Способ получения l-лизина с использованием бактерий methylophilus и способ получения бактериальных клеток methylophilus

Способ получения l-лизина с использованием бактерий methylophilus и способ получения бактериальных клеток methylophilus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение имеет отношение к способам в области микробиологической промышленности. В частности, данное изобретение относится к способу производства L-аминокислоты посредством ферментации и к микроорганизму, используемому в данном способе.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аминокислоты, такие как L-лизин, L-глутаминовая кислота, L-треонин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин и L-фенилаланин, получают промышленным путем посредством ферментации с использованием микроорганизмов, которые относятся к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida и им подобным. Для того чтобы повысить продуктивность, в качестве таких микроорганизмов использовали штаммы, выделенные в природе, или их искусственные мутанты. Были заявлены различные способы усиления активностей ферментов биосинтеза L-глутаминовой кислоты с использованием технологии рекомбинантной ДНК, чтобы повысить способность продуцировать L-глутаминовую кислоту.

Продуктивность при получении L-аминокислот была значительно повышена с помощью селекции микроорганизмов, таких как микроорганизмы, приведенные выше, и совершенствования способов производства. Однако чтобы удовлетворить дальнейшее увеличение потребностей в будущем, по-прежнему требуется развитие способов более эффективного производства L-аминокислот.

В качестве способов получения аминокислот ферментацией метанола, который представляет собой сырье для ферментации, доступное в больших количествах при низкой стоимости, имеются традиционно известные способы с использованием микроорганизмов, которые относятся к роду Achromobacter или Pseudomonas (заявка на патент Японии (Kokoku) No. 45-25273/1970), Protaminobacter (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 49-125590/1974), Protaminobacter или Methanomonas (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 50-25790/1975), Microcyclus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 52-18886/1977), Methylobacillus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 4-91793/1992), Bacillus (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 3-505284/1991) и так далее.

Однако до настоящего времени не был известен способ получения L-аминокислот с использованием бактерий Methylophilus. Хотя способы, описанные в EP 0 035 831 A, EP 0 037 273 A и EP 0 066 994 A, были известны как способы трансформации бактерий Methylophilus с использованием рекомбинантной ДНК, применение технологии рекомбинантной ДНК для повышения продуцирования аминокислот бактериями Methylophilus не было известно.

РАСКРЫТИЕ СУТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью согласно изобретению является предоставление новой бактерии, продуцирующей L-аминокислоту, и способа получения L-аминокислоты с использованием бактерии, продуцирующей L-аминокислоту. В результате попыток авторов изобретения, посвященных достижению упомянутой выше цели, было обнаружено, что бактерии Methylophilus пригодны для получения L-аминокислот. Кроме того, хотя традиционно считается, что трудно получить ауксотрофные мутанты бактерий Methylophilus (FEMS Microbiology Rev. 39, 235-258 (1986) и Antonie van Leeuwenhoek 53, 47-53 (1987), авторы данного изобретения достигли успеха в получении ауксотрофных мутантов указанных бактерий. Таким образом, данное изобретение было осуществлено.

То есть данное изобретение предоставляет следующее.

(1) Бактерия Methylophilus, обладающая способностью продуцировать L-аминокислоту.

(2) Бактерия Methylophilus по п.(1), где L-аминокислотой является L-лизин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-треонин.

(3) Бактерия Methylophilus по п.(1), которая обладает резистентностью к аналогу L-аминокислоты или ауксотрофией по L-аминокислоте.

(4) Бактерия Methylophilus по п.(1), у которой повышена активность ферментов биосинтеза L-аминокислоты.

(5) Бактерия Methylophilus по п.(1), у которой повышены активность дигидродипиколинатсинтазы и активность аспартокиназы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(6) Бактерия Methylophilus по п.(1), у которой повышена активность дигидродипиколинатсинтазы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(7) Бактерия Methylophilus по п.(1), у которой повышена активность аспартокиназы, и при этом бактерия обладает способностью продуцировать L-лизин.

(8) Бактерия Methylophilus по любому из п.п. с (5) по (7), у которой активность или активности одного, двух или трех ферментов, выбранных из дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидродипиколинатредуктазы и диаминопимелатдекарбоксилазы, усилена/усилены.

(9) Бактерия Methylophilus по п.(5), у которой активность дигидродипиколинатсинтазы и активность аспартокиназы повышены путем трансформации посредством введения в клетки ДНК, кодирующей дигидродипиколинатсинтазу, которая не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, и ДНК, кодирующей аспартокиназу, которая не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

(10) Бактерия по п.(1), где активности аспартокиназы, гомосериндегидрогеназы, гомосеринкиназы и треонинсинтазы повышены, и бактерия обладает способностью продуцировать L-треонин.

(11) Бактерия по любому из п.п. с (1) по (10), где бактерией Methylophilus является Methylophilus methylotrophus.

(12) Способ получения L-аминокислоты, который включает в себя культивирование бактерии Methylophilus, которая охарактеризована в любом из указанных выше п.п. с (1) по (11), в среде, чтобы продуцировать и накопить L-аминокислоту в культуре, и сбор L-аминокислоты из культуры.

(13) Способ по п.(12), при котором среда содержит метанол в качестве основного источника углерода.

(14) Способ получения бактериальных клеток бактерии Methylophilus с повышенным содержанием L-аминокислоты, который включает в себя культивирование бактерии Methylophilus, охарактеризованной в любом из указанных выше пунктов с (1) по (11), в среде, чтобы продуцировать и накопить L-аминокислоту в бактериальных клетках данной бактерии.

(15) Способ получения бактериальных клеток бактерии Methylophilus по п.14, где L-аминокислотой является L-лизин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин или L-треонин.

(16) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (А) или (B):

(А) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или

(В) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью аспартокиназы.

(17) ДНК по п.(16), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (а) или (b):

(а) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 510 до нуклеотида номер 1736 SEQ ID NO: 5; или

(b) ДНК, которая способна гибридизоваться с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 510 до нуклеотида номер 1736 SEQ ID NO: 5, или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью аспартокиназы.

(18) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (С) или (D):

(С) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или

(D) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты.

(19) ДНК по п.(18), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (с) или (d):

(с) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 98 до нуклеотида номер 1207 SEQ ID NO: 7; или

(d) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 98 до нуклеотида номер 1207 SEQ ID NO: 7 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты.

(20) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (E) или (F):

(E) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или

(F) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дигидродипиколинатсинтазы.

(21) ДНК по п.(20), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (e) или (f):

(e) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 1268 до нуклеотида номер 2155 SEQ ID NO: 9; или

(f) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 1268 до нуклеотида номер 2155 SEQ ID NO: 9 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дигидродипиколинатсинтазы.

(22) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (G) или (H):

(G) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или

(H) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью дигидродипиколинатредуктазы.

(23) ДНК по п.(22), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (g) или (h):

(g) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 2080 до нуклеотида номер 2883 SEQ ID NO: 11; или

(h) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 2080 до нуклеотида номер 2883 SEQ ID NO: 11 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью дигидродипиколинатредуктазы.

(24) ДНК, которая кодирует белок, охарактеризованный в следующих пунктах (I) или (J):

(I) белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или

(J) белок, который имеет аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14, включая замену, делецию, инсерцию, присоединение или инверсию одной или нескольких аминокислот, и обладает активностью диаминопимелатдекарбоксилазы.

(25) ДНК по п.(24), которая представляет собой ДНК, охарактеризованную в следующих пунктах (i) или (j):

(i) ДНК, которая имеет нуклеотидную последовательность, включающую в себя нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 751 до нуклеотида номер 1995 SEQ ID NO: 13; или

(j) ДНК, которая гибридизуется с пробой, имеющей нуклеотидную последовательность от нуклеотида номер 751 до нуклеотида номер 1995 SEQ ID NO: 13 или ее часть, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью диаминопимелатдекарбоксилазы.

В данном описании «способность продуцировать L-аминокислоту» относится к способности накапливать значительное количество L-аминокислоты в среде или к увеличению содержания аминокислоты в бактериальных клетках, в том случае, когда микроорганизм согласно изобретению культивируют в среде.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показан способ получения плазмиды RSF24P, имеющей мутантный dapA. «dapA*24» относится к мутантному dapA, который кодирует мутантный фермент DDPS, в котором остаток гистидина 118 заменен остатком тирозина.

На фиг.2 показан способ получения плазмиды RSFD80, имеющей мутантный dapA и мутантный lysC. «lysC*80» относится к мутантному lysC, который кодирует мутантную AKIII, где остаток треонина 352 заменен остатком изолейцина.

На фиг.3 показана аспартокиназная активность трансформированных штаммов E.coli, содержащих ген ask.

На фиг.4 показана активность дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты трансформированных штаммов E.coli, содержащих ген asd.

На фиг.5 показана дигидродипиколинатсинтазная активность трансформированных штаммов E.coli, содержащих ген dapA.

На фиг.6 показана дигидродипиколинатредуктазная активность трансформированного штамма E.coli, содержащего ген dapB.

На фиг.7 показана диаминопимелатдекарбоксилазная активность трансформированных штаммов E.coli, содержащих ген lysA.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

<1> Микроорганизм данного изобретения

Микроорганизмом согласно изобретению является бактерия, относящаяся к роду Methylophilus и обладающая способностью продуцировать L-аминокислоту. Бактерия Methylophilus согласно изобретению включает в себя, например, штамм Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) и так далее. Штамм Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) доступен для приобретения из национальных коллекций промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria) (адрес: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).

L-аминокислоты, полученные согласно изобретению, включают в себя L-лизин, L-глутаминовую кислоту, L-треонин, L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, L-триптофан, L-фенилаланин, L-тирозин и так далее. Можно получать один или большее количество типов таких аминокислот.

Бактерии Methylophilus, обладающие способностью продуцировать L-аминокислоты, могут быть получены посредством придания способности продуцировать L-аминокислоты штаммам бактерий Methylophilus дикого типа. Чтобы придать способность продуцировать L-аминокислоты, могут быть использованы способы, традиционно принятые в селекции коринеформных бактерий, бактерий Escherichia и им подобных, такие как способы получения ауксотрофных мутантных штаммов, штаммов, резистентных к аналогам L-аминокислот, или мутантных штаммов в отношении контроля метаболических процессов, и способы получения рекомбинантных штаммов, в которых повышены активности ферментов биосинтеза L-аминокислот (смотри "Amino Acid Fermentation" the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1^st Edition, опубликованная 30 мая, 1986, pp. 77-100). При селекции бактерий, продуцирующих аминокислоты, такие характеристики, как ауксотрофия, резистентность к аналогу L-аминокислоты и мутация метаболического контроля, можно придать бактериям отдельно или в комбинации из двух или большего количества характеристик. Активность ферментов биосинтеза L-аминокислот может быть усилена для каждого в отдельности или для комбинации одного или большего количества ферментов. Кроме того, придание таких характеристик, как ауксотрофия, резистентность к аналогу L-аминокислоты и мутация метаболического контроля, можно комбинировать с усилением активности ферментов биосинтеза L-аминокислот.

Например, бактерии, продуцирующие L-лизин, получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-гомосерину или L-треонину и L-метионину (заявка на патент Японии (Kokoku) No. 48-28078/1973 и 56-6499/1981), мутанты, проявляющие ауксотрофию по инозиту или уксусной кислоте (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 55-9784/1980 и 56-8692/1981), или мутанты, которые устойчивы к оксализину, лизингидроксамату, S-(2-аминоэтил)цистеину, γ-метиллизину, α-хлоркапролактаму, DL-α-амино-ε-капролактаму, α-аминолауриллактаму, аналогу аспарагиновой кислоты, сульфамидному лекарственному препарату, хиноиду или N-лауроиллейцину.

Кроме того, бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по олеиновой кислоте или ей подобному. Бактерии, продуцирующие L-треонин, могут быть получены при селекции как мутанты, устойчивые к α-амино-β-гидроксивалериановой кислоте. Бактерии, продуцирующие L-гомосерин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-треонину, или мутанты, устойчивые к аналогам L-фенилаланина. Бактерии, продуцирующие L-фенилаланин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-тирозину. Бактерии, продуцирующие L-изолейцин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-лейцину. Бактерии, продуцирующие L-пролин, могут быть получены при селекции как мутанты, проявляющие ауксотрофию по L-изолейцину.

Более того, как указано в примерах далее, штаммы, которые продуцируют один или большее количество видов разветвленных аминокислот (L-валин, L-лейцин и L-изолейцин), могут быть получены как штаммы, проявляющие ауксотрофию по казаминовой кислоте.

Чтобы получить мутанты бактерий Methylophilus, авторы изобретения сначала изучили детали оптимальных условий мутагенеза с использованием в качестве показателя частоты появления штаммов, резистентных к стрептомицину. В результате максимальная частота появления резистентных к стрептомицину штаммов была получена в том случае, когда степень выживаемости после мутагенеза составляла примерно 0,5%, и авторы достигли цели в получении ауксотрофных штаммов при данных условиях. Авторы также достигли успеха в получении ауксотрофных штаммов, получить которые считалось трудным, посредством значительного увеличения масштаба скрининга мутантов, по сравнению с проводимым ранее для E.coli и так далее.

Как описано выше, поскольку было обнаружено, что мутанты можно получить путем мутагенеза бактерий Methylophilus в соответствующих условиях, стало возможным легко получать желаемые мутанты, выбирая такие подходящие условия, при которых степень выживаемости после мутагенеза должна соответствовать примерно 0,5%, в зависимости от способа мутагенеза.

Способы мутагенеза для получения мутантов бактерий Methylophilus включают в себя УФ-облучение и обработку мутагенными средствами, используемыми при обычных мутагенных обработках, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистая кислота. Бактерии Methylophilus, обладающие способностью продуцировать L-аминокислоты, также можно получить путем селекции мутантов бактерий Methylophilus природного происхождения.

Мутанты, устойчивые к аналогам L-аминокислот, можно получить, например, инокулируя мутантные бактерии Methylophilus на агаризованную среду, содержащую аналог L-аминокислоты в различных концентрациях, и отбирая штаммы, которые формируют колонии.

Ауксотрофные мутанты можно получить, давая возможность бактериям Methylophilus формировать колонии на агаризованной среде, содержащей целевое питательное вещество (например, L-аминокислоту), получением реплик колоний на агаризованной среде, не содержащей указанного питательного вещества, и отбором штаммов, которые не могут расти на агаризованной среде, не содержащей питательного вещества.

Способы придания или усиления способности продуцировать L-аминокислоты посредством повышения активности ферментов биосинтеза L-аминокислот будут показаны на примерах ниже.

[L-лизин]

Способность продуцировать L-лизин можно придать, например, усиливая активность дигидродипиколинатсинтазы и/или активность аспартокиназы.

Активность дигидродипиколинатсинтазы и/или активность аспартокиназы бактерий Methylophilus можно повысить путем лигирования фрагмента гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и/или фрагмента гена, кодирующего аспартокиназу, с вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, предпочтительно с вектором мультикопийного типа, чтобы создать рекомбинантную ДНК, и введением его в бактерию-хозяина Methylophilus, чтобы трансформировать хозяина. В результате увеличения числа копий гена, кодирующего дигидродипиколинатсинтазу, и/или гена, кодирующего аспартокиназу, в клетках трансформированного штамма активность или активности ферментов повысятся. Далее дигидродипиколинатсинтаза, аспартокиназа и аспартокиназа III также обозначаются сокращениями DDPS, AK и AKIII соответственно.

В качестве микроорганизма, предоставляющего ген, который кодирует DDPS, и ген, который кодирует АК, могут быть использованы любые микроорганизмы, при условии, что они имеют гены, обеспечивающие экспрессию активности DDPS и активности АК у микроорганизмов, относящихся к роду Methylophilus. Такими микроорганизмами могут быть штаммы дикого типа или полученные от них мутантные штаммы. В частности, примеры таких микроорганизмов включают в себя штамм К-12 E.coli (Escherichia coli), штамм AS1 Methylophilus methylotrophus (NCIMB10515) и так далее. Так как найдены нуклеотидные последовательности обоих генов - гена, кодирующего DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297, (1986)), и гена, кодирующего AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), полученных от бактерии Escherichia, указанные гены могут быть получены ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидных последовательностей этих генов, и хромосомной ДНК такого микроорганизма, как E.coli K-12 или ему подобного, в качестве матрицы. В качестве конкретных примеров ниже будут даны пояснения относительно dapA и lysC, полученных из E.coli. Однако гены, используемые в данном изобретении, не ограничены указанными выше генами.

Предпочтительно, чтобы DDPS и АК, используемые для согласно изобретению, не претерпевали ингибирования L-лизином по принципу обратной связи. Известно, что DDPS дикого типа, полученная из E.coli, претерпевает ингибирование L-лизином по принципу обратной связи и что AKIII дикого типа, полученная из E.coli, претерпевает супрессию и ингибирование по принципу обратной связи L-лизином. Поэтому dapA и lysC, вводимые в бактерии Methylophilus, предпочтительно кодируют DDPS и AKIII, имеющие мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи. В дальнейшем DDPS, имеющая мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, также называется «мутантной DDPS», и ДНК, кодирующая мутантную DDPS, также именуется «мутантным dapA». AKIII, полученная из E.coli, имеющая мутацию, которая десенсибилизирует к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи, также называется «мутантной AKIII», и ДНК, кодирующая мутантную AKIII, также именуется «мутантным lysC».

Согласно данному изобретению, не обязательно необходимо, чтобы DDPS и АК были мутантными. Известно, например, что DDPS, полученная из бактерий Corynebacterium, не подвергается ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Нуклеотидная последовательность dapA дикого типа, полученного из E.coli, приведена в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность DDPS дикого типа, кодируемая указанной нуклеотидной последовательностью, иллюстрируется SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность lysC дикого типа, полученного из E.coli, иллюстрируется SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность ATIII дикого типа, кодируемая указанной нуклеотидной последовательностью, иллюстрируется SEQ ID NO: 4.

ДНК, кодирующая мутантную DDPS, которая не подвергается ингибированию по принципу обратной связи L-лизином, включает в себя ДНК, кодирующую DDPS, которая имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 2, где остаток гистидина 118 заменен остатком тирозина. ДНК, кодирующая мутантную AKIII, которая не подвергается ингибированию по принципу обратной связи L-лизином, включает в себя ДНК, кодирующую AKIII, которая имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 4, где остаток треонина 352 заменен остатком изолейцина.

Плазмидой, используемой для клонирования гена, может быть любая плазмида, при условии, что она может реплицироваться в микроорганизме, таком как бактерии Escherichia и им подобные, и в частности включая pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19 и так далее.

Вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, является, например, плазмида, которая может автономно реплицироваться в бактериях Methylophilus. В частности, можно упомянуть RSF1010, который представляет собой вектор широкого спектра хозяев, и его производные, например, pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161-167, (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53, (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) и так далее.

Чтобы приготовить рекомбинантную ДНК лигированием dapA и lysC с вектором, который функционирует в бактериях Methylophilus, вектор переваривают ферментом рестрикции, который соответствует концу фрагмента ДНК, содержащего dapA и lysC. Лигирование обычно выполняют с использованием лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4. dapA и lysC могут быть индивидуально включены в отдельные векторы или в один вектор.

В качестве плазмиды, содержащей мутантный dapA, кодирующий мутантную DDPS, и мутантный lysC, кодирующий мутантную AKIII, была известна плазмида RSFD80 с широким спектром хозяев (WO95/16042). Штамм JM109 E.coli, трансформированный указанной плазмидой, назван AJ12396 и помещен на хранение в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (почтовый индекс 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) 28 октября 1993 г. и получил инвентарный номер FERM P-13936, и перенесен для международного депонирования по условиям Будапештского соглашения 1 ноября 1994 г. и получил инвентарный номер FERM BP-4859. RSFD80 можно получить из штамма AJ12396 известным способом.

Мутантный dapA, имеющийся в RSFD80, имеет нуклеотидную последовательность dapA дикого типа SEQ ID NO: 1, включая замену С в нуклеотиде номер 623 на Т. Поэтому кодируемая мутантная DDPS имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, включая замену остатка гистидина 118 на остаток тирозина. Мутантный lysC, имеющийся в RSFD80, имеет нуклеотидную последовательность lysC дикого типа SEQ ID NO: 3, включая замену С в нуклеотиде номер 1638 на Т. Поэтому кодируемая мутантная AKIII имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, включая замену остатка треонина 352 на остаток изолейцина.

Для того чтобы ввести рекомбинантную ДНК, полученную, как описано выше, в бактерии Methylophilus, можно использовать любой способ, при условии, что он обеспечивает достаточную эффективность трансформации. Например, можно использовать электропорацию (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Активность DDPS и/или активность АК также может быть повышена при наличии множественных копий dapA и/или lysC в хромосомной ДНК бактерий Methylophilus. Чтобы ввести множественные копии dapA и/или lysC в хромосомную ДНК бактерий Methylophilus проводят гомологичную рекомбинацию с использованием в качестве мишени последовательности, которая представлена в хромосомной ДНК бактерий Methylophilus множеством копий. В качестве последовательности, присутствующей в хромосомной ДНК во множестве копий, можно использовать повторяющуюся ДНК, инвертированные повторы, имеющиеся на конце транспозируемого элемента, и им подобные. В альтернативном случае, как заявлено в опубликованной заявке на патент Японии (Kokai) No. 2-109985/1990, множественные копии dapA и/или lysC могут быть введены в хромосомную ДНК посредством их встраивания в транспозон, чтобы их перенести. В обоих способах в результате увеличенного количества копий dapA и/или lysC в трансформированных штаммах, активность DDPS и активность АК будут повышены.

Кроме указанной выше амплификации генов, активность DDPS и/или активность АК может быть повышена путем замены последовательности, контролирующей экспрессию, такой как промоторы dapA и/или lysC, более сильными промоторами (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 1-215280/1989). В качестве сильных промоторов известны, например, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор P_R и промотор P_L фага лямбда, промотор tet, промотор amyE, промотор spac и так далее. Замещение этими промоторами усиливает экспрессию dapA и/или lysC, и таким образом активность DDPS и активность АК повышаются. Усиление последовательностей, контролирующих экспрессию, можно комбинировать с увеличением числа копий dapA и/или lysC.

Чтобы приготовить рекомбинантную ДНК лигированием фрагмента гена и вектора, вектор переваривают ферментом рестрикции, соответствующим концу фрагмента гена. Лигирование обычно выполняют с помощью лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4. В качестве способов переваривания, лигирования и других способов для ДНК, подготовки хромосомной ДНК, ПЦР, получения плазмидной ДНК, трансформации, конструирования олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров, и так далее, можно использовать стандартные способы, хорошо известные специалистам в данной области. Указанные способы описаны в Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) и так далее.

В дополнение к повышению активности DDPS и/или активности АК, также может быть повышена активность другого фермента, вовлеченного в биосинтез L-лизина. К таким ферментам относятся ферменты пути метаболизма диаминопимелата, такие как дигидродипиколинатредуктаза, диаминопимелатдекарбоксилаза, диаминопимелатдегидрогеназа (WO96/40934 для всех вышеуказанных ферментов), фосфоенолпируваткарбоксилаза (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 60-87788/1985), аспартатаминотрансфераза (опубликованная заявка на патент Японии (Kokoku) No. 6-102028/1994), диаминопимелатэпимераза, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты и так далее, или ферменты пути метаболизма аминоадипата, такие как гомоаконитатгидратаза, и так далее. Предпочтительно повышают активность по меньшей мере одного фермента из дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, дегидродипиколинатредуктазы и диаминопимелатдекарбоксилазы.

Аспартокиназа, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидродипиколинатсинтаза, дигидродипиколинатредуктаза и диаминопимелатдекарбоксилаза, полученные из Methylophilus methylotrophus, будут описаны далее.

Кроме того, у микроорганизмов согласно изобретению может быть снижена активность фермента, который катализирует реакцию образования другого соединения, отличного от L-лизина, посредством ответвления пути биосинтеза L-лизина, или они могут быть дефицитны по такому ферменту. Фермент, который катализирует реакцию образования не L-лизина, а другого соединения, посредством ответвления пути биосинтеза L-лизина, включает гомосериндегидрогеназу (смотри WO95/23864).

Аналогично вышеупомянутые способы повышения активности фермента, вовлеченного в биосинтез L-лизина, могут быть использованы для других аминокислот, указанных ниже.

[L-глутаминовая кислота]

Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту можно придать бактериям Methylophilus, например, путем введения ДНК, которая кодирует любой из ферментов, включая глутаматдегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 61-268185/1986), глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-166890/1987 и 63-214189/1988), аконитатгидратазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-294086/1987), цитратсинтазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 62-201585/1987 и 63-119688/1988), фосфоенолпируваткарбоксилазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 60-87788/1985 и 62-55089/1987), пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) 63-102692/1988), глюкозофосфатизомеразу, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазу (WO99/07853) и так далее.

Кроме того, у микроорганизмов согласно изобретению может быть снижена активность фермента, который катализирует реакцию образования другого соединения, отличного от L-глутаминовой кислоты, посредством ответвления пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, или они могут быть дефицитны по такому ферменту. Фермент, который катализирует реакцию образования не L-глутаминовой кислоты, а другого соединения посредством ответвления пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, включает в себя α-кетоглутаратдегидрогеназу (αKGDH), изоцитратлиазу, фосфатацетилтрансферазу, ацетаткиназу, синтазу ацетооксикислоты, ацетолактатсинтазу, формиатацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу, глутаматдекарбоксилазу, 1-пирролин-дегидрогеназу и так далее.

[L-треонин]

Способность продуцировать L-треонин можно придать или повысить, например, усиливая активности аспартокиназы, гомосериндегидрогеназы, гомосеринкиназы и треонинсинтазы. Активности указанных ферментов можно повысить, например, путем трансформации бактерий Methylophilus с использованием рекомбинантной плазмиды, содержащей оперон треонина (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 55-131397/1980, 59-31691/1984 и 56-15696/1981 и опубликованная заявка на патент Японии (Kohyo) No. 3-501682/1991).

Способность к продуцированию также можно придать или повысить путем амплификации или введения оперона треонина, содержащего ген, кодирующий аспартокиназу, которая десенсибилизирована к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи (опубликованная заявка на патент Японии (Kokoku) No. 1-29559/1989), ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 60-012995/1985), или ген, кодирующий гомосеринкиназу и гомосериндегидрогеназу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 61-195695/1986).

Кроме того, способность продуцировать L-треонин можно повысить путем введения ДНК, кодирующей мутантную фосфоенолпируваткарбоксилазу, имеющую мутацию десенсибилизации к ингибированию аспарагиновой кислотой по принципу обратной связи.

[L-валин]

Способность продуцировать L-валин можно придать, например, путем введения в бактерии Methylophilus гена биосинтеза L-валина, механизм регуляции которого в значительной степени десенсибилизирован. Также можно ввести мутацию, которая в значительной степени десенсибилизирует механизм регуляции гена биосинтеза L-валина, который несет микроорганизм, относящийся к роду Methylophilus.

Примеры гена биосинтеза L-валина включают в себя, например, оперон ilvGMEDA E.coli. Треониндезаминаза, кодируемая геном ilvA, катализирует реакцию дезаминирования, превращающую L-треонин в 2-кетомасляную кислоту, которая является определяющим скорость этапом биосинтеза L-изолейцина. Поэтому для того чтобы добиться эффективного усиления реакций синтеза L-валина, предпочтительно использовать оперон, который не экспрессирует активность треониндезаминазы. Примеры оперона ilvGMEDA, который не экспрессирует такой треониндезаминазной активности, включают в себя оперон ilvGMEDA, в котором в ilvA введена мутация элиминирования активности треониндезаминазы, или ilvA нарушен, и оперон, в котором ilvA делетирован.

Так как оперон ilvGMEDA претерпевает контроль экспрессии оперона (ослабление) L-валином и/или L-изолейцином и/или L-лейцином, район, необходимый для ослабления, предпочтительно удаляют или подвергают мутации, чтобы ликвидировать чувствительность к супрессии экспрессии L-валином.

Оперон ilvGMEDA, который не экспрессирует треониндезаминазную активность и который лишен чувствительности к ослаблению, как описано выше, можно получить, подвергая оперон ilvGMEDA дикого типа мутагенной обработке или модифицируя его с помощью технологии рекомбинации генов (смотри WO96/06926).

[L-лейцин]

Способность продуцировать L-лейцин можно придать или повысить, например, введением в микроорганизм, относящийся к роду Methylophilus, гена биосинтеза L-лейцина, механизм регуляции которого в значительной степени десенсибилизирован, в дополнение к указанным выше характеристикам, необходимым для продукции L-валина. Также можно ввести такую мутацию, при которой механизм регуляции гена биосинтеза L-лейцина в микроорганизме, относящемся к роду Methylophilus, будет в значительной степени элиминирован. Примеры указанного гена включают в себя, например, ген leuA, который дает фермент, ингибирование которого L-лейцином в значительной степени устранено.

[L-изолейцин]

Способность продуцировать L-изолейцин можно придать, например, введением оперона thrABC, содержащего ген thrA, кодирующий аспартокиназу I/гомосериндегидрогеназу I, полученную из E.coli, который в значительной степени десенсибилизирован к ингибированию L-треонином, и оперона ilvGMEDA, который содержит ген ilvA, кодирующий треониндезаминазу, который в значительной степени десенсибилизирован к ингибированию L-изолейцином и район которого, необходимый для ослабления, удален (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 8-47397/1996).

[Другие аминокислоты]

Биосинтез L-триптофана, L-фенилаланина, L-тирозина, L-треонина и L-изолейцина можно усилить, повышая способность бактерий Methylophilus продуцировать фосфоенолпируват (WO97/08333).

Способность продуцировать L-фенилаланин и L-тирозин повышали путем амплификации или введения десенсибилизированного гена хоризматмутазы-префенатдегидратазы (CM-PDT) (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 5-236947/1993 и 62-130693/1987) и десенсибилизированного гена 3-дезокси-D-арабиногептулонат-7-фосфатсинтазы (DS) (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 5-236947/1993 и 61-124375/1986).

Способность продуцировать L-триптофан повышают путем амплификации или введения триптофанового оперона, содержащего ген, кодирующий десенсибилизированную антранилатсинтазу (опубликованная заявка на патент Японии (Kokai) No. 57-71397/1982, 62-244382/1987 и патент США No. 4371614).

В данном описании выражение «активность фермента повышена» обычно относится к тому, что внутриклеточная активность фермента выше, чем активность у штамма дикого типа, и к тому случаю, когда штамм, в котором активность фермента повышена, получают путем модификации с использованием технологии рекомбинации генов или подобным способом, при этом внутриклеточная активность фермента выше, чем активность у штамма до модификации. Выражение «активность фермента снижена» обычно относится к тому, что внутриклеточная активность фермента ниже, чем активность у штамма