздействие на биологическую активность.

Аминокислотную замену можно осуществлять, заменяя одну гомологичную аминокислоту на другую. Гомологичные аминокислоты можно идентифицировать на основе размера их боковой цепи и степени поляризации, они включают небольшие неполярные аминокислоты: цистеин, пролин, аланин, треонин; небольшие полярные аминокислоты: серин, глицин, аспартат, аспарагин; большие полярные аминокислоты: глутамат, глутамин, лизин, аргинин; аминокислоты со средней полярностью: тирозин, гистидин, триптофан; большие неполярные аминокислоты: фенилаланин, метионин, лейцин, изолейцин, валин. Гомологичные аминокислоты можно группировать также следующим образом: аминокислоты с незаряженными неполярными R-группами: глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; кислотные аминокислоты (отрицательно заряженные): аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; основные аминокислоты (положительно заряженные): лизин, аргинин, гистидин. Гомологичные аминокислоты включают также аминокислоты, описанные у Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 и у Argos в EMBO J. 8, 779-785, 1989.

Изобретение относится также к мутантным полипептидам и мутантным нуклеиновым кислотам, кодирующим эти полипептиды. Таким образом, настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям, представленным на фиг.1 и 2, где эти нуклеиновые кислоты кодируют полипептид, в котором аминокислота(ты) в одном или нескольких положениях заменена(ы) или удалены в результате делеции или и заменены и удалены, и полипептид, кодируемый этой нуклеиновой кислотой, обладает биологической активностью, например повышенной способностью к восстановлению нерва или нейрона после повреждения. Полипептид-мутеин и, соответственно, кодирующая его нуклеотидная последовательность может иметь аминокислотную последовательность, представленную на фиг.1 и 2, за исключением того, что в одном или нескольких положениях присутствует замена на гомологичные аминокислоты, например, в котором присутствуют 1, 5, 10, 15 или 20 замен. Воздействие модификации на указанные виды активности можно оценивать с помощью методов, которые описаны выше, ниже и которые хорошо известные специалисту в данной области. Например, в данной области известны различные методы оценки активности FGF, включая, например анализы, которые позволяют оценить выживание нервов и другие виды нейтротропной активности, например, описанные в примерах и у Kanda и др., Int. J.Devl. Neuroscience, 12(3): 191-200, 1999, и активности в отношении связывания с FGF-рецептором.

Как отмечалось выше, аминокислотные замены можно осуществлять также на основе аналогии с другими родственными FGF. Другие мутации можно выбирать общепринятым методом путем модификации или мутации нуклеотидной последовательности, представленной на фиг.1 и 2, и отбора тех мутаций, которые оказывают воздействие на одну или несколько видов активности, например, оценивая активность с помощью описанных ниже методов и примеров.

Выделенный из млекопитающих FGF по настоящему изобретению, его фрагменты или несущие замены полипептиды могут также включать различные модификации, которые представляют собой модификацию липидов, метилирование, фосфорилирование, гликозилирование, ковалентные модификации (например, R-группы аминокислоты), замену аминокислоты, делецию аминокислоты или добавление аминокислоты. Модификации полипептида можно осуществлять с помощью различных методов, включая рекомбинацию, синтетические, химические и другие методы.

Полипептиды по настоящему изобретению (например, полноразмерные, их фрагменты, их мутанты) можно использовать для различных целей, например в анализах, в качестве иммуногенов для получения антител, как описано ниже, в качестве биологически активных агентов (например, обладающих одной или несколькими видами активности, связанной с FGF по настоящему изобретению).

Полипептид PGF по настоящему изобретению, его производное или фрагмент можно объединять с одним или несколькими структурными доменами, функциональными доменами, доменами, которые можно обнаружить, антигенными доменами и/или с представляющим интерес требуемым полипептидом в порядке, который не встречается в природе, т.е. он может представлять собой не встречающийся в естественных условиях полипептид. Полипептид, обладающий указанными особенностями, представляет собой химерный или слитый полипептид. Такой химерный полипептид можно получать с помощью различных методов, включая химические, синтетические, квазисинтетические методы и/или методы рекомбинации. Химерная нуклеиновая кислота, кодирующая химерный полипептид, может содержать непрерывные различные домены или области требуемых полипептидов (например, с множеством N-концевых доменов для стабилизации или повышения активности), или они могут прерываться открытой рамкой считывания, например могут содержать интроны, сайты сплайсинга, энхансеры и т.д. Химерную нуклеиновую кислоту можно получать с помощью различных методов (см., например, патент США 5439819). Домен или требуемый полипептид может обладать любым необходимым свойством, включая биологическую функцию, такую как передача сигнала, усиление роста, направленный перенос в клетке (например, сигнальная последовательность, последовательность, осуществляющая направленный перенос, например направленный перенос в эндоплазматический ретикулум или ядро) и т.д., структурную функцию, такую как гидрофобную, гидрофильную, функцию мембранного спэннинга и т.д., функции рецепторного лиганда и/или функции, которые можно обнаружить, например, при объединении с ферментом, флуоресцентным полипептидом, зеленым флуоресцентным протеином (Chalfie и др., Science, 263: 802, 1994; Cheng и др., Nature Biotechnology, 14: 1996; Levy и др., Nature Biotehnology, 14: 610, 1996) и т.д. Кроме того, полипептид или его часть можно использовать в качестве селектируемого маркера при интродукции в клетку-хозяина. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность по настоящему изобретению, можно сливать в рамке считывания с требуемой кодирующей последовательностью, и она может действовать в качестве метки для целей очистки, селекции или индикации. Область слияния может кодировать сайт расщепления для облегчения экспрессии, выделения, очистки и т.д.

Полипептид по настоящему изобретению можно согласно изобретению получать в системе экспрессии, например, in vivo, in vitro, в бесклеточной системе, рекомбинантно, путем клеточного слияния и т.д. Модификации полипептида, связанные с такими системами, включают гликозилирование, замену аминокислот (например, с помощью различных наиболее часто встречающихся кодонов), процессирование полипептида, такое как переваривание, расщепление, воздействие активности эндопептидаз или экзопептидаз, присоединение химических фрагментов, включая липиды и фосфаты и т.д.

Полипептид по настоящему изобретению можно выделять из природных источников, трансформированных клеток-хозяев (культура клеток или клетки) с помощью общепринятых методов, включая экстракцию с использованием детергентов (например, неионогенного детергента, Тритона Х-100, CHAPS, октилглюкозида, Igepal CA-630), осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотами, анион- или катионобменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, гидроксиапатитную хроматографию, лектиновую хроматографию, гель-электрофорез. При необходимости можно применять стадии рефолдинга протеина для достижения конфигурации зрелого протеина. И наконец, для стадий очистки можно применять жидкостную хроматографию высокого разрешения (ЖХВР). Полипептид FGF можно выделять также согласно методам, описанным для других протеинов FGF, хорошо известных специалистам в данной области, например согласно методам выделения различных FGF, описанных в патентах US 5604293, 5395756, 5155214, 4902782 и у Santos-Ocampo и др., J. Biol. Chem., 271: 1726-1731, 1996 (очистка FGF из бактерии-хозяина, например Е.coli). Другой подход предусматривает экспрессию FGF рекомбинантным путем с использованием аффинной метки (Flag-эпитоп, НА-эпитоп, myc-эпитоп, 6xHis, связывающий мальтозу протеин, хитиназа и т.д.) с последующей очисткой с помощью аффинной хроматографии с использованием конъюгированного антитела к метке.

Настоящее изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК, кодирующим полипептиды FGF и их фрагменты по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота, кодирующая FGF (например, FGF-20 или -23) или его фрагмент, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая имеет нуклеотидную последовательность, полученную из природного источника. Таким образом, она включает встречающиеся в естественных условиях нормальные, встречающиеся в естественных условиях мутантные и встречающиеся в естественных условиях полиморфные аллели (например, ОНП) и т.д. Природные источники включают, например, живые клетки, полученные из тканей и всего организма, опухоли, культивируемые линии клеток, включая первичные и иммортализованные линии клеток.

Нуклеотидная последовательность по изобретению может содержать полную кодирующую последовательность, представленную на фиг.1 и 2, их вырожденные последовательности и их фрагменты. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может также представлять собой нуклеиновую последовательность, комплементарную на 100%, например антисмысловую последовательность, любой указанной выше или ниже нуклеотидной последовательности.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно получать из широкого разнообразия различных источников. Ее можно получать из ДНК или РНК, например полиаденилированной мРНК, например, выделенных из тканей, клеток или всего организма. Нуклеиновую кислоту можно получать непосредственно из ДНК или РНК или из библиотеки кДНК. Нуклеиновую кислоту можно получать из клетки или ткани (например, из сердца эмбриона или взрослой особи или из скелетных клеток или тканей) на конкретной стадии развития, имеющей требуемый генотип, фенотип и т.д.

Как описано выше для полипептида FGF, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению, может включать только кодирующую последовательность, кодирующую последовательность и дополнительную кодирующую последовательность (например, последовательности, кодирующие лидерный, секреторный, осуществляющий направленный перенос, обладающий ферментативной активностью, флуоресцентный или другие диагностические пептиды), кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, например нетранслируемые последовательности на 5'- или 3'-конце, или последовательности, расположенные внутри кодирующей последовательности, например интроны. Нуклеотидная последовательность, представляющая собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид без перерывов, обозначает, что нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность FGF, и кодирующая последовательность не прерывается или в нее не входят некодирующие нуклеотиды, например отсутствует(ют) интрон(ы). Такую нуклеотидную последовательность также можно обозначать как непрерывную. Геномную ДНК, кодирующую ген FGF человека, мыши или другого млекопитающего и т.д., можно получать обычным путем.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может также содержать контролирующую экспрессию последовательность, функционально связанную с описанной выше нуклеиновой кислотой. Понятие «контролирующая экспрессию последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая регулирует экспрессию полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, с которой она функционально связана. Экспрессию можно регулировать на уровне мРНК или полипептида. Таким образом, контролирующая экспрессию последовательность включает связанные с мРНК элементы и связанные с протеином элементы. Такие элементы включают промоторы, энхансеры (вирусные или клеточные), последовательности, связывающиеся с рибосомами, терминаторы транскрипции и т.д. Контролирующая экспрессию последовательность функционально связана с нуклеотидной кодирующей последовательностью, когда контролирующая экспрессию последовательность расположена так, что воздействует на экспрессию кодирующей последовательности или обусловливает ее экспрессию. Например, когда промотор функционально связывают с 5'-концом кодирующей последовательности, экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем промотора. Контролирующие экспрессию последовательности могут быть гетерологичными или эндогенными относительно нормального гена.

Нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению можно выбирать на основе гибридизации нуклеиновых кислот. Способность препаратов двух одноцепочечных нуклеиновых кислот гибридизоваться друг с другом является мерой комплементарности их нуклеотидных последовательностей, например мерой спаривания нуклеотидов, таких как А-Т, G-C и т.д. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и их комплементам, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.1 и 2. Нуклеотидная последовательность, гибридизирующаяся с последней последовательностью, должна иметь комплементарную цепь нуклеиновой кислоты или действовать в качестве матрицы для нее в присутствии полимеразы (т.е. соответствующего фермента, участвующего в синтезе нуклеиновой кислоты). Настоящее изобретение включает обе цепи нуклеиновой кислоты, например смысловую цепь и антисмысловую цепь.

Условия гибридизации можно выбирать в зависимости от нуклеиновых кислот, которые имеют требуемый уровень нуклеотидной комплементарности с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2. Нуклеиновая кислота обладает способностью гибридизоваться с такой последовательностью, если уровень комплементарности между нуклеиновыми кислотами предпочтительно составляет, например, примерно 85%, более предпочтительно 90%, 92% и еще более предпочтительно 95%, 97% или 100%. Настоящее изобретение относится, в частности, к нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью, представленной на фиг.1 и 2, в расслабленных или строгих условиях гибридизации.

Нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с последовательностями FGF, можно выбирать различными путями. Например, блоты (т.е. матрицы, содержащие нуклеиновую кислоту), матричные кристаллы и другие матрицы, содержащие представляющие интерес нуклеиновые кислоты, можно инкубировать в растворе для предварительной инкубации (6xSSC, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, 5х раствор Денхардта и 50% формамида) при 30°С в течение ночи, а затем гибридизовать с обнаруживаемым нуклеотидным зондом (см. ниже) в растворе для гибридизации (например, 6xSSC, 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамида) при 42°С в течение ночи, согласно известным методам. Блоты можно отмывать в строгих условиях, которые позволяют получать, например, менее 5% ошибочных спариваний комплементарных пар (например, двукратная отмывка в 0,1% SSC и 0,1% ДСН в течение 30 мин при 65°С), т.е. отбирая последовательности, идентичные на 95% или более. Другие примеры строгих условий включают (но не ограничиваясь ими) конечную отмывку при 65°С в водном буфере, содержащем 30 мМ NaCl и 0,5% ДСН. Другой пример строгих условий предусматривает гибридизацию в 7% ДСН, 0,5М NaPO₄, pH 7, 1 мМ ЭДТК при 50°С, например, в течение ночи, с последующей одной или двумя отмывками 1%-ным раствором ДСН при 42°С.

В то время как отмывки в строгих условиях дают возможность получать менее 5% ошибочных спариваний, расслабленные или менее строгие условия отмывки (например, двукратная отмывка в 0,2% SSC и 0,5% ДСН в течение 30 мин при 37°С) могут обеспечивать получение до 20% ошибочных спариваний. Другой пример условий пониженной строгости предусматривает (но не ограничиваясь им) конечную отмывку при 42°С в буфере, содержащем 30 мМ NaCl и 0,5% ДСН. Отмывку и гибридизацию можно также осуществлять согласно методам, описанным у Sambrook и др., Molecular Cloning, глава 9.

Гибридизация может также основываться на расчете температуры плавления (Tm) гибрида, полученного в результате слияния зонда и его мишени, согласно методу, описанному у Sambrook и др. Как правило, температуру плавления Tm, при которой короткие олигонуклеотиды (содержащие 18 или менее олигонуклеотидов) будут выплавляться из последовательности-мишени, получают из следующего уравнения: Tm=(количество А и Т)×2°С+(количество С и G)×4°C. Для более длинных молекул Tm=81,5+16,6log10[Na+]+0,41(%GC)-600/N, где [Na+] обозначает молярную концентрацию ионов натрия, % GC обозначает процент пар оснований GC в зонде и N обозначает длину. Гибридизацию можно осуществлять при температуре на несколько градусов ниже указанной температуры для того, чтобы иметь гарантию гибридизации зонда и мишени. Ошибочные спаривания можно получить путем дальнейшего снижения температуры.

Строгие условия можно выбирать для выделения последовательностей и их комплементов в случае, когда нуклеотидные последовательности зонда (например, олигонуклеотида FGF) и нуклеиновой кислоты-мишени комплементарны по меньшей мере примерно на 95%, предпочтительно на 97%.

Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота или полипептид могут иметь одно или несколько различий в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, представленной на фиг.1 и 2. Изменения или модификации в нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности можно осуществлять с помощью любого доступного метода, включая направленный или случайный мутагенез.

Нуклеиновая кислота, кодирующая FGF млекопитающих, такой как FGF-20 или -23, по изобретению может содержать нуклеотиды, которые присутствуют в встречающемся в естественных условиях гене, например, встречающиеся в естественных условиях полиморфизмы, нормальные или мутантные аллели (нуклеотидные или аминокислотные), мутации, обнаруженные в природной популяции млекопитающих, таких как человек, обезьяны, свиньи, мыши, крысы или кролики. Например, нуклеиновая кислота или полипептид человеческого FGF содержит нуклеотиды или аминокислоты, которые присутствуют в человеческой популяции в естественных условиях. Понятие «встречающийся в естественных условиях» подразумевает, что нуклеиновую кислоту можно получать из природного источника, например ткани или клеток животного, общей воды организма, клеток из культуры ткани, образцов, полученных для судебной медицины. Встречающиеся в естественных условиях мутации могут включать делеции (например, укороченные N- или С-концы), замены, инверсии или добавления нуклеотидной последовательности. Эти гены можно выявлять и выделять путем гибридизации нуклеиновых кислот с использованием методов, известных специалистам в данной области. Нуклеотидная последовательность, кодирующая FGF млекопитающего по изобретению, может содержать кодоны, которые присутствуют в встречающемся в естественных условиях гене, транскрипте или кДНК, например, представленные на фиг.1 и 2, или она может содержать вырожденные кодоны, которые кодируют эти же самые аминокислотные последовательности. Например, может оказаться желательным изменить кодоны в последовательности с целью оптимизации экспрессии последовательности в требуемом хозяине.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК, РНК, синтетическую нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид нуклеиновую кислоту, модифицированные нуклеотиды или их смеси. ДНК может представлять собой двухцепочечную или одноцепочечную ДНК. Нуклеотиды, из которых состоит нуклеиновая кислота, могут быть соединены различными известными связями, например сложноэфирной, сульфаматной, сульфамидной, фосфортиоатной, фосфорамидатной, метилфосфонатной, карбаматной и т.д. в зависимости от поставленной задачи, например, для достижения устойчивости к нуклеазам, таким как РНКаза Н, улучшенной стабильности in vivo и т.д. (см., например, патент US 5378825).

В нуклеиновых кислотах могут быть сделаны различные модификации, такие как присоединение обнаруживаемых маркеров (авидин, биотин, радиоактивные элементы), фрагментов, улучшающих гибридизацию, обнаружение или стабильность. Нуклеиновые кислоты можно также присоединять к твердым подложкам, например, к нитроцеллюлозе, магнитным или парамагнитным микросферам (например, как описано, в патентах США 5411863, 5543289; например, представляющие собой ферромагнитные, супермагнитые, парамагнитные, суперпарамагнитные подложки, подложки из оксида железа и полисахарида), к найлону, агарозе, диазотизированной целлюлозе, твердым латексным микросферам, полиакриламидам и т.д., в зависимости от требуемого метода (см., например, патенты US 5470967, 5476925, 5478893).

Следующим объектом настоящего изобретения являются олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты-зонды. Такие олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты-зонды можно применять, например, для обнаружения, количественной оценки или выделения нуклеиновой кислоты FGF млекопитающего в тестируемом образце или для идентификации гомологов FGF. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеиновые кислоты можно использовать в качестве олигонуклеотидных зондов, например, в ПЦР, методе дифференциального обнаружения, в генных чипах (например, Affymetrix GeneChips; см. патенты US 5143854, 5424186, 5874219, PCT WO 92/10092, РСТ WO 90/150070) и в других доступных методах. Обнаружение может требоваться для различных целей, включая исследование, диагностику и судебную медицину. Для целей диагностики может требоваться выявление присутствия или определение количественного содержания нуклеотидной последовательности в образце, который может быть получен из ткани, клеток, общей воды организма и т.д. Предпочтительный способ по настоящему изобретению представляет собой способ обнаружения нуклеиновой кислоты, который предусматривает контакт нуклеиновой кислоты-мишени в тестируемом образце с олигонуклеотидом в условиях, эффективных для осуществления гибридизации между мишенью и олигонуклеотидом; и обнаружение гибридизации. Олигонуклеотид по изобретению можно также использовать в амплификации синтетической нуклеиновой кислоты, такой как ПЦР (например, см. Saiki и др., Science, 241:53, 1988; патент US 4683202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis и др. (ред.), Academic Press, New York, 1990); для дифференциального обнаружения (см., например, Liang и др., Nucl. Acid. Res., 21: 3269-3275, 1993; патент US 5599672; WO 97/18454).

Обнаружение можно осуществлять при использовании комбинации с олигонуклеотидами других генов, например генов, участвующих в трансдукции сигнала, росте, развитии рака, апоптозе, или любых генов, упомянутых выше или ниже, и т.д. Олигонуклеотиды можно применять также для оценки мутаций, например, используя технологию репарации ДНК с ошибочными спариваниями, описанную в патенте US 5683877, патенте US 5656430, у Wu и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8779-8783, 1992.

Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать любую непрерывную нуклеотидную последовательно