Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты

Генетически сконструированная зависимая от пирролохинолинхинона глюкозодегидрогеназа, содержащая инсерцию аминокислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Настоящее изобретение относится к улучшенным вариантам растворимых зависимых от пирролохинолинхинона (PQQ) глюкозодегидрогеназ (s-GDH), содержащих инсерцию аминокислоты между положениями 428 и 429, которые соответствуют аминокислотной последовательности, известной для Acinetobacter calcoaceticus, к генам, кодирующим такой вариант s-GDH, к белкам таких вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью в отношении глюкозы и к различным применениям указанных вариантов s-GDH, в частности, для определения концентраций сахаров, особенно глюкозы, в образце.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Определение концентрации глюкозы в крови очень важно для клинической диагностики и терапии диабета. Примерно 150 миллионов людей во всем мире страдают хроническим заболеванием сахарным диабетом, и согласно ВОЗ эта цифра может удвоиться к 2025 году. Хотя диабет легко диагностируется и поддается лечению, но для успешной долговременной терапии требуются недорогиие диагностические средства, которые быстро и точно представляют данные о концентрациях глюкозы в крови. PQQ-зависимые глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) катализируют реакцию, в которой глюкоза окисляется до глюконолактона. Поэтому указанный тип фермента используют для измерения сахара в крови. Одним из таких средств является диагностическая полоска на основе растворимой глюкозодегидрогеназы (s-GlucDOR, EC 1.1.99.17), фермента, содержащего пирролохинолинхинон, исходно полученного из Acinetobacter calcoaceticus.

Хинопротеины используют хинон в качестве кофактора для окисления спиртов, аминов и альдоз до соответствующих лактонов, альдегидов и альдоновых кислот (Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-284; Davidson, V. L., in "Principles and applications of quinoproteins" (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker; Anthony, C., Biochem. J. 320 (1996) 697-711; Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C., Biochem. Soc. Trans. 26 (1998) 413-417; Anthony, C. and Ghosh, M., Prog. Biophys. Mol. Biol. 69 (1998) 1-21. Среди хинопротеинов самую большую подгруппу составляют хинопротеины, содержащие нековалентно связанный кофактор 2,7,9-трикарбокси-1H-пирроло[2,3-f]хинолин-4,5-дион (PQQ) (Duine 1991, выше). Все известные до настоящего времени бактериальные хинон-глюкозодегидрогеназы относятся к данной подгруппе с PQQ в качестве кофактора (Anthony and Ghosh 1997 выше, Goodwin, P.M. and Anthony, C., Adv. Microbiol. Physiol. 40 (1998) 1-80; Anthony, C., Adv. in Phot. and Resp. 15 (2004) 203-225).

Два типа PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы (EC 1.1.99.17) были описаны у бактерий: одна является мембраносвязанной (m-GDH), другая - растворимой (s-GDH). Оба типа не имеют какой-либо существенной гомологии последовательностей (Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol. Gen. Genet. 217 (1989) 430-436; Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-79; Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791. Они также отличаются как кинетическими, так и иммунологическими свойствами (Matsushita, K., et al., Bioscience Biotechnol. and Biochem. 59 (1995) 1548-1555). m-GDH широко распространены у грамотрицательных бактерий, тогда как s-GDH были обнаружены только в периплазматическом пространстве штаммов Acinetobacter, таких как A. calcoaceticus (Duine, J.A., 1991a; Cleton-Jansen, A.M. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2121-2125; Matsushita and Adachi, 1993) и A. baumannii (JP 11243949).

Посредством поиска в базах данных последовательностей были идентифицированы две последовательности, гомологичные полноразмерной s-GDH A. calcoaceticus в E.coli K-12 и видах Synechocystis. Кроме того, две неполные последовательности, гомологичные s-GDH A. calcoaceticus, также были обнаружены в геноме P. aeruginosa и Bordetella pertussis (Oubrie et al. 1999 a, b, c) и Enterobacter intermedium (Kim, C.H. et al., Current Microbiol. 47 (2003) 457-461), соответственно. Установленные аминокислотные последовательности этих четырех не охарактеризованных белков являются близко родственными s-GDH A. calcoaceticus, при этом большое количество остатков в предполагаемом активном сайте является абсолютно консервативным. Вероятно, эти гомологичные белки имеют сходную структуру и катализируют сходные PQQ-зависимые реакции (Oubrie et al., 1999 a, b, c; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151; Reddy, S., and Bruice, T.C., J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2431-2438; Yamada, M. et al., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 185-192).

Было обнаружено, что бактериальные s-GDH и m-GDH обладают довольно разными последовательностями и имеют разную субстратную специфичность. Например, A. calcoaceticus содержит две разные PQQ-зависимые глюкозодегидрогеназы, одну m-GDH, которая активна in vivo, а другая, - названная s-GDH, для которой может быть показана только активность in vitro. Cleton-Jansen et al., 1988; 1989 a, b клонировали гены, кодирующие два фермента GDH, и определили последовательности ДНК обоих указанных генов GDH. Не существует явной гомологии между m-GDH и s-GDH, что подтверждает тот факт, что m-GDH и s-GDH представляют собой две совершенно разные молекулы (Laurinavicius, V., et al, Biologija (2003) 31-34).

Гены s-GDH A. calcoaceticus клонированы в E. coli. После образования в клетке s-GDH перемещается через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство (Duine, J. A., Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in "The Biology of Acinetobacter" (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Matsushita, K. and Adachi, O., Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in "Principles and applications of Quinoproteins" (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker). Подобно нативной s-GDH A. Calcoaceticus рекомбинантная s-GDH, экспрессированная в E. coli, представляет собой гомодимер с одной молекулой PQQ и тремя ионами кальция на мономер (Dokter, P. et al., Biochem. J. 239 (1986) 163-167; Dokter, P. et al., FEMS Microbiol. Lett. 43 (1987) 195-200; Dokter, P. et al., Biochem. J. 254 (1988) 131-138; Olsthoorn, A. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333, Oubrie, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96 (1999) 11787-11791, Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194). s-GDH окисляет большое число моно- и дисахаридов до соответствующих кетонов, которые затем гидролизуются до альдоновых кислот, и s-GDH также может быть донором электронов для PMS (феназинметосульфат), DCPIP (2,6-дихлорфенолиндофенол), WB (голубой Вюрстера) и убихинонов с короткой цепью, таких как убихинон Q1 и убихинон Q2 (Matsushita, K., et al., Biochem. 28 (1989) 6276-6280; Matsushita, K., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), нескольких искусственных акцепторов электронов, таких как метилсульфат N-метилфеназония (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch. Biochem. Biophys. 336 (1996) 42-48; Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochem. 37 (1998) 13854-13861) и электропроводящие полимеры (Ye, L., et al., Anal. Chem. 65 (1993) 238-241). Ввиду высокой специфичной активности s-GDH по отношению к глюкозе (Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., (1996) выше) и своей широкой специфичности по отношению к искусственным акцепторам электронов фермент подходит для аналитического использования, особенно для применения в (био)сенсоре или индикаторных полосках для определения глюкозы в случае диагностических применений (Kaufmann, N. et al., Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised blood in "Glucotrend" (1997) 1-16, Boehringer Mannheim GmbH; Malinauskas, A.; et al., Sensors and Actuators, B: Chemical B100 (2004) 395-402).

Окисление глюкозы может катализировать по меньшей мере три совершенно разные группы ферментов, т.е. NAD/P-зависимые глюкозодегидрогеназы, флавопротеиновые глюкозооксидазы или хинопротеиновые GDH (Duine, J.A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23). Наблюдали довольно медленное автоокисление восстановленной s-GDH, что свидетельствует о том, что кислород является очень плохим акцептором электронов для s-GDH (Olsthoorn and Duine, 1996). s-GDH может быть эффективным донором электронов от восстановленного хинона к таким переносчикам, как PMS, DCPIP, WB и убихиноны с короткой цепью, такие как Q1 и Q2, но не может эффективно отдавать электроны непосредственно на кислород.

В общепринятых индикаторных полосках и сенсорах для наблюдения за уровнем глюкозы в крови, сыворотке и моче, например, больных диабетом, используют глюкозооксидазу. Эффективность фермента зависит от концентрации кислорода. Измерение глюкозы на разной высоте над уровнем моря при разных концентрациях кислорода в воздухе может приводить к ошибочным результатам. Основным преимуществом PQQ-зависимых глюкозодегидрогеназ является их независимость от кислорода. Такое важное свойство описано, например, в патенте US 6103509, в котором исследованы некоторые свойства мембраносвязанной GDH.

Важным вкладом в данную область стало использование s-GDH вместе с подходящими переносчиками. Способы анализа и устройства в виде индикаторных полосок на основе s-GDH подробно описаны в патенте US 5484708. Указанный патент также содержит подробную информацию о проведении анализов и получении основанных на s-GDH индикаторных полосках для измерения глюкозы. Способы, описанные в этой публикации, а также в цитированных документах, приведены в настоящее описание в качестве ссылки.

Другими патентами или заявками, относящимися к данной области и содержащими конкретную информацию о различных способах применения ферментов с глюкозодегидрогеназной активностью, являются US 5997817; US 6057120; EP 0 620 283 и JP 11-243949-A.

Коммерческой системой, в которой используют s-GDH, и индикатор, который вызывает изменение окраски в том случае, когда происходит реакция (Kaufmann et al. 1997 выше), является система Glucotrend®, распространяемая Roche Diagnostics GmbH.

Несмотря на обсуждаемые выше преимущества в случае применения PQQ-зависимой s-GDH, при определении глюкозы также необходимо учитывать некоторые недостатки. Фермент имеет довольно широкий спектр субстратов по сравнению с m-GDH. То есть s-GDH окисляет не только глюкозу, но также некоторые другие сахара, включая мальтозу, галактозу, лактозу, маннозу, ксилозу и рибозу (Dokter et al. 1986 a; Oubrie A., Biochim. Biophys. Acta 1647 (2003) 143-151). Реактивность по отношению к другим сахарам, отличным от глюкозы, может в некоторых случаях снижать точность определения уровней глюкозы в крови. В частности, у пациентов, находящихся на перитонеальном диализе, получающих лечение икодекстрином (полимером глюкозы), в жидкостях организма, например, в крови, могут находиться высокие уровни других сахаров, особенно мальтозы (Wens, R., et al., Perit. Dial. Int. 18 (1998) 603-609).

Поэтому клинические образцы, которые, например, получены у больных диабетом, особенно у пациентов с почечными осложнениями и особенно у пациентов, находящихся на диализе, могут быть значительные уровни других сахаров, особенно мальтозы. Определения глюкозы в образцах, полученных у таких пациентов в критическом состоянии, могут быть искажены за счет мальтозы (Davies, D., Perit. Dial. Int. 14 (1994) 45-50; Frampton, J. E.; and Plosker, G. L., Drugs 63 (2003) 2079-2105).

В литературе имеется мало сообщений о попытках получить модифицированные PQQ-зависимые s-GDH с измененной субстратной специфичностью. В статье Igarashi, S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 264 (1999) 820-824 указано, что введение точечной мутации в положение Glu277 приводит к мутантам с измененным профилем субстратной специфичности.

Sode в патенте EP 1 176 202 указывает, что некоторые аминокислотные замены в s-GDH приводят к образованию мутанта s-GDH с повышенной аффинностью к глюкозе. В патенте EP 1 167 519 тот же автор сообщает о мутанте s-GDH с повышенной стабильностью. Кроме того, тот же автор в патенте JP2004173538 сообщает о других мутантах s-GDH с повышенной аффинностью к глюкозе.

Kratzsch, P. et al. в WO 02/34919 указывают, что специфичность s-GDH в отношении глюкозы по сравнению с другими сахарами-субстратами, особенно по сравнению с мальтозой, может быть повышена посредством аминокислотных замен в некоторых положениях s-GDH.

Takeshima, S., et al. (EP 1 367 120) сообщали о мутантной s-GDH, содержащей некоторые аминокислотные замены или инсерцию аминокислоты между положениями 427 и 428 в соответствии с аминокислотной последовательностью, известной для Acinetobacter calcoaceticus.

Однако, несмотря на сообщения о некоторых усовершенствованиях в создании мутантов или вариантов s-GDH с улучшенными свойствами, все еще требуются дальнейшие, альтернативные и/или дополнительные усовершенствования.

Следовательно, существует потребность и клиническая необходимость в дополнительных мутантных или вариантных формах s-GDH, которые самостоятельно или в комбинации с уже известными мутациями могут привести к улучшенной специфичности в отношении глюкозы в качестве субстрата.

Целью настоящего изобретения было получение новых мутантов или вариантов s-GDH, которые либо самостоятельно, либо в комбинации с уже известными мутациями приводят к существенно улучшенной субстратной специфичности в отношении глюкозы по сравнению с другими выбранными молекулами сахаров, например, такими как галактоза или мальтоза.

Неожиданно было обнаружено, что можно значительно улучшить субстратную специфичность s-GDH в отношении глюкозы по сравнению с другими сахарами путем вставки аминокислоты между положениями 428 и 429 s-GDH, соответствующим аминокислотной последовательности, известной для Acinetobacter calcoaceticus, и, таким образом, по меньшей мере частично решить описанные выше проблемы, известные в данной области.

Субстратная специфичность в отношении к глюкозе по сравнению с другими выбранными молекулами сахаров была значительно повышена в результате получения инсерционных вариантов s-GHD согласно настоящему изобретению и как описано в данной публикации ниже и в прилагаемой формуле изобретения.

Благодаря повышенной субстратной специфичности новых форм s-GDH возможен значительный технический прогресс в определении глюкозы в случае применения в различных областях. Улучшенные варианты s-GDH можно использовать с большим преимуществом для специфичного определения или измерения глюкозы в биологических образцах, особенно в устройствах на основе индикаторных полосок или в биосенсорах.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к варианту растворимой формы EC 1.1.99.17, также известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и необязательно дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, предпочтительно замен в положении 348 и 428.

Также настоящее изобретение относится к предпочтительным вариантам s-GDH, обладающим улучшенными свойствами, особенно повышенной специфичностью по отношению к глюкозе, а также к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим такие варианты, к экспрессирующему вектору, содержащему такую полинуклеотидную последовательность, и к клетке-хозяину, содержащей указанный экспрессирующий вектор.

Изобретение, кроме того, относится к применению варианта по настоящему изобретению в способе измерения глюкозы, особенно с помощью устройства на основе индикаторных полосок или биосенсора.

Следующие примеры, ссылки, список последовательностей и фигуры предлагаются для большего понимания настоящего изобретения, действительный объем которого указан в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что могут быть осуществлены модификации в указанных способах, не отходя от сути изобретения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 - Последовательности белков PQQ-зависимой s-GDH A. calcoaceticus (вверху) и s-GDH A. baumannii (внизу), выровненные в соответствии с гомологией последовательностей.

Фиг.2 - Иллюстрация вектора pACSGDH, указанного в примере 1, содержащего соответственно последовательность ДНК дикого типа или мутантную последовательность ДНК растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы.

Фиг.3 - Нуклеотидная последовательность (ДНК) вектора pACSGDH, указанного в примере 1, содержащего последовательность ДНК дикого типа растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как обсуждалось выше, два совершенно разных типа хинопротеидных ферментов с глюкозодегидрогеназной активностью (мембраносвязанный и растворимый) объединяют в группу с названием EC 1.1.99.17. По-видимому, указанные два типа не являются родственными друг другу.

В целях настоящего изобретения подходит только растворимая форма GDH (s-GDH), и ниже в описании обсуждаются ее улучшенные варианты.

В первом варианте осуществления изобретение относится к варианту растворимой формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и необязательно дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен.

Предпочтительно только одна аминокислота встроена между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Кроме того, предпочтительно вариант s-GDH, содержащий инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), отличается тем, что указанная встроенная аминокислота выбрана из группы, состоящей из лейцина, фенилаланина, метионина и пролина. Предпочтительно встроенной аминокислотой является пролин.

В данной области известно, что ДНК-последовательность дикого типа растворимой PQQ-зависимой глюкозодегидрогеназы может быть выделена из штаммов Acinetobacter. Наиболее предпочтительным является выделение из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. Последовательность s-GDH дикого типа (зрелого белка) приведена в SEQ ID NO: 2. Также можно использовать другие LMD-штаммы Acinetobacter в качестве источника s-GDH дикого типа. Такие последовательности могут быть выровнены с последовательностью, полученной из A. calcoaceticus, и могут быть проведены сравнения последовательностей. Очевидно, также можно провести скрининг ДНК-библиотек других бактериальных штаммов, например, как описано для E. coli K-12 (Oubrie, A., et al., J. Mol. Biol. 289 (1999) 319-333), и в таких геномах идентифицировать последовательности, родственные s-GDH. Такие последовательности и еще не идентифицированные гомологичные последовательности можно использовать для создания вариантов s-GDH с улучшенной субстратной специфичностью.

Термин «вариант», используемый в настоящем изобретении, относится к белку s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Термин «мутант», используемый в настоящем изобретении, относится к белку s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с последовательностью s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO:2).

Следовательно, оба термина «вариант» или «мутант» вместе могут использоваться в отношении белка s-GDH, который по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа имеет инсерцию аминокислоты между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2) и, дополнительно, по меньшей мере одну аминокислотную замену.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения ферментативные или функциональные свойства улучшенного варианта s-GDH сравнивают с ферментом дикого типа или мутантами без инсерции аминокислоты между положениями 428 и 429, соответственно.

Предпочтительный вариант настоящего изобретения отличается тем, что по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа он обладает по меньшей мере в два раза повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе, по сравнению с по меньшей мере одним другим выбранным в качестве субстрата сахаром.

Для расчета субстратной специфичности или перекрестной реактивности один из простых способов заключается в том, чтобы принять активность, измеренную с глюкозой в качестве субстрата, за 100% и сравнить активность, измеренную с другим выбранным сахаром, со значением для глюкозы. Иногда, чтобы не быть многословными, термин специфичность просто используют без специальной ссылки на глюкозу, с одной стороны, и выбранный в качестве субстрата сахар, с другой стороны.

Специалисту в данной области понятно, что сравнение ферментативных активностей лучше всего осуществлять при эквимолярных концентрациях исследуемых молекул субстратов, используя хорошо определенные условия анализа. В противном случае необходимо делать корректировку в отношении различий в концентрациях.

Необходимо выбрать стандартизованные и хорошо определенные условия анализа, чтобы оценить субстратную специфичность (улучшения). Ферментативную активность s-GDH по отношению к глюкозе в качестве субстрата, а также по отношению к другим выбранным в качестве субстратов сахарам измеряют, как описано в примере 7.

На основании таких измерений ферментативной активности по отношению к глюкозе или другому выбранному сахару, предпочтительно мальтозе, анализируют перекрестную реактивность (и ее улучшения).

(Перекрестную) реактивность s-GDH к выбранному сахару в процентах рассчитывают следующим образом

Перекрестная реактивность [%] = (активность к выбранному сахару/активность к глюкозе) x 100%.

Определена (перекрестная) реактивность по отношению к мальтозе s-GDH дикого типа согласно указанной выше формуле, составляющая примерно 105%. Измерена (перекрестная) реактивность s-GDH дикого типа к галактозе, составляющая примерно 50% (сравнение в таблице).

(Повышенную) специфичность рассчитывают согласно следующей формуле:

		Активность мутанта к глюкозе		Активность дикого типа к выбранному сахару
Специфичность (повышенная)	=	-----------------	×	----------------------
		Активность дикого типа к глюкозе		Активность мутанта к выбранному сахару

По сравнению с ферментом дикого типа форма s-GDH по меньшей мере с 10-кратным повышением специфичности по отношению к глюкозе по сравнению с мальтозой (мальтоза/глюкоза) соответственно при использовании мальтозы в качестве субстрата обладает не больше, чем 10,5% активности от активности, измеряемой при использовании в качестве субстрата глюкозы. Или, если, например, мутантная s-GDH обладает перекрестной реактивностью к мальтозе, составляющей 20% (определенной и рассчитанной, как описано выше), то указанный мутант по сравнению с s-GDH дикого типа имеет увеличенную в 5,25 раз субстратную специфичность (мальтоза/глюкоза).

Термин «удельная активность» по отношению к субстрату хорошо известен в данной области, предпочтительно его используют для описания ферментативной активности на количество белка. В данной области известны различные способы определения удельной активности молекул GDH с использованием глюкозы или других сахаров в качестве субстратов (Igarashi, S., et al., (1999) выше). Один из имеющихся способов измерения подробно описан в разделе «Примеры».

Хотя можно выбрать много разных молекул сахаров и исследовать специфичность s-GDH к глюкозе по сравнению с любой такой выбранной молекулой сахара, предпочтителен выбор клинически важной молекулы сахара для такого сравнения. Предпочтительные выбранные сахара выбраны из группы, состоящей из маннозы, аллозы, галактозы, ксилозы и мальтозы. Предпочтительно выбирают мальтозу или галактозу и мутантную s-GDH тестируют в отношении повышенной субстратной специфичности по отношению к глюкозе по сравнению с галактозой или мальтозой. В следующем предпочтительном варианте выбранным сахаром является мальтоза.

Обнаружено, что повышение специфичности к глюкозе вариантов s-GDH согласно данному изобретению, например, к мальтозе по сравнению с глюкозой, довольно значительно. Поэтому более предпочтительно, чтобы указанная субстратная специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с субстратной специфичностью по меньшей мере к одному другому выбранному в качестве субстрата сахару повышена по меньшей мере в три раза. Другие предпочтительные варианты осуществления изобретения включают мутанты s-GDH, характеризующиеся повышенной субстратной специфичностью по отношению к глюкозе, которая по меньшей мере в 5 раз выше или также предпочтительно по меньшей мере в 10 раз выше, чем к другой выбранной молекуле сахара.

Мутации в s-GDH во многих случаях приводят к вариантам фермента с сильно пониженной удельной активностью по отношению к субстрату глюкозе. Однако более чем 10-кратное снижение (абсолютной или общей) удельной активности по отношению к субстрату глюкозе может быть критическим для обычных применений. Поэтому предпочтительно, чтобы s-GDH с повышенной специфичностью к субстрату глюкозы обладал по меньшей мере 10% удельной активностью по отношению к глюкозе, измеренной с использованием фермента дикого типа. Конечно, более предпочтительно, чтобы такие мутантные ферменты обладали по меньшей мере 20% или более предпочтительно по меньшей мере 30% от соответствующей активности на глюкозе s-GDH дикого типа.

Более предпочтительны такие мутанты, для которых удельная активность к мальтозе составляет 10% или меньше или даже только 5% или меньше от удельной активности к мальтозе, измеренной для соответствующего фермента дикого типа на индикаторных полосках или в тестах в жидкой фазе, тогда как удельная активность по отношению к глюкозе составляет ≥ 10% по сравнению с удельной активностью по отношению к глюкозе соответствующего фермента дикого типа.

Обнаружено, что можно дополнительно повысить субстратную специфичность варианта s-GDH, содержащего инсерцию между положениями 428 и 429, посредством дальнейшей модификации такого варианта так, чтобы он дополнительно содержал одну или несколько аминокислотных замен в некоторых определенных положениях аминокислот.

Осуществление настоящего изобретения очень подробно описано с указанием положений аминокислот, известных, исходя из SEQ ID NO: 2, последовательности s-GDH дикого типа, которая выделена из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41. Положения аминокислот в разных изолятах s-GDH, соответствующие положениям в последовательности SEQ ID NO: 2, легко идентифицируют с помощью подходящего сравнения последовательностей.

Множественное выравнивание и сравнение последовательности s-GDH с последовательностью SEQ ID NO: 2 дикого типа осуществляют с использованием программы PileUp пакета программ GCG, версия 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.). PileUp создает множественное выравнивание последовательностей с использованием упрощения способа последовательного выравнивания Feng, D. F. and Doolittle, R. F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360, и соответственно задают матрицы оценок для идентичных, сходных или разных аминокислотных остатков. Указанный способ начинается с попарного выравнивания двух наиболее сходных последовательностей с получением кластера из двух выровненных последовательностей. Указанный кластер затем можно выравнивать со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей могут быть выровнены простым удлинением попарного выравнивания двух отдельных последовательностей. Конечное выравнивание осуществляют с помощью серии последовательных попарных выравниваний, которые включают все больше и больше отличающиеся последовательности и кластеры вплоть до того, пока в конечное попарное выравнивание не будут включены все последовательности. Таким образом, положения в других гомологичных молекулах s-GDH могут быть легко идентифицированы как соответствующие положениям, установленным для s-GDH A. Calcoaceticus в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Вот почему положения аминокислот, приведенные в данном описании, следует понимать как положения аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или как положения, соответствующие им в другой гомологичной молекуле s-GDH.

Обнаружено, что мутанты s-GDH, содержащие аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 348, в комбинации с инсерцией аминокислоты между положениями 428 и 429 в s-GDH, проявляют удивительный позитивный эффект в отношении специфичности к глюкозе. Как показано в таблице, было идентифицировано и создано множество вариантов s-GDH с повышенной специфичностью по отношению к глюкозе. Повышение специфичности к глюкозе в случае варианта s-GDH наблюдается при условии, что аминокислота в положении треонина 348 заменена другой подходящей аминокислотой и подходящая аминокислота встроена между положениями 428 и 429. Поэтому очень предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к варианту белка PQQ-зависимой s-GDH, содержащему инсерцию между аминокислотами 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и дополнительно содержащему замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 348.

Также обнаружено, что дополнительные замены в положении аминокислот, соответствующем положениям 169, 171, 245, 341, 349 и/или 428 последовательности SEQ ID NO: 2, являются полезными при попытках дополнительно повысить специфичность по отношению к глюкозе варианта s-GDH, содержащего инсерцию между аминокислотами 428 и 429 и замену аминокислотного остатка в положении 348.

В данной области известно, что ни остаток треонина в положении 348, ни инсерция аминокислоты между положениями 428 и 429 s-GDH, которая выделена из штамма типа Acinetobacter calcoaceticus LMD 79.41, не вносят вклада в связывание субстрата молекулой s-GDH (Oubrie, A., et al., Embo J. 18 (1999) 5187-5194; Oubrie, A. и Dijkstra, B. W., Protein Sci. 9 (2000) 1265-1273). Не имеется ни химического, ни физического объяснения, почему указанные две модификации s-GDH особенно повышают субстратную специфичность по отношению к глюкозе по сравнению с другими представляющими интерес молекулами сахаров, особенно по сравнению с мальтозой.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH отличается тем, что аминокислотный остаток треонина в положении 348 заменен аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из аланина, глицина и серина. В более предпочтительном варианте используют глицин для замены треонина в положении 348. Терминология T348G известна специалисту в данной области и указывает, что треонин в положении 348 заменен глицином.

Дополнительным предпочтительным вариантом осуществления изобретения является вариант растворимой формы EC 1.1.99.17, так же известной, как PQQ-зависимая растворимая глюкозодегидрогеназа (s-GDH), при этом указанный вариант содержит по меньшей мере одну инсерцию аминокислотного остатка между положениями аминокислот, соответствующими положениям 428 и 429 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), и по меньшей мере одну замену аминокислотного остатка в положении аминокислоты, соответствующем положению 428. Предпочтительно замену аспарагина в положении 428 осуществляют лейцином, пролином и валином. Более предпочтительной заменой в положении 428 является пролин.

Одна группа предпочтительных вариантов s-GDH по данному изобретению содержит замену аминокислотного остатка в положении 348 и/или замену аминокислоты в положении 428 и инсерцию аминокислоты между положениями 428 и 429. Указанные варианты необязательно могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали одну или несколько аминокислотных замен в положениях аминокислот, соответствующих положениям 169, 171, 245, 341 и/или 349 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 169 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота лейцин была заменена фенилаланином, тирозином или триптофаном. Более предпочтительно замену в положении 169 осуществляют фенилаланином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 171 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота тирозин была заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аланина, метионина, глицина. Более предпочтительно замену в положении 171 осуществляют глицином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 245 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота глутаминовая кислота была заменена аспарагиновой кислотой, аспарагином или глутамином. Более предпочтительно замену в положении 245 осуществляют аспарагиновой кислотой.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 341 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота метионин была заменена валином, аланином, лейцином или изолейцином. Более предпочтительно замену в положении 341 осуществляют валином.

В том случае, когда аминокислоту, соответствующую положению 349 последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2), заменяют в варианте согласно настоящему изобретению, предпочтительно, чтобы встречающаяся в природе аминокислота валин была заменена аланином, глицином. Более предпочтительно замену в положении 349 осуществляют аланином.

Как описано в WO 02/34919, замену аминокислоты в положении 348 последовательности s-GDH, соответствующей последовательности дикого типа, выделенной из A. calcoaceticus, можно использовать для существенного повышения специфичности s-GDH к глюкозе. Специалист в данной области найдет в WO 02/34919 другие подходящие положения, которые можно заменять и комбинировать с инсерцией согласно настоящему изобретению.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH согласно настоящему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере две аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют положениям аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вариант s-GDH согласно настоящему изобретению дополнительно к инсерции между аминокислотными остатками 428 и 429 содержит по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из группы, состоящей из положений 171, 245, 341, 348 и 349, которые соответствуют положениям аминокислот в последовательности s-GDH дикого типа, известной для A. calcoaceticus (SEQ ID NO: 2).

Как будет понятно специалисту в данной области, можно осуществить аминокислотные замены, например, молчащие мутации, которые не влияют на свойства s-GDH в значимой степени. Однако вариант согласно настоящему изобретению будет иметь не более 45 изменений аминокислот по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2. Предпочтительно вариант будет содержать 20 или меньше аминокислотных замен, более предпочтительно будут присутствовать только 10 аминокислотных замен или меньше замен.

Варианты s-GDH согласно настоящему изобретению приведены в разделе «Примеры». Указанные варианты также представляют собой предпочтительные варианты осуществления изобретения. Варианты, в случае которых существует меньше всего взаимовлияний при определении глюкозы, обнаруженные до настоящего времени, содержат инсерцию между аминокислотами 428 и 429, предпочтительно пролина, и мутации Y171G, E245D, M341V и T348G или мутации L169F, Y171G, E245D, M341V и T348G, соответственно. Указанные два варианта также являются дополнительными предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.

Анализ аминокислотной последовательности показал, что мотивы последовательности, обнаруженные в s-GDH дикого типа из A. Calcoaceticus, с одной стороны, и A. Baumannii, с другой стороны, по-видимому, являются высоко консервативными вблизи положений, особенно важных для повышения специфичности по отношению к глюкозе, которые идентифицированы в настоящем изобретении, т.е. сайт инсерции вблизи положений 428 и 429, которые соответствуют s-GDH дикого типа из A. calcoaceticus.

Вариант PQQ-зависимой s-GDH, содержащий аминокислотную последовательность AGNXaaVQK (SEQ ID NO: 2), представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Последовательность SEQ ID NO: 2 соответствует положениям 426-431 s-GDH дикого типа A. calcoaceticus или положениям 427-432 s-GDH дикого типа A. baumannii, но содержит инсерцию одной аминокислоты (Xaa) между положениями 428 и 429 (A. calcoaceticus) или между 429 и 430 (A. baumannii), соответственно.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к варианту s-GDH, содержащему последовательность G-N-Xaa-V-Q-K-D (SEQ ID NO: 11). Предпочтительно вариант s-GDH, содержащий последовательность SEQ ID NO: 11, дополнительно отличается тем, что указанная встроенна