Биспецифическое антитело, заменяющее функциональные белки

Биспецифическое антитело, заменяющее функциональные белки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, которые функционально используют вместо кофакторов, усиливающих ферментативную реакцию, и фармацевтическим композициям, содержащим это антитело в качестве действующего ингредиента.

Предшествующий уровень техники

Антителам в качестве лекарственного средства уделяют много внимания благодаря их высокой стабильности в крови и низкой антигенности. Среди них - биспецифические антитела, которые могут одновременно распознавать два типа антигенов. За последнее время были предложены биспецифические антитела; однако сообщалось только об антителах, которые просто связывают два типа антигенов, например, такие, которые переносят NK-клетки, макрофаги и Т-клетки (см. непатентный документ 7). Например, MDX-210, в настоящее время проходящее клиническое испытание, представляет собой биспецифическое антитело, которое просто перенацеливается на FcγRI-экспрессирующие моноциты, а также на раковые клетки, экспрессирующие HER-2/neu. Таким образом, до сих пор не было примеров применения биспецифического антитела в качестве альтернативного средства для функционального замещения кофактора, который усиливает ферментативную реакцию.

Примерами кофакторов являются тканевой фактор (TF), фактор свертывания крови V (F.V), активированный фактор свертывания крови V (F.Va), фактор свертывания крови VIII (F.VIII), активированный фактор свертывания крови VIII (F.VIIIa), тромбомодулин (ТМ), белок S (PS), белок Z (PZ), гепарин, комплемент С4b, регуляторный фактор Н системы комплемента, мембранный кофакторный белок (МСР) и рецептор комплемента 1 (CR1).

Из числа вышеперечисленного F.VIII/F.VIIIa представляет собой кофактор, необходимый для достаточно эффективной экспрессии активированного фактора свертывания крови IX (F.IXa). Scheiflinger F. et al. в результате хромогенного исследования выявили, что определенное анти-F.IX/F.IXa антитело действует, способствуя активированию фактора свертывания крови Х (F.X) посредством F.IXa (патентный документ 1). Однако в исследовании способности к восстановлению коагуляции плазмы с дефицитом фактора F.VIII способность восстановления коагуляции наблюдали только при добавлении внешнего фактора F.IXa, но не в случае использования одного только антитела.

Для фактора F.VIIIa известно, что он взаимодействует не только с фактором F.IXa, но также и с F.X (см. непатентные документы 5 и 6). В этом отношении антитело, описанное Scheiflinger F. et al., не может быть названо как достаточно эффективное при использовании вместо функции F.VIII/F.VIIIa, и его активность также представляется недостаточной.

В результате специализированного научного исследования авторы настоящего изобретения преуспели в получении биспецифических антител, функционально замещающих кофакторы, которые усиливают ферментативную активность, и таким образом осуществили данное изобретение.

[Патентный документ 1] WO 01/19992

[Патентный документ 2] Патент США № 4474893

[Патентный документ 3] EP 404097

[Патентный документ 4] WO 93/11161

[Патентный документ 5] Японская патентная заявка № 2002-112369

[Патентный документ 6] Японская патентная заявка № 2003-012648

[Патентный документ 7] Японская патентная заявка Kokai Publication № (JP-A) H5-304992 (не рассмотренная, опубликованная Японская патентная заявка)

[Патентный документ 8] JP-A H2-145187

[Патентный документ 9] JP-A H5-213775

[Патентный документ 10] JP-A H10-165184

[Патентный документ 11] JP-A H11-71288

[Патентный документ 12] JP-A 2002-518041

[Патентный документ 13] JP-A H11-506310

[Патентный документ 14] JP-A H5-199894

[Патентный документ 15] JP-A H10-511085

[Патентный документ 16] JP-A H5-184383

[Непатентный документ 1] Nilsson IM et al., "J. Intern. Med." 1992, Vol.235, p.25-32

[Непатентный документ 2] Lofqvist T et al., "J. Intern. Med" 1997, Vol.241, p.395-400 (фамилия Lofqvist написана с двумя точками над гласной «о»)

[Непатентный документ 3] 24^th Meeting of The Japanese Society on Thrombosis and Hematosis, Special Committee on Examining Hemophilia Standardization, Mini-symposium, 2001, http://www.jsth.org

[Непатентный документ 4] Medical Bulletin #193 1994

[Непатентный документ 5] Mertens K et al., "Thromb. Haemost." 1999, Vol.82, p.209-217

[Непатентный документ 6] Lapan KA et al., "Thromb. Haemost." 1998, Vol.80, p.418-422

[Непатентный документ 7] Segal DM et al., "Journal of Immunological Methods" 2001, Vol.248, p.1-6

[Непатентный документ 8] Bos R and Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma" 1992, Vol.11, № 1, p.41-51

[Непатентный документ 9] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, № 1708, p.81-3

[Непатентный документ 10] Karpovsky B et al., "J. Exp. Med." 1984, Vol.160, № 6, p.1686-701

[Непатентный документ 11] Suresh MR et al., "Methods Enzymol." 1986, Vol.121, p.210-28

[Непатентный документ 12] Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods" 1997, Vol.201, p.57-66

[Непатентный документ 13] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, p.81

[Непатентный документ 14] Shalaby MR et al., "J. Exp. Med." 1992, Vol.175, p.217-25

[Непатентный документ 15] Holliner P et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1993, Vol.90, p.6444-8

[Непатентный документ 16] Ridgway JB et al., "Protein Eng." 1996, Vol.9, p.617-21

[Непатентный документ 17] Hammerling U et al., "J. Exp. Med." 1968, Vol.128, p.1461-73

[Непатентный документ 18] Kurokawa T et al., "Bio/Technology" 1989, Vol.7, p.1163

[Непатентный документ 19] Link BK et al., "Blood" 1993, Vol.81, p.3343

[Непатентный документ 20] Nitta T et al., "Lancet" 1990, Vol.335, p.368-71

[Непатентный документ 21] deLeij L et al., "Foundation Nationale de Transfusion Sanguine, Les Ulis France" 1990, p.249-53

[Непатентный документ 22] Le Doussal JM et al., "J. Nucl. Med." 1993, Vol.34, p.1662-71

[Непатентный документ 23] Stickney DR et al., "Cancer Res." 1991, Vol.51, p.6650-5

[Непатентный документ 24] Weiner LM et al., "Cancer Res." 1993, Vol.53, p.94-100

[Непатентный документ 25] Kroesen BJ et al., "Br. J. Cancer" 1994, Vol.70, p.652-61

[Непатентный документ 26] Weiner GJ et al., "J. Immunol." 1994, Vol.152, p.2385

[Непатентный документ 27] Suresh MR et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1986, Vol.83, p.7989-93

[Непатентный документ 28] Milstein C and Cuello AC, "Nature" 1983, Vol.305, p.537

[Непатентный документ 29] Xiang J et al., "Mol. Immunol." 1990, Vol.27, p.809

[Непатентный документ 30] Bebbington CR et al., "Bio/Technology" 1992, Vol.10, p.169

[Непатентный документ 31] Huse WD et al., "Science" 1989, Vol.246, p.1275

[Непатентный документ 32] McCafferty J et al., "Nature" 1990, Vol.348, p.552

[Непатентный документ 33] Kang AS et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1991, Vol.88, p.4363

Изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение биспецифических антител, функционально замещающих кофакторы, которые усиливают ферментативную реакцию.

В результате специализированного научного исследования авторы настоящего изобретения преуспели в изобретении биспецифических антител, которые, в частности, связывают и F.IX/F.IXa, и F.X, и функционально замещают кофактор F.VIIIa (то есть действие способствует активации F.X под действием F.IXa). Значит, авторы настоящего изобретения преуспели в получении биспецифических антител, которые распознают и фермент, и его субстрат и функционально замещают кофакторы фермента.

Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, которые функционально применяют вместо кофакторов, которые усиливают ферментативную реакцию, и, более конкретно, к:

[1] Антителу, распознающему и фермент, и его субстрат, где указанное антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое функционально применяют вместо кофактора, который усиливает ферментативную реакцию.

[2] Антителу по п.[1], где указанный фермент является протеолитическим ферментом.

[3] Антителу по п.[2], где указанные протеолитический фермент, субстрат и кофактор представляют собой факторы, ассоциированные со свертыванием/фибринолизом крови.

[4] Антителу по п.[3], где фермент фактора, ассоциированного со свертыванием/фибринолизом крови, представляет собой фактор свертывания крови IX и/или активированный фактор свертывания крови IX; субстрат представляет собой фактор свертывания крови X; и кофактор представляет собой фактор свертывания крови VIII и/или активированный фактор свертывания крови VIII.

[5] Антителу по п.п.[1]-[4], где указанное антитело включает в себя гипервариабельный участок, включающий в себя аминокислотную последовательность CDR3 антитела против фактора свертывания крови IX/IXa следующих пунктов (а1) или (а2), или гипервариабельный участок, функционально эквивалентный этому, и гипервариабельный участок, включающий в себя аминокислотную последовательность CDR3 антитела против фактора свертывания крови X, описанную в одном из следующих пунктов (b1)-(b9), или гипервариабельный участок, функционально эквивалентный этому:

(а1) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:16;

(а2) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:20;

(b1) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:24;

(b2) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:28;

(b3) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:32;

(b4) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:36;

(b5) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:40;

(b6) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:44;

(b7) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:48;

(b8) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:52;

(b9) аминокислотная последовательность CDR3 Н-цепи, описанная в SEQ ID NO:56.

[6] Антителу по п.п.[1]-[4], где указанное антитело включает в себя гипервариабельный участок, включающий в себя аминокислотную последовательность CDR антитела против фактора свертывания крови IX/IXa согласно следующим п.п.(а1) или (а2), или гипервариабельный участок, функционально эквивалентный этому, и гипервариабельный участок, включающий в себя аминокислотную последовательность CDR антитела против фактора свертывания крови X, описанную в одном из следующих пунктов (b1)-(b9), или гипервариабельный участок, функционально эквивалентный этому:

(a1) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:14, 15 и 16, соответственно;

(a2) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:18, 19 и 20, соответственно;

(b1) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:22, 23 и 24, соответственно;

(b2) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:26, 27 и 28, соответственно;

(b3) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:30, 31 и 32, соответственно;

(b4) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:34, 35 и 36, соответственно;

(b5) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:38, 39 и 40, соответственно;

(b6) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:42, 43 и 44, соответственно;

(b7) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:46, 47 и 48, соответственно;

(b8) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:50, 51 и 52, соответственно;

(b9) аминокислотные последовательности CDR 1, 2, и 3 Н-цепи, описанные в SEQ ID NO:54, 55 и 56, соответственно.

[7] Композиции, включающей в себя антитело по любому из п.п.[1]-[6] и фармацевтически подходящий носитель.

[8] Композиции по п.[7], где указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию, используемую для профилактики и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением.

[9] Композиции по п.[8], где кровотечение, заболевание, сопровождающееся кровотечением, или заболевание, вызванное кровотечением, представляет собой заболевание, которое возникает и/или прогрессирует в результате снижения активности или дефицита фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII.

[10] Композиции по п.[9], где заболевание, которое возникает и/или прогрессирует в результате снижения активности или дефицита фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой гемофилию А.

[11] Композиции по п.[9], где заболевание, которое возникает и/или прогрессирует в результате снижения активности или дефицита фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой заболевание, при котором вырабатывается ингибитор фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII.

[12] Композиции по п.[9], где заболевание, которое возникает и/или прогрессирует в результате снижения активности или дефицита фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой приобретенную гемофилию.

[13] Композиции по п.[9], где заболевание, которое возникает и/или прогрессирует в результате снижения активности или дефицита фактора свертывания крови VIII и/или активированного фактора свертывания крови VIII, представляет собой болезнь Виллебранда-Юргенса.

[14] Способу профилактики и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением, где указанный способ включает в себя стадию введения антитела по любому из п.п.[1]-[6] или композиции по любому из п.п.[7]-[13].

[15] Применению антитела по любому из п.п.[1]-[6] для получения композиции по любому из п.п.[7]-[13].

[16] Набору, используемому в способе профилактики и/или лечения заболеваний по п.[14], где указанный набор включает в себя по меньшей мере антитело по любому из п.п.[1]-[6] или композицию по п.[7].

[17] Способу профилактики и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением или заболевания, вызванного кровотечением, где указанный способ включает в себя стадию введения антитела по любому из п.п.[4]-[6] или композиции по любому из п.п.[7]-[13] в комбинации с фактором свертывания крови VIII.

[18] Набору, используемому в способе профилактики и/или лечения кровотечения, заболевания, сопровождающегося кровотечением, или заболевания, вызванного кровотечением, по п.[17], где указанный набор включает в себя по меньшей мере антитело по любому из п.п.[4]-[6] или композицию по п.[7] и фактор свертывания крови VIII.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 изображена область вставки pcDNA4-g4H.

На фиг.2 изображены области вставок pcDNA4-g4L и pIND-g4L.

На фиг.3 изображена область вставки pIND-g4H.

На фиг.4 отображены результаты измерения F.VIIIa-подобного действия анти-F.IXa/анти-F.X биспецифического антитела, генерированного из анти-F.IXa антитела XB12 и анти-F.X антитела SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06, или SB34. Концентрация растворов антител составляла 10 мкг/мл (конечная концентрация 1 мкг/мл). Результатом являются девять типов биспецифических антител, которые показывают повышение F.VIIIa-подобной активности: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 и XB12/SB34, в порядке интенсивности действия.

На фиг.5 отображены результаты измерения F.VIIIa-подобной активности анти-F.IXa/анти-F.X биспецифического антитела, генерированного из анти-F.IXa антитела XT04 и анти-F.X антитела SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 или SB34. Концентрация растворов антител составляла 10 мкг/мл (конечная концентрация 1 мкг/мл). В результате XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 и XT04/SB34 показывали повышение F.VIIIa-подобной активности.

На фиг.6 отображены результаты измерения F.VIIIa-подобной активности различных концентраций XB12/SB04, для которого на фиг.4 продемонстрирована наивысшая активность. В результате для XB12/SB04 показано зависимое от концентрации повышение F.VIIIa-подобной активности.

На фиг.7 отображены результаты измерения время свертывания плазмы (APTT) в присутствии XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 или XB12/SB34. Концентрация растворов антитела, смешанных с плазмой с дефицитом фактора F.VIII, составляла 1,7 мкг/мл для XB12/SB06 и 10 мкг/мл для остальных антител. В результате для XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 и XB12/SB34 показан эффект укорочения времени свертывания по сравнению с отсутствием антител.

На фиг.8 отображены результаты измерения времени коагуляции плазмы (APTT) в присутствии XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 и XT04/SB34. Концентрация растворов антител, смешанных с плазмой с дефицитом фактора F.VIII, составляла 5 мкг/мл для XT04/SB06 и 10 мкг/мл для остальных. В результате для XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05 и XT04/SB06 показан эффект укорочения времени коагуляции по сравнению с отсутствием антител. Для XT04/SB34 не выявлен эффект укорочения времени коагуляции.

На фиг.9 отображены результаты измерения времени коагуляции в присутствии различных концентраций XB12/SB04, для которого на фиг.7 и 8 показан наибольший эффект укорочения времени коагуляции (APTT). В результате для XB12/SB04 продемонстрирован зависимый от концентрации эффект укорочения времени коагуляции. Концентрация антитела на фигуре демонстрирует значения для раствора антитела, смешанного с плазмой с дефицитом фактора F.VIII.

На фиг.10 отображены результаты GST-AP вестерн-блоттинга антител SB04 или SB06, где 1), 2) и 3) представляют собой результаты реагирования считанного GST-AP с SB04, SB06 и образцом, не содержащим антитело, соответственно. Результаты свидетельствуют об обнаружении только реакции связывания SB04 с GST-AP.

На фиг.11 изображен вектор pELBGlacI. ColE1ori: область начала репликации ColE1 плазмидного ряда; f1ori: область начала репликации фага f1; lacI: кодирующая область лактозного репрессорного белка; P_lac: лактозный промотор; pelBss: сигнальная последовательность белка PelB E. coli; scFv: кодирующая область одноцепочечной молекулы антитела; ген III (ген3): кодирующая область белка гена III фага f1; Amp^r: ген устойчивости к ампициллину; и Sfi I: участок расщепления ферментом рестрикции Sfi I.

На фиг.12 отображены результаты измерения F.VIIIa-подобной активности с использованием культуральных супернатантов экспрессированных биспецифических антител, которые представляют собой комбинации анти-F.IXa антитела (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 или XB12) и анти-F.X антитела (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 или SB27). Знаком "+" обозначены случаи, где F.VIIIa-подобная активность равна 0,1 или более.

На фиг.13 отображены результаты анализа коагулирующей активности плазмы, выполненного с использованием очищенных препаратов экспрессированных биспецифических антител, которые представляют собой комбинацию анти-F.IXa антитела (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 или XB12) и анти-F.X антитела (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 или SB27). Время свертывания крови укорачивалось на 10-20 секунд ("+"), 20-40 секунд ("++"), 40-50 секунд ("+++") или 50 секунд ("++++") или более при добавлении антитела по сравнению с отсутствием антител.

На фиг.14 отображены результаты измерения времени коагуляции при различных концентрациях A44/B26, имеющего наибольший эффект укорочения времени коагуляции (APTT), что показано на фиг.13. Без добавления антитела время коагуляции составляло 113 секунд. В результате для A44/B26 продемонстрирован зависимый от концентрации эффект укорочения времени коагуляции. Концентрация антитела на фигуре демонстрирует значения для раствора антитела, смешанного с плазмой с дефицитом фактора F.VIII.

На фиг.15 отображены результаты измерения времени коагуляции при различных концентрациях A69/B26, имеющего наибольший эффект укорочения времени коагуляции (APTT), что показано на фиг.13. Без добавления антитела время коагуляции составляло 109,6 секунд. В результате для A69/B26 продемонстрирован зависимый от концентрации эффект укорочения времени коагуляции. Концентрация антитела на фигуре демонстрирует значения для раствора антитела, смешанного с плазмой с дефицитом фактора F.VIII.

На фиг.16 отображены результаты измерения времени коагуляции (APTT) при совместном присутствии A44/B26 или XB12/SB04 с фактором F.VIII. В результате при сравнении с одиночным фактором F.VIII для смешанного раствора A44/B26 или XB12/SB04 с фактором F.VIII показан эффект укорочения времени коагуляции.

На фиг.17 отображены результаты измерения времени коагуляции (APTT) в ингибирующей плазме в присутствии A44/B26 или XB12/SB04. В результате по сравнению с отсутствием антител при наличии A44/B26 или XB12/SB04 продемонстрирован эффект укорочения времени коагуляции.

На фиг.18 отображены результаты измерения времени коагуляции при различных концентрациях XB12/SB04 и гуманизированного XB12/гуманизированного SB04. Без добавления антитела время коагуляции составляло 111,3 секунд. В результате измерения для гуманизированного XB12/гуманизированного SB04 антитела выявлен эффект укорочения времени коагуляции, сходный с таковым для XB12/SB04. Концентрация антитела на фигуре демонстрирует значения для раствора антитела, смешанного с плазмой с дефицитом фактора F.VIII.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Биспецифическое антитело по настоящему изобретению представляет собой молекулу, содержащую в себе два типа антител или фрагменты антител, имеющие специфичность для различных антигенов. Биспецифическое антитело, особым образом не ограничено, но предпочтительно является моноклональным.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению являются предпочтительно рекомбинантными антителами, созданными с применением технологий рекомбинантных генов (см., например, Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Рекомбинантное антитело может быть получено в результате клонирования ДНК, кодирующей антитело, выделенной из клеток, продуцирующих антитело, как, например, гибридомы или сенсибилизированные лимфоциты, встраивания ДНК в соответствующий вектор и введения вектора в организм-хозяина для продукции антитела.

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут быть фрагментами антител или модифицированными антителами. Фрагменты антител включают в себя диатело (Db), линейное антитело, молекулы одноцепочечного антитела (далее также называемое scFv) и тому подобное. В этом документе фрагмент "Fv" означает наименьший фрагмент антитела, включающий в себя полностью сайт распознавания антигена и сайт связывания. Фрагмент "Fv" представляет собой димер (димер V_H-V_L), в котором вариабельная область (V_H) тяжелой цепи (H) и вариабельная область (V_L) легкой цепи (L) являются прочно связанными посредством нековалентной связи. Три гипервариабельных участка (CDRs) каждой вариабельной области взаимодействуют для образования рецепторной зоны на поверхности димера V_H-V_L. Шесть CDRs образуют рецепторную зону антитела. Однако даже одна вариабельная область (или половина Fv, которая содержит только три антиген-специфических CDR) способна распознавать антиген и связывать его, хотя ее аффинность ниже, чем аффинность цельной рецепторной зоны.

Кроме того, фрагмент Fab (также обозначаемый как (F(ab)) дополнительно содержит константную область L-цепи и константную область H-цепи (CH1). Фрагмент Fab' отличается от фрагмента Fab тем, что содержит несколько дополнительных остатков, полученных из карбоксильного конца СН1 области Н-цепи, которые включают в себя один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Фрагмент Fab'-SH относится к фрагменту Fab', имеющему свободную тиоловую группу в одном или нескольких остатках цистеина констатной области. Фрагменты F(ab') получают расщеплением дисульфидной связи в остатках цистеина в шарнирнирном участке F(ab')₂ пепсинового гидролизата. Прочие химически связанные фрагменты антитела также известны специалисту в области уровня техники.

Диатело означает фрагмент полного антитела, полученный в результате слияния генов (Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161 и т.д.). Диатело представляет собой димер, включающий в себя две пептидные цепи; в каждой полипептидной цепи вариабельная область (V_L) L-цепи соединена с вариабельной областью (V_H) Н-цепи той же полипептидной цепи с помощью линкера, который является слишком коротким для того, чтобы допустить спаривание между двумя областями (например, около 5 остатков). V_L и V_H,кодируемые на одной цепи полипептида, образуют димер, потому что они не могут образовать одноцепочечный фрагмент вариабельной области из-за наличия между ними короткого линкера. Таким образом, диатело оканчивается двумя рецепторными зонами.

Одноцепочечное антитело, или фрагмент scFv, содержит V_H и V_L области антитела, и эти области находятся на одиночной полипептидной цепи. В целом, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между областями V_H и V_L, так что фрагмент scFv способен формировать структуру, необходимую для связывания антигена (см. Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol.113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994 для общих сведений по scFv). Линкеры по настоящему изобретению специальным образом не ограничены, поскольку они не ингибируют экспрессию вариабельных областей антитела, связанных с обоими концами линкера.

Биспецифическое антитело типа IgG может быть синтезировано межвидовой гибридомой (квадрогибридома), образуемой в результате слияния двух типов гибридом, которые продуцируют антитела типа IgG (Milstein C et al., Nature 1983, 305:537-540). Такое антитело также может быть синтезировано в результате введения для совместной экспрессии в клетки генов L-цепей и H-цепей, которые образуют два типа представляющих интерес IgG (всего четыре вида генов).

Однако теоретически в иммуноглобулинах G, полученных таким способом, существуют не менее десяти комбинаций H-цепей и L-цепей. Трудно очистить IgG, содержащий желаемую комбинацию H и L-цепей, от десяти различных типов IgG. Кроме того, теоретически объем представляющей интерес комбинации резко снижен, и, таким образом, необходимо использовать крупномасштабную клеточную культуру, что приводит к дополнительному увеличению себестоимости способа получения.

В этом случае в результате соответствующей замены аминокислоты (аминокислот) в области CH3 H-цепи возможно избирательно синтезировать IgG, которые имеют гетерологичную комбинацию H-цепей (Ridgway, JB et al. Protein Engineering 1996, 9:617-621, Merchant, AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16:677-681).

Что касается L-цепей, то вариабельная область L-цепи по сравнению с вариабельной областью Н-цепи является менее разнообразной; следовательно, можно рассчитывать на получение общей L-цепи, что обеспечивает связывающие активности с двумя H-цепями. Эффективная экспрессия биспецифического IgG становится возможной в результате введения генов этой общей L-цепи и обеих Н-цепей в клетки для экспрессии IgG (Nature Biotechnology. 1998, 16, 677-681). Однако возможность того, что два типа антитела, выбранные случайным образом, будут содержать одну и ту же L-цепь, является низкой; следовательно, сложно осуществить вышеупомянутый способ на практике. В связи с этим был предложен способ выбора общей L-цепи, адаптирующий любые различные Н-цепи к проявлению высокой связывающей активности (WO 2004/065611). Н-цепь, имеющая ранее описанный вариант CH3 (Nature Biotechnology. 1998, 16, 677-681), исключительно редко секретируется в отсутствие другой Н-цепи. Используя эту особенность для стимулирования первой экспрессии правого плеча L-цепи и H-цепи и остановки экспрессии, а затем для стимулирования экспрессии левого плеча L-цепи и H-цепи, можно увеличить пропорцию экспрессированных IgG в представляющей интерес комбинации (PCT/JP2004/008585).

Биспецифическое антитело также может быть получено посредством использования химически сшитых Fab'. Биспецифический F(ab')₂ может быть получен, например, посредством малеимидирования Fab', полученного из одного антитела вместе с o-PDM (орто-фениленди-малеимид), и взаимодействия продукта с Fab', полученным из другого антитела, чтобы сшитые Fab' происходили из разных антител (Keler T et al. Cancer Research 1997, 57:4008-4014). Кроме того, также известен способ химического соединения фрагментов антител, как, например, производных Fab'-тионитробензойной кислоты (TNB) и Fab'-тиола (SH) (Brennan M et al. Science. 1985, 229:81-83).

Вместо перекрестной сшивки можно использовать лейциновые застежки, полученные из Fos и Jun или вроде этого. Хотя Fos и Jun также образуют гомодимер, предпочтительно используют их гетеродимерное образование. Для получения экспрессировали Fab', соединенный с Fos лейциновыми застежками, и второй Fab', соединенный с Jun лейциновыми застежками. Посредством смешивания и взаимодействия мономерных Fab'-Fos и Fab'-Jun, преобразованных при мягких условиях, можно сформировать биспецифический F(ab')₂ (Kostelny SA et al. J. of Immunology, 1992, 148:1547-53). Этот способ не ограничивается Fab' и также может быть применен с scFv, Fv и прочим.

Биспецифическое антитело также может быть получено в виде диатела. Биспецифическое диатело представляет собой гетеродимер, включающий в себя два перекрестных фрагмента scFv. Значит, биспецифическое диатело может быть получено посредством построения гетеродимера с использованием V_H(A)-V_L(B) и V_H(B)-V_L(A), которые образованы посредством соединения V_H и V_L, происходящих из двух типов антител: A и B, с относительно коротким линкером, длиной приблизительно 5 аминокислотных остатков (Holliger P et al. Proc. of the National Academy of Sciences of the USA. 1993, 90:6444-6448).

В этом случае конструирование представляющего интерес биспецифического диатела может быть простимулировано посредством осуществления соответствующих аминокислотных замен («ключ-замок»: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6:781-788), для того, чтобы соединить два типа scFv с гибким и относительно длинным линкером, продолжительностью около 15 аминокислотных остатков (одноцепочечное диатело: Kipriyanov SM et al. J. of Molecular Biology. 1999, 293:41-56).

sc(Fv)₂, который может быть получен посредством соединения двух типов scFv с гибким и относительно длинным линкером, продолжительностью около 15 аминокислотных остатков, также может стать биспецифическим антителом (Mallender WD et al. J. of Biological Chemistry, 1994, 269:199-206).

Модифицированное антитело может представлять собой, например, антитело, которое связывает разные молекулы, как, например, полиэтиленгликоль (PEG). Для модифицированных антител по настоящему изобретению связываемые вещества не ограничены. Такие модифицированные антитела могут быть получены посредством химического изменения полученных антител. Эти способы уже являются общепризнанными в данной области.

Антитела по настоящему изобретению включают в себя человеческие антитела, мышиные антитела, крысиные антитела и тому подобное, без каких-либо ограничений их происхождения, и могут представлять собой генетически измененные антитела, как, например, химерное антитело и гуманизированное антитело.

Способы получения человеческих антител являются известными, и представляющее интерес человеческое антитело может быть получено, например, посредством иммунизирования представляющим интерес антигеном трансгенных животных, имеющих весь спектр генов человеческих антител (см. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).

Генетически модифицированные антитела могут быть получены с помощью известных способов. В частности, например, химерное антитело включает в себя различные вариабельные области H- и L-цепей антитела иммунизированных животных и константные области H- и L-цепей человеческого антитела. Химерное антитело может быть получено посредством сшивки ДНК, кодирующей вариабельную область антитела, полученного от иммунизированных животных, с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, вставки полученной ДНК в экспрессирующий вектор и введения этого рекомбинантного вектора в организм хозяина для выработки антитела.

Гуманизированное антитело представляет собой модифицированное антитело, также обозначаемое как реконструированное человеческое антитело. Гуманизированное антитело сконструировано посредством трансплантации гипервариабельного участка (CDR) антитела, полученного от иммунизированных животных, в CDR человеческого антитела. Общие технологии генной инженерии также являются известными.

В частности, последовательность ДНК, предназначенная для сшивания CDR мышиного антитела с каркасной областью (FR) человеческого антитела, синтезирована посредством ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, имеющих перекрывающиеся участки в их концевых областях. После сшивания полученной ДНК с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, полученную в результате этого ДНК встраивают в вектор экспрессии и вводят в организм хозяина для выработки гуманизированного антитела (см. EP 239400 и WO 96/02576). В качестве FR человеческого антитела, связанного через CDR, выбирают антитело, способное к образованию антигенсвязывающего сайта с соответствующим гипервариабельным участком. При необходимости могут быть заменены аминокислоты каркасной области вариабельного участка антитела, для того чтобы гипервариабельный участок реконструированного человеческого антитела образовал соответствующий антигенсвязывающий центр антитела (Sato K et al, Cancer Research 1993, 53:851-856). Каркасная область может быть заменена на каркасные области, полученные из разнообразных человеческих антител (см. WO 99/51743).

Настоящее изобретение обеспечивает биспецифические антитела, функционально замещающие кофакторы, которые распознают и фермент, и его субстрат.

Кофакторы по настоящему изобретению особым образом не ограничены, при условии, что они способны воздействовать на фермент для усиления ферментативной реакции. Например, кофактор по настоящему изобретению представляет собой кофактор протеолитического фермента. Конкретными примерами кофактора протеолитического фермента являются кофакторы факторов свертывания крови и фибринолиза (F.VIII/F.VIIIa, F.V/F.Va, PZ, TM, система TM/PS), кофакторы реакций комплемента (C4b, MCP, CR1, фактор H) и тому подобные.

Следующие комбинации могут быть перечислены в качестве конкретных примеров фермента и ферментного субстрата, так же как кофакторов фермента.

(а) Кофактор фактора свертывания крови и фибринолиза (Пример 1)

Фермент: F.IXa

Субстрат: F.X

Кофактор: F.VIII/F.VIIIa

Кофактор F.VIIIa присоединяется и к F.IXa и F.X и усиливает активирование F.X посредством F.IXa. Среди биспецифических антител, которые распознают и вышеуказанный фермент F.IXa, и субстрат F.X, некоторые имеют усиливающий эффект на активирование F.X. Предполагают, что некоторые из этих антител оказывают действие, замещающее функцию кофактора F.VIII/F.VIIIa.

(b) Кофактор фактора свертывания крови и фибринолиза (пример 2)

Фермент: ZPI

Субстрат: F.X/F.Xa

Кофактор: PZ

Кофактор PZ связан с ZPI семейства серпина и активированным фактором свертывания крови X (F.Xa), для усиления игибирующего действия ZPI на F.Xa. В частности, некоторые биспецифические антитела распознают и ZPI, и F.X/F.Xa, и предполагается, что они оказывают действие, замещающее функцию PZ.

(c) Кофактор фактора свертывания крови и фибринолиза (пример 3)

Фермент: тромбин

Субстрат: TAFI

Кофактор: TM

Кофактор TM усиливает активирование TAFI посредством тромбина. В частности, некоторые биспецифические антитела, которые распознают и тромбин и TAFI, предположительно оказывают действие, замещающее функцию ТМ.

(d) Кофакторы фактора свертывания крови и фибринолиза (пример 4)

Фермент: тромбин

Субстрат: PC

Кофакторы: TM/PS

Система TM/PS усиливает активирование PC посредством тромбина. В частности, некоторые биспецифические антитела, которые распознают и тромбин, и РС, предположительно функционально замещают систему TM/PS.

(e) Кофактор фактора свертывания крови и фибринолиза (пример 5)

Фермент: F.Xa

Субстрат: протромбин

Кофактор: F.V/F.Va

Кофактор F.Va связывает и F.Xa, и протромбин для усиления активации протромбина посредством F.Xa. Среди биспецифических антител, которые распознают и вышеуказанный фермент F.Xa, и его субстрат протромбин, некоторые имеют усиливающее действие на активацию протромбина. Некоторые из этих антител предположительно имеют функцию, замещающую функцию кофактора F.V/F.Va.

(f) Кофактор реакции комплемента (пример 1)

Фермент: C1s

Субстрат: C2

Кофактор: C4b

C4b имеет стимулирующее действие C1s на расщепление C2. В частности, некоторые биспецифические антитела, которые распознают и C1s, и C2, предположительно функционально замещают C4b.

(g) Кофакторы реакции комплемента (пример 2)

Фермент: Регуляторный фактор I системы комплемента

Субстрат: C3b

Кофакторы: регуляторный фактор Н системы комплемента

Мембранный кофакторный белок (MCP), и

Рецептор комплемента 1 (CR1)

Регуляторные факторы H, MCP и CR1 системы комплемента оказывают стимулирующее действие регуляторного фактора 1 системы комплемента на деградацию C3b. В частности, среди биспецифических антител, которые распознают и регуляторный фактор 1 системы комплемента, и C3b, некоторые предположительно функционально замещают регуляторные факторы H, MCP и CR1 системы комплемента.

Среди вышеуказанных кофакторов, в частности, предпочтителен F.VIII/F.VIIIa. Не смотря на то, что F.VIII/F.VIIIa претерпевает ограниченный протеолиз такими протеолитическими ферментами, как тромбин, пока он имеет активность F.VIII/F.VIIIa, его форма не имеет значения. Более того, варианты F.VIII/F.VIIIa и F.VIII/F.VIIIa, которые были искусственно модифицированы посредством применения методик генной рекомбинации, также относятся к F.VIII/F.VIIIa, до тех пор пока они сохраняют активность кофактора F.VIII/F.VIIIa.

Способы получения биспецифических антител, которые функционально замещают кофакторы по настоя