Коринеформная бактерия, продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты

Коринеформная бактерия, продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к промышленной микробиологической ферментации. Более конкретно, настоящее изобретение относится к методике придания способности утилизировать метанол микроорганизму, не имеющему наследственно такой способности, или усилению такой способности у микроорганизма, обладающего такой способностью на низком уровне, и к способу получения целевого вещества путем утилизации метанола при использовании микроорганизма, полученного посредством такой методики, указанной выше.

Вещества, получаемые по настоящему изобретению, включают L-аминокислоты, нуклеиновые кислоты, антибиотики, витамины, ростовые факторы, физиологически активные вещества и т.д., которые традиционно получают с помощью микроорганизмов.

Уровень техники

К настоящему времени большинство сырьевых материалов, используемых для получения полезных веществ путем микробной ферментации, представляют собой сахара, полученные из сельскохозяйственных продуктов. Поскольку стоимость сахаров, получаемых из сельскохозяйственных продуктов, имеет тенденцию повышаться, желательно иметь недорогой материал хорошего качества, такой как альтернативный сырьевой материал для ферментации.

Метанол легко растворяется в воде, является недорогим продуктом и может быть получен с достаточно высокой степенью чистоты. Кроме того, он относительно легко может быть получен из метана, который является основным компонентом природного газа. В этой связи он предпочтителен в качестве сырья для получения нужных веществ. Если метанол использовать в качестве сырья для микробной ферментации, может быть снижена не только стоимость основного сырьевого материала, но также стоимость очистки продуктов, выделяемых из растворов, образуемых в ходе ферментации, а также может быть упрощена процедура утилизации отходов в растворе. Таким образом, стоимость всего процесса получения может быть снижена. Способы получения веществ, в особенности аминокислот, с использованием метанола в качестве сырья, утилизируемого микроорганизмами, известны и включают способ с использованием микроорганизма из рода Achromobacter или Pseudomonas (Публикация патента Японии (Kokoku) № 45-25273), способ с использованием микроорганизма из рода Protaminobacter или Methanomonas (публикация выложенной заявки на патент Японии (Kokai) № 50-25790), способ с использованием микроорганизма из рода Methylobacillus (публикация выложенной заявки на патент Японии № 4-91793), способ с использованием метилотрофной бактерии, принадлежащей к роду Bacillus (публикация выложенной заявки на патент Японии № 3-505284, патент США № 6083728) и т.д.

Однако известным бактериальным штаммам не свойственна высокая приобретенная продуктивность в отношении аминокислот, необходимая для практического применения бактерий.

Тем временем, способ использования микроорганизмов из рода Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus или Escherichia представляет собой основное направление производства аминокислот из глюкозы (см. "Amino Acid Fermentation", Ed. By H. Aida et al., the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1-е издание, опубликованное 30 мая 1986). Указанные бактерии, продуцирующие аминокислоты, представляют собой ценные бактериальные штаммы, создаваемые путем введения различных мутаций, в результате которых достигается максимальная продуктивность в отношении аминокислоты, проведением дополнительной работы по селекции с практической целью. Однако для этого требуется длительное время. И, кроме того, такие используемые в промышленности штаммы не могут утилизировать метанол.

Краткое описание сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является получение новой коринеформной бактерии, которая обладает способностью продуцировать в ходе ферментации продукт, такой как аминокислота, при использовании метанола в качестве сырьевого материала для ферментации, путем придания способности утилизировать метанол коринеформной бактерии, которая имеет наследственную способность утилизировать сахар, но не может утилизировать метанол, или путем повышения такой способности у бактерии, имеющей уже такую способность, но на низком уровне. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения целевого вещества из метанола и использование такой бактерии.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения целевого вещества с использованием коринеформной бактерии, включающего: (А) культивирование коринеформной бактерии, имеющей способность продуцировать целевое вещество в среде, приводящее к накоплению целевого вещества в среде или клетках бактерии, и (В) отбор целевого вещества из среды или клеток бактерии, отличающегося тем, что в коринеформную бактерию вводят ген метанолдегидрогеназы, ген гексулозофосфатсинтазы и ген фосфогексулоизомеразы и указанную бактерию модифицируют таким образом, что она приобретает способность утилизировать метанол, когда среда содержит метанол в качестве источника углерода.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка указанного выше способа, при котором в бактерию также вводят ген, кодирующий фактор, усиливающий активность метанолдегидрогеназы.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка указанного выше способа, в рамках которого целевым веществом является L-аминокислота.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка указанного выше способа, в рамках которого указанная L-аминокислота представляет собой L-лизин.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка указанного выше способа, в рамках которого указанная бактерия принадлежит к роду Corynebacterium.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка указанного выше способа, в рамках которого указанная коринеформная бактерия представляет собой Corynebacterium glutamicum.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение коринеформной бактерии, в которую введен ген метанолдегидрогеназы, ген гексулозофосфатсинтазы и ген фосфогексулоизомеразы и которая модифицирована таким образом, что приобретает способность утилизировать метанол.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение указанной выше коринеформной бактерии, в которую введен ген, кодирующий фактор, усиливающий активность метанолдегидрогеназы.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение указанной выше коринеформной бактерии, которая принадлежит к роду Corynebacterium.

И еще одной целью настоящего изобретения является получение указанной выше коринеформной бактерии, которая представляет собой Corynebacterium glutamicum.

В соответствии с настоящим изобретением способность утилизировать метанол может быть придана коринеформной бактерии, которая в природе не может утилизировать метанол, и таким образом может быть получен микроорганизм, способный утилизировать недорогой метанол в качестве источника углерода или источника энергии для коринеформной бактерии. Кроме того, при использовании полученного микроорганизма могут быть получены различные продукты ферментации из метанола, добавляемого в среду.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения провели скрупулезное исследование, прежде чем достигли указанных выше целей. В результате ими было обнаружено, что при введении в коринеформную бактерию генов, кодирующих гексулозофосфатсинтазу и фосфогексулоизомеразу, а также метанолдегидрогеназу, для экспрессии указанных генов в бактерии, такой бактерии может быть придана способность утилизировать метанол или уже имеющаяся у бактерии такая способность может быть усилена, что составило сущность настоящего изобретения.

Ниже приведено более подробное описание настоящего изобретения.

Коринеформная бактерия по настоящему изобретению представляет собой бактерию, которая содержит ген, кодирующий метанолдегидрогеназу, введенный в нее вместе с другими генами, кодирующими гексулозофосфатсинтазу и фосфогексулоизомеразу, и которая модифицирована таким образом, что приобретает способность утилизировать метанол, или такая способность у нее повышается.

Микроорганизм, который утилизирует метанол, содержит метанолоксидазу (например, метанолдегидрогеназу), и она способна к диссимиляции или ассимиляции формальдегида, получаемого при окислении метанола в условиях строгой метаболической регуляции. Это связано с тем, что формальдегид очень токсичен для организмов, и в этой связи клетки должны очень быстро его утилизировать в качестве источника углерода или источника энергии или выделять его путем детоксикации. С другой стороны, если желательно придать способность утилизировать метанол микроорганизму, который не может использовать метанол, то безусловно необходимо вводить метанолоксидазу. Однако способы соответствующего удаления формальдегида, продуцируемого за счет экспрессии активности метанолоксидазы, чрезвычайно специфичны, и в этой связи считается, что обычным микроорганизмам невозможно придать способность утилизировать метанол.

Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность утилизировать метанол может быть придана даже микроорганизму, который генетически не способен его утилизировать, в частности коринеформной бактерии, если в клетках микроорганизма будет содержаться фермент, обладающий способностью окислять метанол, а также если в микроорганизм будут одновременно введены гены, кодирующие гексулозофосфатсинтазу и фосфогексулоизомеразу, для экспрессии указанных генов.

Коринеформная бактерия по настоящему изобретению конкретно не ограничивается, поскольку указанные выше свойства могут быть приданы любой такой бактерии. Коринеформные бактерии включают те бактерии, которые по ранней классификации были отнесены к роду Brevibacterium, но в настоящее время объединены в род Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), и включают бактерии, принадлежащие к роду Brevibacterium, которые являются близкородственными к роду Corynebacterium. Ниже приведены примеры таких коринеформных бактерий.

Corynebacterium acetoacidophilum

Corynebacterium acetoglutamicum

Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)

Corynebacterium melassecolaCorynebacterium thermoaminogenes

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitalis

Brevibacterium album

Brevibacterium cerinum

Microbacterium ammoniaphilum

Конкретно, примеры такой бактерии включают Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172, см. патент США № 5188949) и т.п. как продуцент L-треонина; Brevibacterium lactofermentum AJ12435 (FERM BP-2294, см. патент США № 5304476), Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC 31269 см. патент США № 4066501) и AJ110135, описанный далее, и т.п. как продуцент L-лизина; Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172, публикация выложенной заявки на патент Японии № 5-26811, публикация выложенной заявки на патент Франции № 2701489), Brevibacterium lactofermentum AJ12475 (FERM BP-2922, см. патент США № 5272067), Brevibacterium lactofermentum AJ13029 (FERM BP-5189, см. международную патентную публикацию JP95/01586) и т.п. как продуцент L-глютаминовой кислоты; Brevibacterium lactofermentum AJ3718 (FERM P-2516, см. патент США № 3970519) и т.п. как продуцент L-лейцина; Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP-759, см. патент США № 4656135) и т.п. как продуцент L-изолейцина; Brevibacterium lactofermentum AJ12341 (FERM BP-1763, см. патент США № 5188948) и т.п. как продуцент L-валина; Brevibacterium lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160, см. публикацию выложенной заявки на патент Франции № 2686898) и т.п. как продуцент L-фенилаланина.

В результате тщательных исследований авторы настоящего изобретения смогли получить достаточную активность метанолдегидрогеназы и в то же время усилить функцию ассимиляции формальдегида, продуцируемого в ходе ферментативной реакции, как принципиального условия придания способности утилизировать метанол. Далее авторы настоящего изобретения пришли к пониманию, что усиление ферментативной активности гексулозофосфатсинтазы (ГФС) и фосфогексулоизомеразы (ФГИ), которые являются ключевыми ферментами рибулозомонофосфатного пути, будет эффективным для эффективной ассимиляции формальдегида. Таким образом, авторами было показано, что способность утилизировать метанол может иметь коринеформная бактерия, которая генетически не способна утилизировать метанол, путем введения в коринеформную бактерию генов, кодирующих ГФС и ФГИ вместе с геном метанолдегидрогеназы.

Метанолдегидрогеназа (МДГ), используемая по настоящему изобретению, представляет собой фермент, обладающий ферментативной активностью, способной окислять метанол, превращая его в формальдегид. Примером МДГ, которая может использоваться по настоящему изобретению, является, без ограничения, тип МДГ, зависимый от пиррохинолинхинона (ПХХ), который, в основном, встречается в грамотрицательных бактериях. Конкретно он может включать МДГ из Methylobacterium extorquens, штамм AM1 (Biochim. Biophys. Acta, 1119:97-106 (1992)) и т.п. Кроме того, настоящее изобретение включает встречающийся в грамположительных бактериях зависимый от НАД (никотинамидадениндинуклеотида) тип МДГ, конкретно МДГ из Bacillus methanoliocus (J. Bacteriol., 174:5346-5353 (1992)), алкогольдегидрогеназу (АДГ), полученную из Bacillus stearothermophilus, штамм DSM 2334 (Biochem. J., 252:661-666). Кроме того, рассматривается также АДГ из печени быка (Biochem. J., 100:34-46 (1996)) и печени человека (Arch. Toxicol., 72:604-607 (1998)). Кроме того, может быть также создан и далее использован мутантный тип алкогольдегидрогеназы, которая действует на метанол, также путем введения мутации в ген алкогольдегидрогеназы, которая генетически не действует на метанол, для модификации субстратной специфичности. Однако в качестве МДГ, которая может соответствующим образом использоваться в настоящем изобретении, рассматривается МДГ, полученная, например, из Bacillus brevis NCIMB No. 12524, которая представляет собой метанолассимилирующую бактерию, принадлежащую к роду Bacillus.

Ген, кодирующий МДГ (mdh), может быть получен из микроорганизма, который продуцирует МДГ, путем обычных методов клонирования. Так, например, ген МДГ может быть получен посредством ПЦР (полимеразно-цепьевой реакции) с использованием хромосомной ДНК из Bacillus brevis, штамм S1 (NCIMB 12524) в качестве матрицы и олигонуклеотидов, имеющих нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 и 2, в качестве праймеров. Способы получения библиотеки геномной ДНК, используемой для клонирования генов, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации и т.п., описаны в руководстве Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989). При этом функционирует ли ген МДГ в коринеформной бактерии, в которую вводят данный ген, можно подтвердить путем измерения активности МДГ в бактериальном лизате. Активность МДГ может быть вычислена, например, по методу определения уровня восстановления НАД⁺ (никотинамидадениндинуклеотида), сопровождающего окисление метанола в формальдегид, путем измерения поглощения при длине волны 340 нм.

Конкретные примеры mdh гена, используемого по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь, ген mdh из Bacillus brevis штамм S1. Ген mdh из Bacillus methanolicus, штамм C1 (NCIMB 13114, Eur. J. Biochem., 244:426-433 (1997)) был зарегистрирован в GenBank под номером М65004 (код для входа BACMDH).

Кроме того, имеется информация о существовании факторов, повышающих активность метанолдегидрогеназы (Amd: активатор метанолдегидрогеназы), таких как активатор метанолдегидрогеназы из Bacillus methanolicus, штамм C1 (Eur. J. Biochem., 244:426-433 (1997)) и продукт YqkG гена из Bacillus subtilis, штамм 168 (публикация выложенной заявки на патент Японии № 2000-69976). Указанные факторы являются эффективным средством повышения активности МДГ. Активность МДГ в бактериальных клетках может быть повышена за счет введения ДНК, кодирующей указанные факторы МДГ (ген amd), в коринеформную бактерию, имеющую ген МДГ. Ген, кодирующий активатор метанолдегидрогеназы (amd), такой как ген YqkG, может быть получен из хромосомной ДНК Bacillus subtilis, такой как Bacillus subtilis, штамм 168, путем ПЦР с использованием хромосомной ДНК в качестве матрицы и праймеров, имеющих нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11 и 12 в перечне последовательностей.

В качестве конкретного примера гена yqkG, используемого по настоящему изобретению, рассматривается ген YqkG из Bacillus subtilis, штамм 168. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность, кодируемая указанным геном, приведены в SEQ ID NO: 15 и 16.

В настоящем описании приводятся способы экспрессии активности ГФС и ФГИ в бактерии.

Для экспрессии активностей ГФС и ФГИ в целевой коринеформной бактерии ген, кодирующий ГФС (hps) или ФГИ (phi), может быть лигирован с вектором, который функционирует в целевой бактерии, предпочтительно с вектором мультикопийного типа, с получением рекомбинантной ДНК и далее использован для трансформации целевой бактерии. Число копий гена hps или гена phi в клетке трансформанта при этом повышается, и в результате повышается каждая из указанных ферментативных активностей.

Ген hps или ген phi может быть получен из микроорганизма, который образует ГФС и ФГИ, с использованием обычных методов клонирования, аналогичных таковым, применяемым при работе с геном МДГ.

В качестве микроорганизма, который образует ГФС, известны Methylomonas capsulatus (J.R.Quayle, Methods in Enzymology, 188, p. 314, 1990), Methylomonas, штамм М15 (Methods in Enzymology, 188, p. 319, 1990), Methylomonas aminofaciens, штамм 77а (Biochim. Biophys. Acta., 523, p. 236 1978), Mycobacterium gastri, штамм МВ19 (Methods in Enzymology,188, p. 393, 1990), Acetobacter methanolicus, штамм MB58 (Methods in Enzymology, 188, p. 401, 1990) и т.п.

Далее, в качестве микроорганизма, который образует ФГИ, известны Methylomonas aminofaciens, штамм 77а (Agric. Biol. Chem., 41(7), p. 1133, 1977), Mycobacterium gastri (публикация выложенной заявки на патент Японии № 11-127869), которая представляет собой грамположительную факультативную метанол-ассимилирующую бактерию, и т.п. Далее, имеется сообщение о наличии гена hps и гена phi в Bacillus subtilis (J. Bacteriol., 181:7154-7160 (1999)). Кроме того, имеется сообщение о том, что в Bacillus brevis, штамм S1, который представляет собой метанол-ассимилирующую бактерию, принадлежащую к роду Bacillus, ген hps и ген phi существуют в виде тандема на хромосомной ДНК (Annual Meeting of the Society for Fermentation and Bioengineering Japan, Lecture Abstracts, p. 113 (2000); FEMS Microbiology Letters, 214, 189-193, 2002). Фрагмент ДНК, содержащий гены hps и phi, может быть получен путем ПЦР с использованной хромосомной ДНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов, имеющих нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13 и 14, в качестве праймеров.

Конкретный пример гена hps и гена phi, используемых по настоящему изобретению, включают ген hps и ген phi из Bacillus subtilis, штамм 168, и ген hps и ген phi из Bacillus brevis, штамм S1. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего гены hps и phi из Bacillus brevis, штамм S1, показана в SEQ ID NO: 17. Аминокислотная последовательность, кодируемая данными генами, показана в SEQ ID NO: 18 и 19 соответственно.

Bacillus methanolicus, штамм РВ1 (NCIMB 13113), и Bacillus brevis, штамм S1 (NCIMB 12524), могут быть получены из Национальной Коллекции промышленных и морских бактерий (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) (Адрес: NCIMB Lts. Torry Research Station135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Великобритания).

Активность ГФС может быть измерена по способу, описанному в руководстве по энзимологии (Methods in Enzymology, 188, p. 397-401, 1990). Активность ФГИ может быть также измерена по другому способу, также описанному в литературе (Journal of Bacteriology, 181, p. 7154-7160 (1999)).

Амплификация активности ГФС или ФГИ может быть достигнута путем введения множественных копий гена hps или гена phi в хромосомную ДНК целевой коринеформной бактерии. Для введения множественных копий гена hps или гена phi в хромосомную ДНК целевой коринеформной бактерии проводят гомологичную рекомбинацию с использованием в качестве мишени последовательности, множественные копии которой имеются на хромосомной ДНК. В качестве последовательностей, множественные копии которых имеются на хромосомной ДНК, могут использоваться повторные последовательности ДНК или инвертированные повторы, имеющиеся на конце перемещаемого элемента. Кроме того, как описано в публикации выложенной заявки на патент Японии № 2-109985, можно также включить ген hps или ген phi в транспозон, который затем подвергают трасфекции, с целью введения множественных копий генов в хромосомную ДНК. С использованием любого из указанных способов может быть достигнуто повышение активности ГФС или ФГИ как результат повышения числа копий гена hps или гена phi в трансформированном штамме.

Помимо указанного выше способа амплификации гена, повышение активности ГФС или ФГИ может быть также достигнуто путем замены регуляторной последовательности экспрессии, такой как промотор гена hps или гена phi, более сильным промотором (см. публикацию выложенной заявки на патент Японии № 1-215280). Примеры сильных промоторов включают lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, Р_R промотор и P_L промотор фага ламбда, tet промотор, amyE промотор, veg промотор и т.д. Замена указанных промоторов повышает экспрессию гена hps или гена phi, и таким образом повышается активность ГФС или ФГИ. Усиление регуляторно экспрессируемой последовательности экспрессии может быть объединено с повышением числа копий ГФС или ФГИ.

Гены mdh, hps, phi и amd, используемые по настоящему изобретению, не ограничиваются генами дикого типа, и настоящее изобретение также относится к мутантному или искусственно модифицированному гену, кодирующему генный продукт, включая замещение, делецию, инсерцию, добавление или инверсию одной или нескольких аминокислот в одном или более сайтах, с одним условием, чтобы функция кодируемого МДГ, ГФС, ФГИ или Amd белка не снижалась. Хотя указанное здесь число "несколько" аминокислот различается в зависимости от положения или типа аминокислотных остатков в трехмерной структуре белка, их число может конкретно составлять от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5.

Кроме того, в качестве ДНК, кодирующей белок, по существу идентичный белку МДГ, настоящее изобретение относится к ДНК, гибридизируемой с последовательностью, зарегистрированной в GenBank под номером М65004 (код входа BACMDH), или с зондом, который получают из нуклеотидной последовательности в жестких условиях и который кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности МДГ.

В качестве ДНК, кодирующей белок, по существу идентичный указанному выше белку Amd, настоящее изобретение относится к ДНК, гибридизуемой с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15, включающей от 1 до 555 нуклеотидов, или с зондом, который может быть получен из нуклеотидной последовательности в жестких условиях и который кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности Amd.

В качестве ДНК, кодирующей белок, по существу идентичный белку ГФС, настоящее изобретение относится к ДНК, гибридизуемой с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NOS: 17, включающей от 508 до 1140 нуклеотидов, или с зондом, который может быть получен из нуклеотидной последовательности в жестких условиях и который кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности ГФС.

Далее в качестве ДНК, кодирующей белок, по существу идентичный белку ФГИ, настоящее изобретение относится к ДНК, гибридизуемой с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17, включающей от 1149 до 1700 нуклеотидов, или с зондом, который может быть получен из нуклеотидной последовательности в жестких условиях и который кодирует белок, имеющий активность, аналогичную активности ФГИ.

Термин "в жестких условиях" означает условия, при которых образуется так называемый специфический гибрид, а неспецифический гибрид не образуется. Трудно четко определить такие условия с помощью цифровых значений. Однако жесткие условия включают условия, при которых ДНК, имеющие высокую гомологию, например ДНК, имеющие гомологию 50% или более, предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более и наиболее предпочтительно 95% и более, гибридизуются друг с другом, но ДНК, имеющие гомологию ниже, чем указанные выше, не гибридизуются друг с другом. Альтернативно, жесткие условия включают условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом при концентрации соли, соответствующей типичным условиям промывки в случае гибридизации по Саузерну, то есть примерно 1хSSC, 0,1% ДСН, предпочтительно 0,1хSSC, 0,1% ДСН при 60°С.

Для введения различных генов в коринеформную бактерию, которые могут быть получены по указанному выше способу, может быть использован, например, способ обработки реципиентных клеток хлоридом кальция с целью повышения их проницаемости для ДНК, который описан для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J.Mol. Biol., 53, 159 (1970)), и способ получения компетентных клеток из клеток, находящихся в фазе роста, с последующим введением ДНК, который описан для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Кроме того, может быть также использован способ создания ДНК-содержащих реципиентных клеток в протопластах или сферопластах, которые могут легко воспринимать рекомбинантную ДНК, с последующим введением рекомбинантной ДНК в клетки, который описан для Bacillus subtilis, актиномицетов и дрожжей (Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Кроме того, может использоваться способ электропорации (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Любой из этих способов может быть выбран соответствующим образом в зависимости от клеток, используемых в качестве реципиента.

В коринеформной бактерии по настоящему изобретению в зависимости от типа целевого вещества активность фермента, участвующего в биосинтезе целевого вещества, может быть повышена. Кроме того, активность фермента, неблагоприятного для образования целевого вещества, может быть снижена или полностью устранена.

В том случае, когда требуемые гены mdh, hps, phi и amd ген вводят в коринеформную бактерию, порядок введения указанных генов конкретно не ограничивается. Кроме того, бактерия по настоящему изобретению может быть получена либо путем введения указанных генов в коринеформную бактерию, обладающую способностью продуцировать целевое вещество, либо путем придания способности продуцировать целевое вещество коринеформной бактерии, в которую введены указанные гены.

Коринеформная бактерия по настоящему изобретению может представлять собой бактерию, полученную методами генной рекомбинации посредством введения ДНК, содержащей генетическую информацию, нужную для биосинтеза целевого вещества. Так, например, в случае бактерий, продуцирующих L-лизин, примеры генов, которые могут быть при этом введены, включают гены, кодирующие ферменты пути биосинтеза L-лизина, такие как фосфоэнолпируваткарбоксилаза, аспартокиназа, дигидродипиколинатсинтетаза, дигидродипиколинатредуктаза, сукцинилдиаминопимелаттрансаминаза и сукцинилдиаминопимелатдеацилаза. В случае гена, кодирующего фермент, который является мишенью для ингибирования по типу обратной связи L-аспарагиновой кислотой или L-лизином, такой как фосфоэнолпируваткарбоксилаза или аспартокиназа и дигидродипиколинатсинтетаза, желательно использовать мутантный ген, кодирующий фермент, у которого чувствительность к ингибированию снижена. Пример мутантного lysC гена (lysC*), кодирующего мутантную аспартокиназу, у которой чувствительность к ингибированию снижена, включает ген, имеющийся в продуцирующей L-лизин бактерии AJ3463 (FERM P-1987), полученный из Brevibacterium lactofermentum, штамм ATCC 13869, путем мутационной обработки (международная патентная публикация WO94/25605).

Кроме того, в коринеформной бактерии по настоящему изобретению может быть снижена или устранена активность фермента, который катализирует реакцию образования соединения, отличного от целевого соединения, путем ответвления от пути биосинтеза целевого вещества, или фермента, который переносит целевое вещество в клетку из среды. В том случае, когда целевым веществом является L-лизин, пример такого фермента, который катализирует реакцию образования соединения, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина, включает гомосериндегидрогеназу (см. WО95/23864). Пример фермента, который переносит L-лизин в клетки, включает лизинпермеазу (продукт гена lysI).

Примеры коринеформной бактерии, в которой активность целевого фермента снижена или устранена, включают, например, штаммы с разрушенным геном, в которых ген целевого фермента на хромосоме разрушен методами генетической рекомбинации, и мутантные штаммы, которые имеют активный целевой фермент как результат наличия мутаций в регуляторной последовательности экспрессии или в кодирующем регионе гена целевого фермента на хромосоме, больше не образуются.

Мутантные штаммы могут быть получены путем обработки коринеформной бактерии ультрафиолетовым облучением или мутагенным веществом, которое традиционно используют при мутационной обработке, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или ЭМС (EMS).

Далее описывается разрушение гена lysI как пример способа разрушения гена целевого фермента на хромосоме с помощью методов генной рекомбинации. Ген lysI на хромосоме может быть разрушен путем трансформации бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, с использованием ДНК, включающей ген lysI, модифицированный таким образом, что он больше не продуцирует лизинпермеазу, и который характеризуется ферментативной активностью (делетированный тип гена lysI), полученной в результате делеции части гена lysI, что позволяет провести рекомбинацию между делетированным типом гена lysI и геном lysI на хромосоме. Такая генная деструкция путем гомологичной рекомбинации известна, и имеются способы ее осуществления с использованием линейной ДНК, плазмиды, включающей температурочувствительный репликационный регуляторный регион и т.д.

Ген lysI на хозяйской хромосоме может быть заменен делетированным типом гена lysI указанным ниже способом. Так, например, может быть получена рекомбинантная ДНК путем вставки в соответствующий вектор мутантного lysI гена и маркерного гена, придающего устойчивость к лекарственным соединениям, таким как канамицин. Затем коринеформную бактерию трансформируют рекомбинантной ДНК и трансформированный штамм культивируют в среде, содержащей лекарственное средство, для получения трансформированного штамма, в котором рекомбинантная ДНК включена в хромосомную ДНК.

В случае введения указанной выше вставки достигается рекомбинация хромосомного lysI гена и рекомбинантной ДНК с новой вставкой. В результате в хромосому на обеих сторонах другой части рекомбинантной ДНК, то есть на векторной части, на температурочувствительном участке контроля репликации и маркера лекарственной устойчивости, вставляются два гена слияния, содержащие хромосомный ген lysI и делетированный тип гена lysI. В результате этого трансформированный штамм экспрессирует нормальный продукт гена lysI, поскольку в данном состоянии доминирует нормальный ген lysI. Далее, если в рекомбинантную ДНК включается, например, ген сукразы, такой рекомбинантный штамм экспрессирует сукразу и, исходя из этого, он не может расти в среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. Поэтому данный ген может использоваться в качестве маркера.

Впоследствии, с целью сохранения только делетированного типа гена lysI на хромосомной ДНК, одну копию гена lysI удаляют из хромосомной ДНК вместе с векторным сегментом (включая маркерный ген) путем рекомбинации двух генов lysI (вторая рекомбинация). Данная стадия представляет собой случай, при котором нативный ген lysI остается на хромосомной ДНК, а делетированный ген lysI элиминируется из хромосомной ДНК, или, наоборот, случай, при котором делетированный тип гена lysI остается на хромосомной ДНК, а нативный ген lysI элиминируется из хромосомной ДНК. Исходя из этого, путем подтверждения структур гена может быть получен штамм, в котором делетированный тип гена lysI остается на хромосоме.

Указанные выше гены, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе целевого вещества, могут быть также введены в коринеформные бактерии путем замены гена на хромосомной ДНК коринеформной бактерии тем же способом, что и в случае указанного выше разрушения гена.

Целевое вещество, которое может быть образовано при культивировании коринеформной бактерии по настоящему изобретению, полученное указанным выше способом в среде, содержащей метанол, приводит к накоплению целевого вещества в среде или в клетках бактерии, после чего целевое вещество может быть собрано из среды или клеток бактерии.

Примеры целевых веществ, которые могут использоваться по методу настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь приведенным списком, вещество, получаемое при метаболизме метанола, и вещество, образуемое при утилизации энергии, образуемой при метаболизме метанола. Конкретно, к ним относятся, например, аминокислоты, такие как глютаминовая кислота, лизин, треонин, фенилаланин и триптофан, витамины, такие как витамин С, макромолекулярные вещества, такие как различные виды ферментов, и т.п.

Выражение "способность продуцировать целевое вещество" в контексте настоящего изобретения обозначает способность коринеформной бактерии по настоящему изобретению вызывать накопление целевого вещества в среде или в клетках бактерии в таком количестве, чтобы указанное вещество могло быть собрано из них в случае культивирования бактерий в среде при поддержании определенных условий.

В настоящем изобретении среда и условия культивирования могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от бактериального штамма и целевого вещества. Так, могут использоваться типичные среды, содержащие источник азота, неорганические ионы и другие необходимые следовые органические компоненты.

Метанол может использоваться в качестве источника углерода. Вместе с метанолом могут использоваться сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза и гидролизат крахмала, спирты, такие как глицерин и сорбит, или органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.

Неорганические аммонийные соли, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органический азот, такой как гидролизат соевого белка, газообразный аммиак, водный аммиак и т.п., могут использоваться в качестве источника азота.

Фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, ионы марганца и т.п. могут использоваться в небольших количествах в качестве неорганических ионов или их источника. Предпочтительно добавлять необходимые вещества, такие как L-гомосерин, витамин В₁, дрожжевой экстракт и т.п., в качестве органических следовых питательных компонентов в соответствующих количествах.

Культивирование может предпочтительно проводиться в условиях, подходящих для коринеформной бактерии. Обычно культивирование предпочтительно проводят в аэробных условиях в течение 16-96 часов. Температуру культивирования предпочтительно контролируют в диапазоне от 20°С до 45°С и значение pH предпочтительно контролируют в диапазоне от 5 до 8,5 в ходе культивирования. Для корректировки значения pH могут использоваться неорганические и органические кислотные или щелочные вещества, а также газообразный аммиак и т.п. Если в качестве хозяйской клетки используется термофильная бактерия, она может культивироваться в температурном диапазоне от 42°С до 60°С.

Для сбора продукта метаболизма из среды после завершения культивирования по настоящему изобретению не требуется применять специальный способ. Указанный сбор может быть проведен сочетанием хорошо известных методик, таких как способы ионного обмена на смоле, способы осаждения и другие известные способы. Кроме того, в том случае, когда в качестве источника углерода используется метанол, очистка целевого вещества и процесс удаления отходов в растворе может быть упрощен в сравнении с вариантом использования сахаров, получаемых из сельскохозяйственных продуктов.

ПРИМЕРЫ

Ниже настоящее изобретение описывается более конкретно со ссылкой на приведенные ниже не ограничивающие примеры.

Пример 1: Клонирование гена метанолдегидрогеназы

Получают хромосомную ДНК обычным способом из Bacillus brevis, штамм S1 (NCIMB 12525, полученный из NCIMB), которая является метанол-ассимилирующей устойчивой к высоким температурам бактерией, относящейся к роду Bacillus. Затем клонируют ген МДГ методом ПЦР с использованием данной ДНК в качестве матрицы (см. публикацию выложенной заявки на патент Японии № 2000-69976). В качестве праймера используют MDH-BM-1 (SEQ ID NO:1) и MDH-BM-2 (SEQ ID NO:2). Указанные праймеры получают в соответствии с ранее опубликованной нуклеотидной последовательностью гена МДГ из Bacillus methanolicus, штамм C1 (зарегистрирован в GenBank под номером М65004, код дост