Способы получения растений с улучшенным ростом в условиях ограничения уровня азота

Способы получения растений с улучшенным ростом в условиях ограничения уровня азота

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу повышения роста и урожайности растений в условиях ограниченного уровня азота.

Уровень техники

Применение химических удобрений для снабжения азотом, как наблюдается в современном интенсивном сельском хозяйстве, приводит к существенным повышениям в урожайности, но высвобождает азот в окружающую среду в форме избыточных нитратов, что вызывает появление таких проблем для окружающей среды, как загрязнение рек и озер эвтрофикацией, опасность для здоровья из-за аккумуляции нитратов в сельскохозяйственных культурах и генерацию газов теплиц из-за остаточного азота в почве. Большое количество электричества, требуемого для производства азотистых удобрений, также вносит вклад в проблемы окружающей среды для сельского хозяйства. Другими словами, для поддержания урожайности требуются сельскохозяйственные способы, которые применяют меньше химического удобрения, особенно азотистого удобрения.

Однако за несколькими исключениями, такими как Leguminosae, растения не могут фиксировать азот из воздуха и полностью зависят в отношении азота от нитрата или аммиака, подаваемого извне. Следовательно, азот является фактором, наиболее ограничивающим рост и развитие растений, и современное сельское хозяйство встречается, очевидно, с противоречивой задачей поддержания и повышения современных урожаев при снижении вышеуказанной проблемы для окружающей среды при усилии поддержания урожайности. Усилия в этом направлении и особенно попытки вывести и культивировать растения с удовлетворительным ростом и урожайностью в условиях пониженной подачи азота до сих пор были недостаточными. Например, благоприятное для окружающей среды и способное поддерживать урожайность органическое сельское хозяйство было предложено в качестве альтернативы современному интенсивному сельскому хозяйству, но хотя внесение азотистого удобрения в таком благоприятном для окружающей среды сельском хозяйстве регулируется, здесь имеется много проблем в отношении урожайности.

С точки зрения улучшения сортов растений не было удачных примеров выведения растений для разрешения этих проблем обеспечением адекватного роста и/или урожайности в условиях ограниченного уровня азота, таких как условия, в которых внесение азотистого удобрения уменьшают. Следовательно, существует потребность в выведении сортов растений, имеющих сохраняемую или повышенную урожайность, посредством модификации или повышения эффективности утилизации азота растениями при меньшем внесении азотистого удобрения и в разработке технологий для выведения таких сортов растений.

Известно, что первой стадией ассимиляции неорганического азота в органическую форму в растениях в основном является включение аммиака в глутамат с образованием глутамина. Включение является реакцией, катализируемой глутаминсинтетазой (GS) и глутаматсинтазой (GOGAT), при этом две реакции объединяются с образованием одной молекулы глутамата ассимиляцией одной молекулы аммиака в одну молекулу 2-OG. Считается, что этот цикл CS/GOGAT является основным путем ассимиляции азота в растениях (Miflin and Lea: 1976, Phytochemistry 15: 873-885).

С другой стороны, в результате исследований с применением Cyanobacteria и Е. coli сообщается, что в микроорганизмах количественный баланс 2-OG и глутамина регулирует экспрессию генов ферментов, связанных с включением и ассимиляцией нитрата (Forchammer and Tandeau-Marsac, 1995, J. Bacteriol. 177, 2033-2040; Jiang et al, 1998, Biochemistry 37, 12795-12801). Однако из Arabidopsis thaliana (арабидопсис) выделен ген, имеющий строгую гомологию с белком PII, который, как предполагается, ассоциирован с такой регуляцией, и, когда такой ген вводили и сверхэкспрессировали в табак, не обнаружили повышения содержания нитрата, что позволило предположить, что аккумуляция азота в высших растениях происходит отличным образом по сравнению с микроорганизмами (Hsieh et al, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13965-13970). С другой стороны, указывалось, что, когда исследовали экспрессию нитратредуктазы (далее обозначаемой аббревиатурой NR) с применением табачных растений, имеющих ген ферредоксинзависимой глутаматсинтазы, введенный в антисмысловом направлении так, чтобы снизить экспрессию глутаматсинтазы, уровень транскрипции NR повышался, когда поставляли нитрат, сахарозу и 2-OG, тогда как, когда поставляли глутамин, уровень транскрипции NR снижался (Ferrario-Mery et al, 2001 Planta 213: 265-271). В соответствии с данной ссылкой, количества 2-OG и глутамата также ассоциируется с регуляцией NR в высших растениях. Однако эти полученные данные относятся только к NR, и ничего не было указано о действии 2-OG на рост и развитие растений в условиях ограниченного содержания азота. Более того, 2-OG является относительно нестабильным соединением и рассматривается как непригодный, например, для целей разбрызгивания.

Разработаны также трансгенные растения, в которые был введен ген GDH, и сообщается, что, когда полученный из Е. coli NADP-зависимый ген GDH (gdhA) вводили в табак и кукурузу с той целью, чтобы все из факторов: придание устойчивости к гербициду фосфинотрицину, сухая масса, общее содержание аминокислот и содержание водорастворимых углеводов значительно повысились (Lightfoot et al. CA2180786, 1996). Аналогично этому, Thian et al (CN00109779.2), ввели полученный из Neurospora, NADP-зависимый ген GDH в табак и сообщили, что рост был лучше, чем рост табака, в который такой ген не был введен. Указано также, что аминокислотное содержание в плодах повышалось, когда полученный из Aspergillus nidulans NADP-зависимый ген GDH вводили в томатные растения (Kisaka et al, JP11-376710), и что масса клубней и число клубней повышались, когда тот же самый ген вводили в картофельные растения (Kisaka et al, JP2000-404322). Однако функцию введенного гена не объясняли ни в одном из этих сообщений, и не известно, как функционирует введенный ген или какие действия вызывают эти характеристики. Кроме того, ничего не упоминается о усилении роста и/или повышения урожайности растений в условиях ограниченного уровня азота.

Не имеется также сообщений, относящихся к введению гена аспартатаминотрансферазы в растения.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способа выведения растений, имеющих повышенное включение в них азота и повышенную метаболическую активность растений и имеющих усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации с ограниченным уровнем азота, или другими словами, с уровнем азота, ограниченным до уровня ниже нормальных условий культивации, а также способ культивации таких растений в условиях ограниченного уровня азота.

Авторы изобретения предположили наличие сигнальной молекулы, которая позволяет клеткам растения ощущать условия азотного потребления, и рассматривали 2-оксоглутарат (2-OG) в качестве сигнальной молекулы. То есть 2-OG является сигнальной молекулой, которая всестороннее регулирует включение и метаболизм азота в клетках растений, и было предположено, что посредством искусственного повышения или снижения содержания этого вещества может быть, возможно, поддержание в клетках растения включения и метаболизма азота в повышенном состоянии. Кроме того, поскольку считается, что растение в такой повышенном состоянии способно активно включать в себя азот из внешней стороны, полагают, что азот может быть пополнен в условиях ограничения уровня азота, в результате чего происходит усиление роста и повышение урожайности. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что содержание 2-OG клеток растений могло быть повышено индуцированием сверхэкспрессии активности глутаматдегидрогеназы (далее обозначаемой аббревиатурой GDH) или активности аспартатаминотрансферазы (далее обозначаемой аббревиатурой ASPC) и что растения с повышенным содержанием 2-OG имеют усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях ограниченного содержания азота, что привело к созданию настоящих изобретений.

Следовательно, настоящим изобретением является способ получения растения, проявляющего усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровня ниже нормальных условий культивации повышением содержания 2-OG в растениях.

Кроме того, настоящим изобретением является растение или его семена, проявляющие усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровней ниже нормальных условий культивации, введением гена GDH или гена ASPC и экспрессией гена в растительном организме, в результате чего происходит повышение содержание 2-OG. Кроме того, настоящим изобретением является способ получения растения, проявляющего усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровней ниже нормальных условий культивации, ведением гена GDH или гена ASPC и экспрессией гена в растительном организме, в результате чего происходит повышение содержание 2-OG.

В частности, настоящим изобретением является способ получения растения, проявляющего усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровня ниже уровня нормальных условий культивации, в котором рост и/или урожайность эквивалентные или выше, чем рост и/или урожайность, полученные в условиях культивации с обычно применяемым количеством (определенным для каждого растения) азотистого удобрения, полученные в условиях культивации с количеством азота, находящимся в интервале ниже, чем нижний предел, и 1/10-кратным нижним пределом стандартного количества внесения азотистого удобрения.

Настоящим изобретением является способ культивации растения, полученного указанным выше способом настоящего изобретения, в котором культивацию проводят в условиях ограниченного содержания азота. В частности, настоящим изобретением является способ культивации растения, выведенного указанным выше способом настоящего изобретения в условиях внесения азотистого удобрения в диапазоне между количеством ниже нижнего предела и 1/10-кратным нижним пределом стандартного количества внесения (определено для каждого растения).

Кроме того, настоящим изобретением является способ усиления роста и/или повышения урожайности растений в условиях культивации с содержанием азота, ограниченным до уровня ниже нормальных условий культивации, содержащий проведение некорневой подкормки растений пролином.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой схематическую диаграмму сконструированного плазмидного вектора, в котором Nos-Pro представляет собой промотор нопалинсинтазы; NPTII представляет собой неомицинфосфотрансферазу; Nos-Ter представляет собой терминатор нопалинсинтазы; 35S-Pro представляет собой промотор 35S вируса мозаичной болезни цветной капусты; MTD-AN-GDH представляет собой полученный из Aspergillus nidulans ген глутаматдегидрогеназы (GDH) с присоединенным митохондриальным транзитным пептидом; НРТ представляет собой гигромицинфосфотрансферазу; Н представляет собой Hindill, B представляет собой BamHI, Х представляет собой Xbal, Sp представляет собой Spel, E представляет собой EcoRI, LB представляет собой левый пограничный край и RB представляет собой правый пограничный край.

На фиг.2 показаны результаты анализа ПЦР трансформированного картофеля, причем А отражает применение An-GDH-ген-специфических праймеров и В отражает применение NPTII-ген-специфичных праймеров. Дорожка 1 представляет собой маркер со 100 п.н., дорожка 2 представляет собой нетрансформированный картофель, дорожка 3 представляет собой трансформированный картофель Mtd1, дорожка 4 представляет собой трансформированный картофель Mtd2, дорожка 5 представляет собой трансформированный картофель Mtd3, дорожка 6 представляет собой трансформированный картофель Mtd5, и дорожка 7 представляет собой трансформированный картофель Mtd8.

На фиг.3 показаны результаты анализа ПЦР трансформированного Arabidopsis thaliana, причем А отражает применение An-GDH-ген-специфичных праймеров и В отражает применение NPTII-ген-специфичных праймеров. Дорожка 1 представляет собой маркер со 100 п.н., дорожка 2 представляет собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana, дорожка 3 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 2, дорожка 4 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 3, и дорожка 5 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 4.

На фиг.4 показаны результаты нозерн-анализа трансформированных картофельных растений, причем А обозначает РНК, экстрагированную из ткани листьев, и В обозначает РНК, экстрагированную из клубней. Рисунки получали окрашиванием бромидом этидия 10 мкл тотальной РНК, которая была подвергнута электрофорезу (нижние рисунки как в А, так и в В). В качестве зонда применяли полноразмерный An-GDH-ген. Дорожка 1 представляет собой нетрансформированный картофель, дорожка 2 представляет собой трансформированный картофель Mtd1, дорожка 3 представляет собой трансформированный картофель Mtd 2, дорожка 4 представляет собой трансформированный картофель Mtd 3, дорожка 5 представляет собой трансформированный картофель Mtd 5 и дорожка 6 представляет собой трансформированный картофель Mtd 8.

На фиг.5 показаны результаты нозерн-анализа трансформированного Arabidopsis thaliana. Применяли РНК, экстрагированную из тканей листьев. Рисунки (нижние рисунки) получали окрашиванием бромидом этидия 10 мкл тотальной РНК, которая была подвергнута электрофорезу. В качестве зонда применяли полноразмерный An-GDH-ген. Дорожка 1 представляет собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana, дорожка 2 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 2, дорожка 3 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 3, и дорожка 4 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana Mtd 4.

Фиг. от 6А до 6С представляют собой графики, показывающие содержание 2-оксоглутарата (2-OG), мочевины и нитрата GDH-трансформированных растений (Arabidopsis thaliana). Вертикальная ось указывает число молей (нмоль) на сырую массу соответственно, причем Mtd3-10 представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana (штамм № 3) и Columbia представляет собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana (n = 3).

Фиг. от 6D до 6F представляют собой графики, показывающие содержание 2-оксоглутарата (2-OG), мочевины и нитрата GDH-трансформированных растений (картофеля). Вертикальная ось указывает число молей (нмоль) на сырую массу соответственно, причем Mtd-8 представляет собой трансформированный картофель и контроль представляет собой нетрансформированный картофель (n = 3).

Фиг.7 представляет собой график, показывающий содержание 2-OG ткани листьев Arabidopsis thaliana спустя 3 недели культивации на среде PNS, содержащей различные количества KNO₃. Число молей (нмоль) для каждой живой массы показано на вертикальной оси, причем С представляет собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana и М представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana (штамм Mtd 3) (n = 3).

Фиг.8 представляет собой график, показывающий содержание нитрата в ткани листьев Arabidopsis thaliana после 3 недель культивации на среде PNS, содержащей различные количества KNO₃. Число молей (нмоль) для каждой живой массы показано на вертикальной оси, причем С представляет собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana и М представляет собой трансформированный Arabidopsis thaliana (штамм Mtd 3) (n = 3).

На фиг.9 показаны результаты сравнительного анализа первичной структуры аминокислотных последовательностей глутаматдегидрогеназы для высших растений, в которых AtGDH1 представляет собой GDH1 Arabidopsis thaliana, AtGDH2 представляет собой GDH2 Arabidopsis thaliana, LeGDH представляет собой GDH томата (Lycopersicon esculentum), NtGDH представляет собой GDH табака (Nicotiana tabacum) и ZmGDH представляет собой GDH кукурузы (Zea Mays).

На фиг.10 показаны результаты сравнительного анализа первичной структуры для аминокислотных последовательностей GDH плесени и GDH растения (томата), причем AaGDH представляет собой GDH Aspergillus awamori, AnGDH представляет собой GDH Aspergillus nidulans и LeGDH представляет собой GDH томата.

Фиг.11 представляет собой график, показывающий содержание пролина в ткани листьев спустя 1 и 5 часов после некорневой подкормки водным раствором диффундирующего агента, мочевины и пролина (n = 6) нанесением на ткани листьев картофеля соответственно, причем А указывает содержание через 1 час после нанесения и В указывает содержание через 5 часов после нанесения.

Фиг.12 представляет собой график, показывающий содержание 2-OG в ткани листьев спустя 1 и 24 часа после некорневой подкормки водным раствором диффундирующего агента, мочевины и пролина (n = 6) нанесением на ткани листьев картофеля соответственно, причем А указывает содержание через 1 час после нанесения и В указывает содержание через 24 часа после нанесения.

На фиг.13 показаны результаты анализа ПЦР генома Arabidopsis thaliana, трансформированного MtdECASPC. Анализ ПЦР проводили с применением ECASPC-специфичных праймеров в реакции из 30 циклов, состоящих из 1 минуты при 94°С, 1 минуты при 55°С и 2 минут при 72°С. После электрофореза в 1% геле агарозы проводили окрашивание бромидом этидия. Дорожка 1 представляет собой маркер с 1 т.п.н., дорожка 2 представляет собой ДНК плазмиды mtdECASPC, дорожка 3 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC2-2, дорожка 4 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC6-2, дорожка 5 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC8-1 и дорожка 6 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC9-1.

На фиг.14 показан ОТ-ПЦР-анализ трансформированного mtdECASPC Arabidopsis thaliana. РНК экстрагировали из ткани листьев Arabidopsis thaliana с применением набора Qiagen Plant Rneasy Mini-Kit. ОТ-ПЦР проводили с применением набора TaKaRa РНК-ПЦР с ECASPC-специфичными праймерами в реакции 30 циклов, состоящих из 1 минуты при 94°С, 1 минуты при 55°С и 2 минут при 72°С. После электрофореза в 1% геле агарозы проводили окрашивание бромидом этидия. Дорожка 1 представляет собой маркер с 1 т.п.н., дорожка 2 представляет собой ДНК плазмиды mtdECASPC, дорожка 3 представляет собой РНК без реакции обратной транскриптции, дорожки 4-5 представляют собой нетрансформированный Arabidopsis thaliana, дорожка 6 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC2-2, дорожка 7 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC6-2, дорожка 8 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC8-1 и дорожка 9 представляет собой трансформированную mtdECASPC Arabidopsis thaliana mtdECASPC9-1.

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Как описано выше, авторы изобретения предполагают существование сигнальной молекулы, которая дает возможность клеткам растений ощущать условия питания азотом. Она является сигнальной молекулой, которая всестороннее регулирует абсорбцию и метаболизм азота в клетках растений, и считается, что посредством искусственного повышения или снижения количества этого вещества возможно поддержание в клетках растения абсорбции и метаболизма азота в повышенном состоянии. Кроме того, поскольку считается, что растение в таком стимулированном состоянии способно активно включать в себя азот из внешней среды, полагают, что азот может быть пополнен в условиях ограничения уровня азота, в результате чего происходит усиление роста и повышение урожайности. Кроме того, авторы изобретения предположили, что 2-оксоглутарат (2-OG) является такой сигнальной молекулой.

Первой стадией ассимиляции неорганического азота в органическую форму в растениях является в основном включение аммиака в глутамат для образования глутамина, реакция, которая катализируется глутаминсинтетазой (GS) и глутаматсинтетазой (GOGAT), как уже указано выше, считается, что этот цикл GS/GOGAT является основным путем ассимиляции азота в растениях. Следовательно, считается, что степень ассимиляции азота или степень недостатка азота в клетках растения отражает количество 2-OG.

Авторы изобретения предложили индуцирование сверхэкспрессии активности глутаматдегидрогеназы (GDH) или активности аспартатаминотрансферазы (ASPC) в качестве одного способа повышения содержания 2-OG в клетках растений. GDH катализирует обратимые реакции включения аммиака в 2-OG с продуцированием глутамата и высвобождения аммиака из глутамата с образованием 2-OG. Однако считается, что вследствие того, что в общем GDH имеет высокую величину Km относительно аммиака, более вероятно, что она разлагает глутамат на 2-OG и аммоний, чем включает аммиак в 2-OG с образованием глутамата, так что ожидается повышение образования 2-OG как результат реакции. С другой стороны, аспартатаминотрансфераза является ферментом, который катализирует реакцию переноса аминогрупп оксалоацетата, что приводит к продуцированию аспарагиновой кислоты и 2-OG, поэтому предполагалось повышение содержания 2-OG.

Авторы изобретения получили трансформированные растения, в которые введен ген GDH или ген ASPC, и подтвердили действительное повышение содержания 2-OG, а также подтвердили, что рост и урожайность этих растений были повышенными в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровня ниже нормальных условий культивации.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую ген глутаматдегидрогеназы (GDH) или ген аспартатаминотрансферазы (ASPC), вводят в растение для получения растения, которое имеет повышенное содержание 2-OG вследствие экспрессии гена глутаматдегидрогеназы (GDH) или гена аспартатаминотрансферазы (ASPC) в образовавшемся трансформированном растении и которое имеет усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровня ниже нормальных условий культивации.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения число копий и/или транскрибированное количество эндогенного гена GDH или эндогенного гена ASPC увеличивают для повышения активности GDH или ASPC с повышенным содержанием 2-OG растительного организма, что приводит к получению растения с усиленным ростом и/или повышенной урожайностью в условиях культивации, когда содержание азота ограничивают до уровня ниже нормальных условий культивации. Для увеличения транскрибированного количества может быть введена конструкция гена, способная экспрессировать фактор активации транскрипции и/или энхансер или другой цис-функциональный элемент. Такие факторы активации транскрипции и цис-функциональные элементы являются хорошо известными специалистам в данной области.

Не существует определенных ограничений по происхождению глутаматдегидрогеназы, применяемой в настоящем изобретении, но предпочтительно применяют глутаматдегидрогеназу из микроорганизма, принадлежащего к роду Aspergillus. Более предпочтительно применяют глутаматдегидрогеназу, полученную из Aspergillus nidulans и Aspergillus awamori. Кроме того, в настоящем изобретении можно применять глутаматдегидрогеназу, имеющую одну или несколько аминокислотных делеций, замещений или добавок в ферментном белке, до тех пор, пока она имеет указанную выше активность глутаматдегидрогеназы и селективно катализирует реакцию продуцирования 2-OG и аммиака из глутамата в физиологических условиях в растительных организмах.

Не имеется также особых ограничений по происхождению аспартатаминотрансферазы, применяемой в настоящем изобретении, но предпочтительно применяют аспартатаминотрансферазу, полученную из Escherichia coli. Кроме того, можно применять аспартатаминотрансферазу, имеющую одну или несколько аминокислотных делеций, замещений или добавок в ферментном белке, до тех пор, пока она имеет указанную выше активность аспартатаминотрансферазы.

Что касается локализации глутаматдегидрогеназы или аспартатаминотрансферазы в клеточных органеллах, можно применять глутаматдегидрогеназу или аспартатаминотрансферазу, локализованную в митохондрии, хлоропласте, пероксисоме или тому подобное, а также глутаматдегидрогеназу или аспартатаминотрансферазу, локализованную в цитоплазме. Следовательно, в настоящем изобретении можно также применять ген глутаматдегидрогеназы или аспартатаминотрансферазы, имеющий добавленный к его N- или С-концу либо сигнальный, либо транзитный пептид для переноса ферментного белка к этим клеточным органеллам.

Такой ген глутаматдегидрогеназы или его кДНК могут быть получены относительно легко специалистом в данной области на основе опубликованных данных по последовательности. В случае гена глутаматдегидрогеназы Aspergillus nidulans, например, нуклеотидная последовательность геномного гена опубликована под номером доступа GenBank X16121. Нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID №: 1 и аминокислотная последовательность показана в SEQ ID №: 2. кДНК глутаматдегидрогеназы может быть легко получена синтезом праймеров ПЦР для амплификации ДНК-фрагментов так, чтобы включить часть, кодирующую белок на основе его последовательности, и проведением ОТ-ПЦР с применением в качестве матрицы РНК, экстрагированную из культивированных клеток Aspergillus nidulans. Последовательность кДНК гена глутаматдегидрогеназы Aspergillus nidulans показана в SEQ ID №: 17. Aspergillus nidulans может быть получен, например, в качестве АТСС10074 или АТСС11267 из Американской коллекции типовых культур. Последовательность генома для гена глутаматдегидрогеназы Aspergillus awamori также опубликована под номером доступа GenBank Y15784. Эта нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID №: 3 и аминокислотная последовательность показана в SEQ ID №: 4. Последовательность кДНК гена глутаматдегидрогеназы Aspergillus awamori показана в SEQ ID №: 18. Сам Aspergillus awamori может быть получен из Американской коллекции типовых культур в качестве АТСС10548 и АТСС11358. кДНК глутаматдегидрогеназы может быть получена способами, подобными способам, описанным выше, на основе их штаммов и информации о последовательности.

Гомология между GDH Aspergillus nidulans и GDH Aspergillus awamori составляет приблизительно 84% в аминокислотной последовательности (фигура 10).

Кроме того, сравнительные результаты для аминокислотных последовательностей GDH Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori и томата (Lycopersicon esculentum) показаны на фиг.10, тогда как сравнительные результаты для аминокислотных последовательностей GDH1 Arabidopsis thaliana, GDH2 Arabidopsis thaliana, GDH томата, GDH табака (Nicotiana Tabacum) и GDH кукурузы (Zea mays) показаны на фиг.9.

В настоящем изобретении растения, которые имеют усиленный рост и/или повышенную урожайность в условиях культивации, когда содержание азота снижают ниже уровня обычных условий культивации, и которые имеют повышенное содержание 2-OG растения, могут быть получены с применением генов, которые кодируют различные ферменты, которые продуцируют 2-OG из глутамата и которые отличаются от гена глутаматдегидрогеназы. Примеры таких ферментов включают аспартатаминотрансферазу и аланинаминотрансферазу.

Например, нуклеотидная последовательность ДНК генома для гена аспартатаминотрансферазы штамма К-12 E. coli зарегистрирована под номером доступа GenBank Х03629. Ген аспартатаминотрансферазы может быть легко получен синтезом праймеров ПЦР на основании этой последовательности так, чтобы амплифицировать ДНК-фрагмент, содержащий район, кодирующий белок, и проведением ПЦР с применением этих праймеров с хромосомной ДНК, экстрагированной из штамма К-12 Е. coli в качестве матрицы.

В настоящем изобретении рост и/или урожайность растений в условиях ограничения уровня азота, где содержание азота ограничивают до уровня ниже нормальных условий культивации, могут быть повышены нанесением пролина на поверхность листьев в качестве средства повышения содержания 2-OG в растениях. Пролин, нанесенный на листья, будет включаться в ткань листьев и метаболизироваться в глутамат. Кроме того, поскольку этот глутамат метаболизируется в 2-OG эндогенной глутаматдегидрогеназой, он может повысить содержание 2-OG в ткани. Растение, содержание 2-OG которого повысилось этим путем, нанесением пролина на поверхности листьев, усиливало рост и/или повышало урожайность в условиях, в которых количество доступного азота во время периода культивации ограничивают ниже количества в обычных условиях культивации.

Конструкция нуклеиновой кислоты, которую можно применять в настоящем изобретении, может быть получена с применением обычных способов, известных специалисту в данной области. Например, Sambrook et al, Molecular Cloning-Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press или тому подобное можно применять для консультации в отношении способов молекулярной биологии, включающих способы выделения конструкции нуклеиновой кислоты и определения ее последовательности. В противоположность этому, в некоторых случаях генетическая амплификация, такая как ПЦР, необходима для получения конструкции нуклеиновой кислоты, которую можно применять в настоящем изобретении, и публикацию F. M. Ausbel et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) можно применять для консультации в случае таких способов.

Конструкции нуклеиновых кислот, которые можно применять в настоящем изобретении, обычно включают в себя подходящие промоторы, которые функционируют в клетках растений, такие как промотор гена нопалинсинтазы или промотор вируса мозаичности цветной капусты 35S (CaMV35S), подходящие терминаторы, такие как герминатор гена нопалинсинтазы, другие последовательности, которые являются необходимыми или полезными для экспрессии, и маркерные гены для выбора трансформантов, такие как гены устойчивости к лекарственным средствам, например устойчивости к канамицину, устойчивости к G418, устойчивости к гигромицину и тому подобное.

Промоторами, которые можно применять для таких конструкций, могут быть конститутивные промоторы или орган-специфические или специфические для стадии роста промоторы, они могут быть выбраны в зависимости от хозяина, необходимого количества экспрессии, органов, в которых экспрессия является особенно желательной, или стадии роста. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют сильный промотор, который экспрессируется путем, не специфичным для органов и стадий роста, одним примером такого промотора является промотор CaMV35S. Орган-специфические промоторы, которые можно применять, включают в себя промотор гена фазеолина и промотор гена пататина. В наиболее желательном варианте осуществления настоящего изобретения применяют конструкцию, которая регулирует ген глутаматдегидрогеназы или ген аспартатаминотрансферазы при помощи сильного структурного промотора, такого как промотор CaMV35S.

Не существуют определенные ограничения по способу введения гена, применяемому в настоящем изобретении, и способ, известный специалисту в данной области для введения генов в клетки растений или организмы растений, может быть выбран в соответствии с хозяином. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения применяют способ введения гена с применением Agrobacterium. В этой системе трансформации предпочтительно применяют бинарный вектор. При применении Agrobacterium конструкция нуклеиновой кислоты, применяемая в трансформации гена, может включать в себя также Т-ДНК-район, фланкирующий ДНК-последовательность, которую нужно ввести в клетки растения. В предпочтительном варианте осуществления введенную последовательность встраивают между левой и правой пограничными последовательностями T-ДНК. Подходящая разработка и конструкция вектора трансформации, основанная на такой Т-ДНК, хорошо известна специалисту в данной области. Условия инфицирования растения Agrobacterium, имеющей такую конструкцию нуклеиновой кислоты, также хорошо известны специалистам в данной области. Что касается таких способов и условий, см. Shujunsha Pub. Saibou Rongaku Supplement, "Experimental Protocols in model Plants: Rice and Arabidopsis thaliana" (1996).

В настоящем изобретении можно применять другой способ введения гена. Примеры способов введения гена, которые можно применять, включают в себя введение протопластной ДНК с применением полиэтиленгликоля или кальция, трансформацию протопласта с применением электропорации и введение с применением способа выстреливания частицами и тому подобное.

Не имеются определенные ограничения по растению, которое подвергают генетической манипуляции этим путем, желательно применять вид, который можно легко трансформировать и для которого установлена генеративная система, за исключением случаев, когда трансформацию проводят с применением цельного растения. Кроме указанных выше свойств, подходящим растением в настоящем изобретении является растение, для которого установлены способы массовой культивации, чтобы уменьшить нагрузку на окружающую среду сельского хозяйства. Примеры растений, которые являются подходящими для настоящего изобретения, включают в себя все растения семейства Brassica, а также томаты, картофель, кукуруза, пшеница, рис, сахарный тростник, соевые бобы, сорго и тому подобное. Примеры растений, которые трудно питать большими количествами азота, включают в себя деревья и фруктовые деревья, такие как тополь, эвкалипт и яблоневые деревья. Активности и свойства GDHs и ASPCs этих растений являются эквивалентными активностям и свойствам полученного из Aspergillus nidulans GDH (SEQ ID №№: 1 и 2) и полученного из штамма К-12 E. coli ASPC (SEQ ID №№: 19 и 20), применяемых в одном варианте осуществления настоящего изобретения. Следовательно, содержание 2-OG в этих растениях может быть повышено введением в них полученного из Aspergillus nidulans гена GDH (SEQ ID №: 1) или полученного из E. coli гена ASPC (SEQ ID №: 1). Ген GDH или ген ASPC, полученный из любого из этих растений, можно было также применять таким же образом в настоящем изобретении. Не имеется определенных ограничений по тому, какие органы или клетки подвергают генетической манипуляции, как описано выше, их можно выбрать в зависимости от хозяина, способа генетического введения и тому подобное. Примеры включают в себя орган-эксплантат, пыльцу, культивированные клетки, зародыш, растительные организмы и тому подобное, но не ограничиваются ими.

Для трансформации выбирают клетки растений или подобное, которые подвергали манипуляции, как описано выше. Выбор может быть основан на экспрессии маркерного гена, который присутствует на конструкции нуклеиновой кислоты, применяемой для трансформации. Например, когда маркерным геном является устойчивый к лекарственному средству ген, подвергнутые манипуляции клетки растений или подобные материалы могут быть культивированы или выращены на среде, содержащей подходящую концентрацию антибиотика, гербицида или тому подобное. Если маркерным геном является ген бета-глюкуронидазы, ген люциферазы или тому подобное, трансформант может быть выбран скринингом по его активности. Когда трансформант, идентифицированный этим путем, не является растительным организмом, но является протопластом, каллюсом, эксплантатом или тому подобное, его можно регенерировать в цельном растительном организме. Способ, известный специалисту в данной области, можно применять для регенерации в зависимости от растения-хозяина.

Образовавшееся цельное растение можно культивировать обычными способами или, другим словами, в тех же самых условиях, как и нетрансформат, и кроме указанной выше селекции, основанной на маркерных генах, для идентификации трансформированных растений, содержащих конструкцию нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, можно применять различные способы молекулярной биологии. Для детекции присутствия или отсутствия структуры рекомбинантной ДНК-встроенных фрагментов можно применять, например, саузерн-гибридизацию или ПЦР. Для детекции и измерения продуктов транскрипции РНК, полученных из введенной конструкции нуклеиновой кислоты, можно применять назерн-гибридизацию, ОТ-ПЦР и тому подобное.

Затем экспрессию гена глутаматдегидрогеназы или гена аспартатаминотрансферазы образовавшимся трансформантом оценивают измерением количества белка, мРНК или ферментативной активности глутаматдегидрогеназы или аспартатаминотрансферазы. Например, количество белка глутаматдегидрогеназы или белка аспартатаминотрансферазы можно оценить вестерн-блоттингом или подобным образом и количество мРНК можно оценить назерн-блоттингом или количественной ОТ-ПЦР. Активность глутаматдегидрогеназы в экстракте растения можно измерить способом Ameziane et al (Ameziane, R., Bernhard, K. and Lightfood, D., Plant and Soil 221: 47-57, 2000). Активность аспартатаминотрансферазы в экстракте растения можно измерить способами Chao et al (Chao, Y. P., Lai, Z.I., Chen, P. and Chen. J.T., Biotechnology Progress 15:453-458, 1999).

Трансформированное растение, в котором экспрессию или повышенную экспрессию гена глутаматдегидрогеназы или гена аспартатаминотрансферазы подтвердили, дополнительно оценивают на со