Противомикробные полипептиды из pseudoplectania nigrella

Противомикробные полипептиды из pseudoplectania nigrella

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, и полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует данные полипептиды. Изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим конструкции нуклеиновых кислот, а также к способам получения и применения полипептидов.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Объектом данного изобретения являются полипептиды, обладающие противомикробной активностью, и полинуклеотиды, кодирующие данные полипептиды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте данное изобретение относится к полипептиду, обладающему противомикробной активностью, выбранному из группы, состоящей из:

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 65% идентичностью с полипептидом, кодируемым частью нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97;

(c) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в условиях низкой жесткости с полинуклеотидным зондом, выбранным из группы, состоящей из:

(i) комплементарной нити нуклеотидов 166-285 SEQ ID NO:1,

(ii) комплементарной нити нуклеотидов 70-285 SEQ ID NO:1,

(iii) комплементарной нити нуклеотидов 1-285 SEQ ID NO:1;

(d) фрагмента (a), (b) или (c), который обладает противомикробной активностью.

Во втором аспекте данное изобретение относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид согласно изобретению.

В третьем аспекте данное изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид согласно изобретению, оперативно связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продукцией полипептида в подходящем хозяине.

В четвертом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, содержащему конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

В пятом аспекте данное изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

В шестом аспекте данное изобретение относится к способу получения полипептида согласно изобретению, указанный способ включает в себя:

(a) культивирование штамма, который в своей форме дикого типа способен продуцировать полипептид, чтобы получить полипептид; и

(b) выделение полипептида.

В седьмом аспекте данное изобретение относится к способу получения полипептида согласно изобретению, причем способ включает в себя:

(a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина согласно изобретению в условиях, способствующих продукции полипептида; и

(b) выделение полипептида.

Другие аспекты данного изобретения будут понятны из следующего далее описания и прилагаемой формулы изобретения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед обсуждением данного изобретения более подробно сначала будут даны определения следующих терминов и условных обозначений.

Существенно чистый полипептид: В данном контексте термин «существенно чистый полипептид» означает препарат полипептида, который содержит самое большое 10 мас.% другого полипептидного вещества, с которым он совместно встречается в природе (предпочтительно более низкое процентное содержание другого полипептидного вещества, например, самое большее 8 мас.%, самое большее 6 мас.%, самое большее 5 мас.%, самое большее 4 мас.%, самое большее 3 мас.%, самое большее 2 мас.%, самое большее 1 мас.% и самое большее 1/2 мас.%). Таким образом, предпочтительно, чтобы существенно чистый полипептид был чистым по меньшей мере на 92%, т.е. чтобы полипептид составлял по меньшей мере 92мас.% от суммарного полипептидного вещества, присутствующего в препарате, и предпочтительно более высокое процентное содержание, такое как в случае по меньшей мере 94% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 96% чистоты, по меньшей мере 97% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 99,5% чистоты. Полипептиды, описанные в данной заявке, предпочтительно находятся в по существу чистой форме. В частности предпочтительно, чтобы приведенные в данном описании полипептиды были «в по существу чистой форме», т.е. чтобы препарат полипептида по существу не содержал другого полипептидного вещества, вместе с которым он встречается в природе. Это можно осуществить, например, получая полипептид с использованием хорошо известных рекомбинантных способов. В данном описании термин «существенно чистый полипептид» является синонимом терминов «изолированный полипептид» и «полипептид в изолированной форме».

Противомикробная активность: Термин «противомикробная активность» в данном описании определяется как активность, которая способна убивать или ингибировать рост микробных клеток. В контексте данного изобретения подразумевается, что термин «противомикробный» означает, что имеет место бактерицидное, и/или бактериостатическое, и/или фунгицидное, и/или фунгистатическое действие и/или вирицидное действие, при этом термин «бактерицидное» следует понимать как способное убивать бактериальные клетки. Термин «бактериостатическое» следует понимать как способное ингибировать бактериальный рост, т.е. ингибировать рост бактериальных клеток. Термин «фунгицидное» следует понимать как способное убивать клетки грибов. Термин «фунгистатическое» следует понимать как способное ингибировать рост грибов, т.е. ингибировать рост клеток грибов. Термин «вирицидное» следует понимать как способное инактивировать вирус. Термин «микробные клетки» означает бактериальные клетки или клетки грибов (включая дрожжи).

В контексте данного изобретения подразумевается, что термин «ингибирование роста микробных клеток» означает, что клетки находятся в нерастущем состоянии, т.е. они не способны размножаться.

Для целей данного изобретения противомикробную активность можно определить согласно способу, описанному Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2), pp. 167-174 (1991).

Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, могут быть способны уменьшать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и особенно в водном растворе 0,1% (мас./мас.) полипептидов, обладающих противомикробной активностью.

Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, также могут обладать способностью ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и особенно при добавлении в концентрации 25 ч./млн.

Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, могут обладать способностью уменьшать количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 после 30 мин инкубирования при 20°C в водном растворе 25% (мас./мас.); предпочтительно в водном растворе 10% (мас./мас.); более предпочтительно в водном растворе 5% (мас./мас.); еще более предпочтительно в водном растворе 1% (мас./мас.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (мас./мас.); и особенно в водном растворе 0,1% (мас./мас.) полипептидов, обладающих противомикробной активностью.

Полипептиды, обладающие противомикробной активностью, также могут обладать способностью ингибировать рост Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ч./млн; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 ч./млн; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 ч./млн; еще более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 ч./млн; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 ч./млн; и особенно при добавлении в концентрации 25 ч./млн.

Полипептиды согласно данному изобретению предпочтительно должны обладать по меньшей мере 20% противомикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В особенно предпочтительном варианте полипептиды должны обладать по меньшей мере 40%, а именно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, а именно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, а именно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, а именно примерно или по меньшей мере 100% противомикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.

Идентичность: В данном контексте гомология между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность».

В целях данного изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием программы FASTA, включенной в версию 2.0x пакета программ FASTA (см. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85: 2444-2448; и W. R. Pearson (1990) «Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA», Methods in Enzymology 183: 63-98). Используемой для подсчета очков матрицей была BLOSUM50, штраф за пропуск составлял -12, и штраф за удлинение пропуска составлял -2.

Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием такого же алгоритма и пакета компьютерных программ, как описанные выше. В качестве матрицы для подсчета очков использовали матрицу идентичности, штраф за пропуск составлял -16, и штраф за удлинение пропуска составлял -4.

Фрагмент: При использовании в данном описании «фрагмент» SEQ ID NO:2 представляет собой полипептид, в котором одна или несколько аминокислот делетированы из амино- и/или карбоксильного конца данной аминокислотной последовательности.

Аллельный вариант: В данном контексте термин «аллельный вариант» означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же локус в хромосоме. Аллельные варианты возникают в природе в результате мутации и могут приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельным вариантом полипептида является полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

Существенно чистый полинуклеотид: Термин «существенно чистый полинуклеотид» в использовании в данном описании относится к препарату полинуклеотида, в котором полинуклеотид был извлечен из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в системах продуцирования генетически сконструированного белка. Таким образом, существенно чистый полинуклеотид содержит самое большее 10 мас.% другого полинуклеотидного вещества, с которым он вместе встречается в природе (предпочтительно более низкое процентное содержание другого полинуклеотидного вещества, например, самое большее 8 мас.%, самое большее 6 мас.%, самое большее 5 мас.%, самое большее 4 мас.%, самое большее 3 мас.%, самое большее 2 мас.%, самое большее 1 мас.% и самое большее 1/2 мас.%). Однако существенно чистый полинуклеотид может содержать 5'- и 3'-нетранслируемые области природного происхождения, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чтобы существенно чистый полинуклеотид был чистым по меньшей мере на 92%, т.е. чтобы полинуклеотид составлял по меньшей мере 92 мас.% от суммарного полинуклеотидного вещества, присутствующего в препарате, и предпочтительно более высокое процентное содержание, такое как в случае по меньшей мере 94% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 96% чистоты, по меньшей мере 97% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 99,5% чистоты. Полинуклеотиды, описанные в данной заявке, предпочтительно находятся в по существу чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы приведенные в данном описании полинуклеотиды были «в по существу чистой форме», т.е. чтобы препарат полинуклеотида по существу не содержал другого полинуклеотидного вещества, вместе с которым он встречается в природе. В данном описании термин «существенно чистый полинуклеотид» является синонимом терминов «изолированный полинуклеотид» и «полинуклеотид в изолированной форме».

Модификация(ции): В контексте данного изобретения термин «модификация(ции)» предназначен для обозначения любой химической модификации полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, показанной в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2, а также генетической обработки ДНК, кодирующей данный полипептид. Модификацией(ями) может быть замена боковой цепи(пей) аминокислоты, замена(ны), делеция(ции) и/или инсерция(ции) в положении или рядом с представляющей интерес аминокислотой(ами).

Искусственный вариант: При использовании в данном описании термин «искусственный вариант» означает полипептид, обладающий противомикробной активностью, который был продуцирован организмом, который экспрессирует ген, модифицированный по сравнению с SEQ ID NO:1. Модифицированный ген, с которого продуцируется указанный вариант при экспрессии в подходящем хозяине, получают в результате вмешательства человека посредством модификации нуклеотидной последовательности, описанной SEQ ID NO:1.

кДНК: Подразумевается, что термин «кДНК» при использовании в данном контексте, означает молекулу ДНК, которую можно получить обратной транскрипцией со зрелой, сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. В кДНК отсутствуют интронные последовательности, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, и он претерпевает серию событий процессинга перед появлением в виде зрелой сплайсированной мРНК. Указанные события включают удаление интронных последовательностей в ходе процесса, называемого сплайсингом. Поэтому когда кДНК получают из мРНК, она не содержит интронных последовательностей.

Конструкция нуклеиновой кислоты: При использовании в данном описании термин «конструкция нуклеиновой кислоты» означает молекулу нуклеиновой кислоты, либо однонитевую, либо двунитевую, которая выделена из встречающегося в природе гена или которая была модифицирована так, чтобы она содержала участки нуклеиновых кислот таким образом, который в иных обстоятельствах не существует в природе. Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «экспрессирующая кассета» в том случае, когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности согласно данному изобретению.

Регуляторная последовательность: Термин «регуляторные последовательности» в данном описании включает все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полипептида согласно данному изобретению. Каждая регуляторная последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Такие регуляторные последовательности включают, но не ограничены указанным, лидер, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Минимально регуляторные последовательности включают в себя промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Регуляторные последовательности могут быть снабжены линкерами в целях введения специфичных сайтов рестрикции, облегчающих лигирование регуляторных последовательностей с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

Оперативно связанный: Термин «оперативно связанный» в данном описании определяют как конфигурацию, в которой регуляторная последовательность соответствующим образом помещена в определенное положение относительно кодирующей последовательности ДНК-последовательности так, чтобы регуляторная последовательность управляла экспрессией полипептида.

Кодирующая последовательность: При использовании в данном описании подразумевается, что термин «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со стартового кодона ATG. Обычно кодирующая последовательность включает ДНК, кДНК и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.

Экспрессия: В данном контексте термин «экспрессия» включает в себя любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, включая, но не ограничивая указанным, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессирующий вектор: В данном контексте термин «экспрессирующий вектор» относится к молекуле ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит участок, кодирующий полипептид согласно изобретению, и который оперативно связан с дополнительными участками, которые обеспечивают его транскрипцию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин» в используемом в данном описании смысле включает в себя любой тип клеток, который поддается трансформации конструкцией нуклеиновой кислоты.

Термины «полинуклеотидный зонд», «гибридизация», а также различные условия жесткости определены в разделе, озаглавленном «Полипептиды, обладающие противомикробной активностью».

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Полипептиды, обладающие противомикробной активностью

В первом варианте данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, и при этом полипептиды содержат, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, степень идентичности которой с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2 (т.е. зрелым полипептидом) составляет по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например, по меньшей мере 97%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99% (в дальнейшем «гомологичные полипептиды»). В представляющем интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по десяти аминокислотам (например, десятью аминокислотами), особенно самое большее по пяти аминокислотам (например, пятью аминокислотами), например, самое большее по четырем аминокислотам (например, четырьмя аминокислотами), например, самое большее по трем аминокислотам (например, тремя аминокислотами) от аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В представляющем особый интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по двум аминокислотам (например, двумя аминокислотами), например, по одной аминокислоте от аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.

Предпочтительно полипептиды согласно данному изобретению содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; ее аллельный вариант или ее фрагмент, который обладает противомикробной активностью. В другом предпочтительном варианте полипептид согласно данному изобретению содержит аминокислоты 1-40 SEQ ID NO:2. В следующем предпочтительном варианте полипептид состоит из аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.

Аминокислоты, составляющие полипептид согласно изобретению, могут быть независимо выбраны из D- или L-форм.

Полипептид согласно изобретению может быть полипептидом дикого типа, обладающим противомикробной активностью, идентифицированным и выделенным из природного источника. Специфичный скрининг таких полипептидов дикого типа можно осуществить стандартными способами, известными в данной области. Кроме того, полипептид согласно изобретению можно получить способом перестановки ДНК так, как описано в J. E. Ness et al. Nature Biotechnology 17, 893-896 (1999). Кроме того, полипептид согласно изобретению может являться искусственным вариантом, который содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию аминокислоты по сравнению с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2. Такие искусственные варианты можно сконструировать стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-специфичный/случайный мутагенез полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2. В одном варианте изобретения изменения аминокислот (в искусственном варианте, а также в полипептидах дикого типа) минимальны, то есть представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые существенно не влияют на укладку и/или активность белка; небольшие делеции, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; небольшие удлинения аминоконца или карбоксильного конца, такие как аминоконцевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид примерно до 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое облегчает очистку за счет изменения результирующего заряда или другой функции, такое как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примеры консервативных замен имеются в группе основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глютаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глютамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин, валин и метионин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин и треонин). Замены аминокислот, которые в общем не изменяют специфичную активность, известны в данной области и описаны, например, H. Neurath and R. L. Hill, 1979, In The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly, а также обратные замены указанных аминокислот.

В представляющем интерес варианте изобретения аминокислотными заменами являются замены такой природы, при которой изменяются физико-химические свойства полипептидов. Например, могут быть осуществлены замены аминокислот, которые повышают термостабильность полипептида, которые изменяют субстратную специфичность, которые изменяют оптимум pH и тому подобные.

Предпочтительно количество таких замен, делеций и/или инсерций по сравнению с аминокислотами 1-40 SEQ ID NO:2 составляет самое большее 10, например, самое большее 9, например, самое большее 8, более предпочтительно самое большее 7, например, самое большее 6, например, самое большее 5, наиболее предпочтительно самое большее 4, например, самое большее 3, например, самое большее 2, особенно самое большее 1.

Авторы данного изобретения выделили ген, кодирующий полипептид, обладающий противомикробной активностью, из Pseudoplectania nigrella. Штамм Pseudoplectania nigrella, несущий ген, депонировали в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 28 января 1997 г. в The Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands (альтернативно P.O.Box 85167, 3508 AD Utrecht, The Netherlands), и присвоили номер доступа No. CBS 444.97.

Таким образом, во втором варианте данное изобретение относится к полипептидам, содержащим, предпочтительно состоящим из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 65% идентична кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В представляющем интерес варианте изобретения полипептид содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая обладает по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, например, по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере 96%, например по меньшей мере 97% и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, например, по меньшей мере 99% идентичностью с кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97 (в дальнейшем «гомологичные полипептиды»). В представляющем интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по десяти аминокислотам (например, десятью аминокислотами), особенно самое большее по пяти аминокислотам (например, пятью аминокислотами), например, самое большее по четырем аминокислотам (например, четырьмя аминокислотами), например, самое большее по трем аминокислотам (например, тремя аминокислотами) от кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В представляющем особый интерес варианте аминокислотная последовательность отличается самое большее по двум аминокислотам (например, двумя аминокислотами), например, по одной аминокислоте от кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.

Предпочтительно полипептиды согласно данному изобретению содержат аминокислотную последовательность кодирующей противомикробный полипептид части нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В другом предпочтительном варианте полипептид согласно изобретению состоит из аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого кодирующей противомикробный полипептид частью нуклеотидной последовательности, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.

Подобно тому, как описано выше, полипептид согласно изобретению может представлять собой искусственный вариант, который содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере одну замену, делецию и/или инсерцию аминокислоты по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой частью нуклеотидной последовательности, кодирующей противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.

В третьем варианте данное изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробной активностью, которые кодируются нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях низкой жесткости, более предпочтительно в условиях средней жесткости, более предпочтительно в условиях умеренно высокой жесткости, еще более предпочтительно в условиях высокой жесткости и наиболее предпочтительно в условиях очень высокой жесткости с полинуклеотидным зондом, выбранным из группы, состоящей из (i) нити, комплементарной нуклеотидам 166-285 SEQ ID NO:1, (ii) нити, комплементарной последовательности кДНК, заключенной в нуклеотидах 70-285 SEQ ID NO:1, и (iii) нити, комплементарной нуклеотидам 1-285 SEQ ID NO:1 (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательность, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент можно использовать для того, чтобы сконструировать полинуклеотидный зонд для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие противомикробной активностью, из штаммов различных родов или видов согласно способам, хорошо известным в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК представляющего интерес рода или вида с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга, чтобы идентифицировать и выделить соответствующий ген. Такие зонды могут быть значительно короче, чем полная последовательность, но должны иметь длину по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 нуклеотидов в длину, например, по меньшей мере 70 нуклеотидов в длину. Однако предпочтительно, чтобы полинуклеотидный зонд имел длину по меньшей мере 100 нуклеотидов. Например, полинуклеотидный зонд может составлять по меньшей мере 200 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 300 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 400 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 500 нуклеотидов в длину. Можно использовать еще более длинные зонды, например, полинуклеотидные зонды, которые составляют по меньшей мере 600 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 700 нуклеотидов в длину, по меньшей мере 800 нуклеотидов в длину или по меньшей мере 900 нуклеотидов в длину. Можно использовать как ДНК-зонды, так и РНК-зонды. Зонды обычно метят для выявления соответствующего гена (например, ³²P, ³H, ³⁵S, биотином или авидином).

Таким образом, можно проводить скрининг библиотеки геномной ДНК или кДНК, полученной из других подобных организмов, в отношении ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид, обладающий противомикробной активностью. Геномную или другую ДНК из других подобных организмов можно разделить с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или другими способами разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести и иммобилизовать на нитроцеллюлозе или других подходящих материалах носителей. Чтобы идентифицировать клон или ДНК, которая гомологична SEQ ID NO:1, материал носителя с иммобилизованной ДНК используют для Саузерн-блота.

В целях данного изобретения гибридизация свидетельствует о том, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченым полинуклеотидным зондом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, в условиях жесткости от очень низкой до очень высокой. Молекулы, с которыми полинуклеотидный зонд гибридизуется в данных условиях, можно зарегистрировать с использованием рентгеновской пленки или любым другим способом, известным в данной области. Всякий раз, когда термин «полинуклеотидный зонд» используется в данном контексте, следует понимать, что такой зонд содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов.

В представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью нуклеотидов 166-285, нуклеотидов 70-285 или нуклеотидов 1-285 SEQ ID NO:1.

В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью нуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2. В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью SEQ ID NO:1. В еще одном представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью кодирующей зрелый полипептид области SEQ ID NO:1. В другом представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью кодирующей противомикробный полипептид области, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97. В еще одном представляющем интерес варианте полинуклеотидный зонд является комплементарной нитью области, кодирующей зрелый противомикробный полипептид, присутствующей в Pseudoplectania nigrella CBS 444.97.

В случает длинных зондов, имеющих длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, условия от очень низкой до очень высокой жесткости характеризуют как предгибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5× SSPE, 1,0% SDS, 5× растворе Денхардта, 100 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося, с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга. Предпочтительно длинные пробы по меньшей мере из 100 нуклеотидов не содержат более 1000 нуклеотидов. В случае длинных проб по меньшей мере из 100 нуклеотидов в длину материал носителя в конце три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 2× SSC, 0,1% SDS при 42°C (очень низкая жесткость), предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,5× SSC, 0,1% SDS при 42°C (низкая жесткость), более предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,2× SSC, 0,1% SDS при 42°C (средняя жесткость), еще более предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,2× SSC, 0,1% SDS при 55°C (умеренно высокая жесткость), наиболее предпочтительно три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,1× SSC, 0,1% SDS при 60°C (высокая жесткость), в частности, три раза промывают, каждый раз по 15 минут, используя 0,1× SSC, 0,1% SDS при 68°C (очень высокая жесткость).

Хотя не особенно предпочтительно, но предполагается, что также можно использовать более короткие зонды, например, зонды длиной примерно от 15 до 99 нуклеотидов, такие как примерно от 15 до 70 нуклеотидов в длину. В случае таких коротких зондов условия жесткости характеризуют как предгибридизацию, гибридизацию и промывку после гибридизации при температуре на 5-10°C ниже рассчитанной T_m с использованием расчета согласно Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390) в 0,9 М NaCl, 0,09 M трис-HCl pH 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1× растворе Денхардта, 1 мМ пирофосфате натрия, 1 мМ однозамещенном фосфате натрия, 0,1 мМ ATP и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл, с последующими стандартными процедурами Саузерн-блоттинга.

В случае коротких зондов, которые имеют длину примерно от 15 до 99 нуклеотидов, материал носителя промывают один раз в 6× SCC плюс 0,1% SDS в течение 15 минут и два раза, каждый раз по 15 минут, используя 6× SSC при температуре на 5-10°C ниже рассчитанной T_m.

N-концевое удлинение

N-концевое удлинение соответственно может состоять из 1-50 аминокислот, предпочтительно 2-20 аминокислот, особенно 3-15 аминокислот. В одном варианте N-концевое удлинение пептида не содержит Arg (R). В другом варианте N-концевое удлинение содержит kex2 или kex2-подобный сайт расщепления, определение которого будет дано ниже. В предпочтительном варианте N-концевое удлинение представляет собой пептид, содержащий по меньшей мере два аминокислотных остатка Glu (E) и/или Asp (D), такое как N-концевое удлинение, содержащее одну из следующих последовательностей:

EAE, EE, DE, DD.

Сайты kex2

Сайты kex2 (см., например, Methods in Enzymology Vol. 185, ed. D. Goeddel, Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology") и kex2-подобные сайты являются состоящими из двух оснований сайтами узнавания (т.е. сайтами расщепления), обнаруженными между областью, кодирующей пропептид, и областью зрелого пептида некоторых белков.

В некоторых случаях показано, что инсерция сайта kex2 или kex2-подобного сайта усиливает точный эндопептидазный процессинг в сайте отщепления пропептида, приводя к повышенным уровням секреции белка.

В контексте изобретения инсерция сайта kex2 или kex2-подобного сайта в результате дает возможность получить расщепление в определенном положении в N-концевом удлинении, приводя к тому, что противомикробный полипептид становится удлиненным по сравнению со зрелым полипептидом, показанным в виде аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2.

Источники полипептидов, обладающих противомикробной активностью

Полипептид согласно данному изобретению можно получить из микроорганизмов любого рода. В целях данного изобретения термин «полученный из» в используемом в данном описании смысле будет означать, что полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, продуцируется клеткой, в которой нуклеотидная последовательность присутствует в природе или в которую нуклеотидная последовательность была встроена. В предпочтительном варианте полипептид секретируется из клетки.

Полипептид согласно данному изобретению может быть бактериальным полипептидом. Например, полипептид может быть полипептидом грамположительной бактерии, таким как полипептид Bacillus, например полипептид Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis или Bacillus thuringiensis; или полипептид Streptomyces, например, полипептид Streptomyces l