Способ идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы irs

Способ идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы irs

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Настоящее изобретение относится к способу идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы IRS, а также к выбранным пептидам IRS, содержащим сайты фосфорилирования для PKC-ζ и других сериновых киназ IRS, и к применению этих пептидов для идентификации фармацевтического состава для лечения диабета типа 2.

Инсулин-независимый сахарный диабет (NIDDM) встречается преимущественно у взрослых и характеризуется пониженной чувствительностью тканей, способных к очистке крови от глюкозы. В отличие от инсулин-зависимого сахарного диабета (IDDM, диабета типа I), диабет типа II не характеризуется пониженной секрецией инсулина бэта-клетками поджелудочной железы.

Молекулярный механизм, приводящий к пониженной чувствительности к инсулину или даже резистентности к инсулину, еще не известен, несмотря на усиленные попытки исследователей в Университетах и в фармацевтической промышленности. Недавние исследования прояснили, что в диабете типа II нарушаются пути вторичных мессенджеров, соединяющие активированный инсулиновый рецептор с транслокацией GLUT4 и транспортом глюкозы. Конкретно, у белков субстрата инсулинового рецептора (IRS) множество остатков тирозина фосфорилируется активированным инсулиновым рецептором, рецептором инсулиноподобного фактора роста и JAK1/2 и играют центральную роль в процессе нисходящей передачи сигнала инсулина (1, 2, 3). Фосфотирозиновые мотивы, конкретно в IRS-1 и IRS-2, служат сайтами посадки для ряда адапторных белков, которые обладают гомологией домена Src 2 (SH2), включая Grb2, внутриклеточную РТРазу SHP-2, Nck, Crk и фосфатидилинозитол-3 киназу (PI-3 киназу) (4-6). PI-3 киназа состоит из каталитической 110 кДа субъединицы (p110) и регуляторной 85 кДа субъединицы (p85), содержащей два домена SH2, которые связываются с тирозин-фосфорилированными мотивами pYMXM и pYXXM в белках IRS и индуцируют активацию PI-3 киназы (7). Это приводит к стимуляции дополнительных нисходящих киназ, включая серин/треониновую киназу PKB/Akt (8,9) и атипичные изоформы-ζ и-λ протеинкиназы C (PKC-ζ/λ) (10, 11) фосфоинозитид-зависимой киназой 1. Показано, что активация PKB и PKC-ζ/λ и их нисходящих сигналов играет важную роль в обеспечении метаболических действий инсулина таких, как транслокация GLUT4 и транспорт глюкозы (10, 11), фосфорилирование серина GSK3 и синтез гликогена (12), фосфорилирование серина PDE и антилиполиз (13, 14) и активация mTOR и синтез белков (15, 16).

Дисрегуляция сигнальной системы инсулина представляет собой многофакторный процесс, приводящий к резистентности к инсулину и диабету типа 2 с белками IRS, потенциально представляющими основную мишень (17). Таким образом, было предположено, что фосфорилирование серин/треониновых белков IRS играет ключевую роль как в ингибировании сигнала инсулина по принципу обратной связи, так и в развитии клеточной резистентности к инсулину (обзор см. в 17-19). Показано, что ковалентная модификация IRS-1 на серине/треонине ухудшает индуцированные инсулином фосфорилирование тирозина, активацию PI 3-киназы и стимуляцию транспорта глюкозы (20). В нестимулированном состоянии фосфорилирование серина/треонина IRS-1 происходит в клетке конститутивно (21), и оно дополнительно активируется цитокинами и метаболитами, которые ингибируют трансдукцию сигналов таких, как фактор некроза опухоли (TNF)α (22), свободные жирные кислоты, глюкоза или церамид (23). Кроме того, на остатках серина/треонина обычно обнаруживают гиперфосфорилирование IRS-1 при резистентности к инсулину и диабете типа 2 (24).

Несмотря на ключевую роль в развитии резистентности к инсулину, фосфорилирование серина IRS-1 остается не до конца понятным, главным образом, в силу того, что IRS-1 содержит более 100 потенциальных сайтов фосфорилирования серина и того, что, как показано, представляет субстрат для многих протеинкиназ, включая N-концевую киназу c-Jun (JNK) (25), IkappaB киназу-β (26), MAP-киназу (27), киназу казеина (28), киназу гликогенсинтазы (29), фосфоинозитол-3-киназу (30), протеинкиназу А (31), протеинкиназу C (32), протеинкиназу B (PKB) (33) и АМФ-активируемую протеинкиназу (AMPK) (34). Интересно, что PKB и AMPK, как обнаружено, действуют в качестве положительного регулятора функции IRS-1, что говорит в пользу представления о том, что серин/треониновое фосфорилирование IRS-1 играет двойную роль либо усиления, либо прекращения передачи сигнала инсулина (35). Идентификация остатков в различных доменах IRS-1, претерпевающих фосфорилирование серина в ответ на различные стимулы, улучшила понимание этого чрезвычайно сложного регуляторного этапа в действии инсулина. Таким образом, Ser³⁰⁷, расположенный вблизи фосфотирозин-связывающего домена (PTB), идентифицировали как мишень для киназ, активизируемых при стрессе, включая JNK (25), и может также играть роль в качестве регулятора действия инсулина с отрицательной обратной связью (36). Ser⁷⁸⁹ является мишенью для AMPK и положительно модулирует действие инсулина (34), однако также было обнаружено, что фосфорилирование Ser⁷⁸⁹ неидентифицированными киназами ослабляет передачу сигнала инсулина (37). Ser⁶¹², Ser⁶³², Ser⁶⁶² и Ser⁷³¹ расположены внутри или вблизи домена взаимодействия с PI 3-киназой, однако, функциональное значение этих сайтов остается неясным (38-40).

В отличие от описанных выше протеинкиназ, протеинкиназа C (PKC)-ζ, которая является атипичным членом семейства PKC серин/треониновых киназ, как представляется, участвует как в нисходящей трансдукции сигнала инсулина, так и в контроле функции IRS-1 с отрицательной обратной связью (11, 41-44). Таким образом, было обнаружено, что PKC-ζ локализуется совместно с GLUT4 и является существенным для регулируемых инсулином транслокации GLUT4 и транспорта глюкозы в скелетной мышце (41) и адипоцитах (11). Дополнительно, дефектная активация PKC-ζ может внести свой вклад в зависимое от ожирения развитие резистентности скелетной мышцы к инсулину (42). Недавние данные Quon и сотрудников (43) показали, что IRS-1 представляет новый субстрат для PKC-ζ, и в параллельном исследовании Zick и сотрудники (44) нашли, что этот процесс ингибирует активацию PI 3-киназы, что говорит о том, что PKC-ζ представляет ключевой элемент в контроле действия инсулина с отрицательной обратной связью.

В общих словах, несмотря на то, что в уровне техники известно, что IRS, особенно IRS-1, взаимодействует с PKC-ζ, природа этого взаимодействия не известна. Следовательно, нет агентов, известных в уровне техники, взаимодействующих с IRS-PKC-ζ. Однако такие агенты были бы весьма полезными, так как вероятно, что торможение взаимодействия IRS и PKC-ζ привело бы к отрицательной регуляции торможения IRS и вниз по пути передачи сигнала, PI 3-киназы, которая в свою очередь приводит к улучшению транслокации GLUT4 и транспорта глюкозы.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение способа идентификации ингибиторов или агонистов протеинкиназы IRS.

В соответствии с настоящим изобретением, данной цели соответствует способ идентификации ингибитора протеинкиназы IRS, предусматривающий этапы:

a) введение PKC-ζ в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора, и

b) измерение степени фосфорилирования сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования.

Настоящее изобретение основано на неожиданной идентификации специфичных сайтов фосфорилирования серина в последовательности IRS, которые специфично узнаются PKC-ζ. Следовательно, в контексте настоящего изобретения был идентифицирован молекулярный механизм, обеспечивающий взаимодействие IRS-PKC-ζ. Кроме того, вероятно, что другие протеинкиназы такие, как c-Jun N-концевая киназа (JNK), IkappaB киназа-β, MAP-киназа, киназа казеина, киназа гликогенсинтазы, фосфоинозитол-3-киназа, протеинкиназа A, протеинкиназа C, протеинкиназа B 8PKB) и АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK), могут узнавать эти сайты фосфорилирования. Поэтому определение сериновых сайтов, фосфорилируемых протеинкиназами, особенно PKC-ζ, обеспечивает идентификацию молекул, препятствующих этому взаимодействию, либо по пути антагонистов, либо по пути агонистов.

В контексте настоящего изобретения, термин "ингибитор протеинкиназы IRS" относится к веществу, которое препятствует взаимодействию между IRS и протеинкиназой, например, PKC-ζ.

В контексте настоящего изобретения, термин "пептид IRS" относится к пептиду, содержащему отрезок, по меньшей мере, из 5, предпочтительно, из 7, предпочтительно, по меньшей мере, из 10 аминокислот IRS. Термин "пептид IRS" подразумевает, что IRS-пептид кроме аминокислотного отрезка, полученного из IRS, может включать дополнительные аминокислоты, которые получены не из IRS.

Все способы в соответствии с изобретением предпочтительно проводят in vitro.

PKC-ζ коммерчески доступна, например от CalBiochem (San Diego, CA, USA). Кроме того, способы выделения PKC-ζ описаны в литературе, процитированной в настоящей заявке.

Последовательности IRS, особенно IRS-1 и IRS-2, различных видов известны в уровне техники. Последовательность IRS-1 крысы представлена как SEQ ID NO: 16.

Способы получения белков и, следовательно, IRS известны в уровне техники и включают, например, экспрессию белка в подходящих клетках из кДНК, или получение путем последовательного добавления аминокислот к начальной аминокислоте (см. Current Protocols, John Wiley & Sons, Inc., New-York).

Кроме того, в уровне техники известны способы получения белковых фрагментов (см. выше) и включают расщепление белка подходящими протеазами, или получения фрагментов нуклеиновой кислоты, кодирующих белковые фрагменты, и последующей экспрессии фрагментов в подходящих клетках.

В уровне техники известны способы получения мутантных белков, например, путем замещения одной или более аминокислот или путем делеции аминокислотного отрезка (см. выше). Эти способы включают сайтнаправленный мутагенез гена IRS и экспрессию модифицированного гена в подходящих клетках.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, сокращение фосфорилирования сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования по сравнению с фосфорилированием в отсутствие, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора указывает на ингибирующие свойства предполагаемого ингибитора.

Предпочтительно, PKC-ζ получают от млекопитающего, предпочтительно, грызуна или человека, более предпочтительно, крысы или человека.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, пептид IRS получают из IRS, предпочтительно IRS-1, от млекопитающих, предпочтительно человека или грызуна, более предпочтительно, от крысы.

Предпочтительно, IRS-1 получают от крысы, и, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования выбирают из группы, состоящей из Ser 458, 469, 481, 498, 522, 526, 530, 536, 538, 539, 542, 560, 570, 577, 599, 600, 612, 620, 632, 635, 662 и 664, в которой номера в последовательности соответствуют IRS-1 крысы, как отражено в SEQ ID NO:16. Кроме того, IRS-1 можно получать от человека, и, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования выбирают из числа остатков Ser, соответствующих приведенным выше остаткам Ser IRS-1 крысы.

Предпочтительно, сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования в контексте настоящего изобретения может быть выбран из группы, состоящей из Ser⁴⁹⁸, Ser⁵⁷⁰ и Ser⁶¹², более предпочтительно, Ser⁵⁷⁰.

В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, данный пептид представляет собой rIRS^449-664 (SEQ ID NO: 17).

Предпочтительно, ингибитор выбирают из группы, состоящей из связывающих пептидов, антител и низкомолекулярных соединений (LMWs).

Термин "связывающий белок" или "связывающий пептид" обозначает класс белков или пептидов, которые связывают и ингибируют IRS, включая, без ограничения, поликлональные или моноклональные антитела, фрагменты антитела и белковые каркасы, направленные против IRS, например антикалины, которые направлены против IRS.

Процедуру получения антитела или фрагмента антитела выполняют в соответствии со способами, известными специалисту, например, путем иммунизации млекопитающего, например, кролика с помощью IRS, где является уместным в присутствии, например, адъюванта Фрейнда и/или гелей гидроксида алюминия (см., например, Diamond, B.A. et al. (1981) New England Journal of Medicine: 1344-1349). Поликлональные антитела, которые образуются у животных в результате иммунологической реакции, впоследствии можно выделить из крови с применением известных способов и, например, очистить посредством колоночной хроматографии. Моноклональные антитела, например, можно получить в соответствии с известным способом Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).

В соответствии с настоящим изобретением термин антитело или фрагмент антитела также следует понимать как обозначающий антитела или их антиген-связывающие части, которые получили рекомбинантным способом и, где является уместным, модифицировали, такие, как химерные антитела, гуманизированные антитела, многофункциональные антитела, биспецифичные или олигоспецифичные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты F(ab) или F(ab)₂ (см., например, EP-B1-0 368 684, USA 4 816 567, USA 4 816 397, WO 88/01649, WO 93/06213 или WO 98/24884).

В качестве альтернативы классическим антителам также можно, например, использовать белковые каркасы против IRS, например антикалины, которые основаны на липокалине (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Естественные лиганд-связывающие сайты липокалинов, например ретинол-связывающий белок или билин-связывающий белок, можно изменить, например, посредством "комбинаторного белкового дизайна"-подхода, в котором они связываются с выбранными гаптенами, здесь с IRS (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Другие известные белковые каркасы известны в качестве альтернативы к антителам для молекулярного узнавания (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).

LMWs представляют собой молекулы, которые не являются белками, пептидами, антителами или нуклеиновыми кислотами и которые обладают молекулярным весом меньше, чем 5000 Да, предпочтительно, меньше, чем 2000 Да, более предпочтительно, меньше, чем 2000 Да, наиболее предпочтительно, меньше, чем 500 Да. Такие LMWs можно идентифицировать в высокопроизводительных процедурах, начинающихся с библиотек.

Ингибитор может быть в форме естественного экстракта продукта, как в неочищенной, так и в очищенной форме. Экстракт может быть получен в соответствии со стандартными процедурами такими, как экстракция водного и/или спиртового и/или органического растворителя и/или колоночная хроматография и/или осаждение из животного, растительного или микробного источника такого, как змеиный яд, листья или микробные жидкие среды ферментации.

В контексте настоящего изобретения, IRS и PKC-ζ обеспечивают, например, в системе пробы и прямо или косвенно вводят в контакт с тестируемым соединением, в частности, с биохимическим или химическим тестируемым соединением, например, в форме библиотеки химических соединений. Затем измеряют или обнаруживают влияние тестируемого соединения на фосфорилирование IRS. После этого можно анализировать и/или выделять подходящие ингибиторы. Для скрининга библиотек химических соединений, предпочтительно применение высокопроизводительных проб, известных специалисту или которые являются промышленно доступными.

В соответствии с настоящим изобретением, термин "библиотека химических соединений" обозначает множество химических соединений, которые собирали из любого из множества источников, включая химически синтезируемые молекулы и естественные продукты, или которые производили с помощью методик комбинаторной химии.

В целом, влияние тестируемого соединения на взаимодействие измеряют или обнаруживают путем определения степени фосфорилирования пептида IRS. Это можно проделать при использовании фосфор-специфичных антител. Такие антитела известны в уровне техники и доступны, например, от Clonetech, Santa-Cruz и Cellsignal.

В качестве альтернативы, степень фосфорилирования можно измерять с применением радиоактивно меченой АТФ в пробе. АТФ можно метить с помощью 32-P или 33-P, и количество радиоактивного фосфата, включенного в IRS, можно измерять способами, известными в уровне техники (см. примеры 2, 9.). Например, интенсивность сигнала, измеренного с помощью авторадиографии, может указывать на степень фосфорилирования.

Преимущественно способ настоящего изобретения осуществляют в системе робототехники, например, включающей автоматизированную систему высевания на плашки и автоматизированную систему переноса жидкостей, например, с применением микроструйной техники, то есть с канальной структурой.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, способ выполняют в форме высокопроизводительной системы скрининга. Преимущественно в такой системе способ скрининга автоматизирован и выполнен в уменьшенных масштабах, в частности в нем используют уменьшенные лунки и микроструйную технику, которой управляют роботы.

Изобретение дополнительно относится к способу идентификации агониста IRS, предусматривающему этапы

a) введения PKC-ζ в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого агониста, содержащего, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования предполагаемого агониста.

Для этого способа в соответствии с изобретением, в отношении PKC-ζ и IRS применяют те же варианты осуществления, что и для приведенного выше раскрытого способа.

В предпочтительном варианте осуществления, агонист представляет собой пептид. Библиотеки пептидов, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, известны в уровне техники.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного способа изобретения, увеличение степени фосфорилирования сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования агониста по сравнению с фосфорилированием сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования пептида IRS свидетельствует об агонистических свойствах предполагаемого агониста.

Изобретение дополнительно относится к способу определения активности PKC-ζ, предусматривающему этапы

a) введения PKC-ζ в контакт, по меньшей мере, с одним пептидом IRS, содержащим, по меньшей мере, один сайт PKC-ζ-Ser-фосфорилирования в присутствии, по меньшей мере, одного предполагаемого ингибитора, и

b) измерения степени фосфорилирования сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает способ измерения активности PKC-ζ. Такой способ является особенно полезным в случае, если активность PKC-ζ от различных пациентов необходимо измерить для получения большего количества информации о сигнальной системе трансдукции у пациентов, в частности у пациентов с диабетом.

В данном способе изобретения, PKC-ζ получают предпочтительно от млекопитающего, более предпочтительно от человека.

В отношении данного способа изобретения и используемых в нем IRS, применяют то же, что и для другого способа изобретения, раскрытого выше.

Изобретение дополнительно относится к пептиду IRS-1, содержащему Ser⁵⁷⁰, предпочтительно IRS-1^449-664, как показано в SEQ ID NO: 17, или к его человеческому гомологу.

В рамках настоящего изобретения, оказалось, что данный пептид в соответствии с изобретением особенно полезен для идентификации аналогов или ингибиторов IRS.

Изобретение дополнительно обеспечивает набор, содержащий

a) по меньшей мере, один пептид IRS,

b) препарат PKC-ζ и

c) по меньшей мере, один предполагаемый ингибитор или агонист протеинкиназы IRS.

Как уже обсуждалось выше, такой набор чрезвычайно полезен для идентификации ингибиторов протеинкиназы IRS. Его отдельные компоненты уже обсуждались выше.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает пептид IRS-1, в котором Ser⁵⁷⁰ и/или Ser⁶¹² являются мутированными, предпочтительно, с заменой на аланин. Такой пептид полезен для блокировки активности PKC-ζ in vitro или in vivo.

Изобретение дополнительно относится к применению пептида IRS, определенного выше, для получения антител, предпочтительно, против сайта PKC-ζ-Ser-фосфорилирования, предпочтительно, против Ser⁴⁹⁸, Ser⁵⁷⁰ и Ser⁶¹², более предпочтительно, против Ser⁵⁷⁰. Следовательно, с помощью пептидов IRS, определенных в настоящем изобретении, можно получить IRS-специфичные антитела, в частности антитела, направленные против сайтов фосфорилирования PKC-ζ. Такие антитела могут служить как в in vitro диагностиках, так и в фармацевтических композициях.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению пептида IRS, определенного выше, или пептида IRS-1 с мутировавшими Ser-сайтами, определенными выше для получения фармацевтической композиции для лечения диабета типа 2. Такие пептиды могут ингибировать взаимодействие между IRS и PKC-ζ и, следовательно, могут служить антагонистами фосфорилирования IRS.

Для получения фармацевтической композиции ингибиторы или агонисты протеинкиназы IRS, идентифицированные в настоящем изобретении, или пептиды в соответствии с настоящим изобретением обычно составляют с одной или более фармацевтически приемлемой добавкой или вспомогательным веществом таким, как физиологический буферный раствор, например раствор хлорида натрия, деминерализованная вода, стабилизаторы, такие как ингибиторы протеазы или нуклеазы, предпочтительно апротинин, ε-аминокапроновая кислота или пепстатин A или секвестирующие агенты такие, как EDTA, гелевые составы такие, как белый вазелин, парафин с низкой вязкостью и/или желтый воск и т.д. в зависимости от типа введения.

Подходящими дополнительными добавками, например, являются детергенты такие, как, например, Triton X-100 или дезоксихолат натрия, а также полиолы такие, как, например, полиэтиленгликоль или глицерин, сахара такие, как, например, сахароза или глюкоза, цвиттерионные соединения такие, как, например, аминокислоты такие, как глицин или, в особенности, таурин или бетаин и/или белок такой, как, например, сывороточный альбумин быка или человека. Предпочтительными являются детергенты, многоатомные спирты и/или цвиттерионные соединения.

Физиологический буферный раствор предпочтительно имеет pH приблизительно 6,0-8,0, в особенности pH приблизительно 6,8-7,8, в особенности pH приблизительно 7,4, и/или осмолярность приблизительно 200-400 миллиосмоль/литр, предпочтительно приблизительно 290-310 миллиосмоль/литр. pH фармацевтической композиции, в целом, доводят с применением подходящего органического или неорганического буфера, например, предпочтительно с применением фосфатного буфера, трис-буфера (трис(гидроксиметил)аминометана), буфера HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфоновой кислоты) или буфера MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновой кислоты). Выбор соответствующего буфера, в целом, зависит от требуемой молярности буфера. Фосфатный буфер является подходящим, например, для инфузионных растворов и инъекции.

Фармацевтическая композиция может вводиться обычным способом, например, посредством пероральных лекарственных форм таких, как, например, таблетки или капсулы, через слизистые, например носовой или ротовой полости, в форме депозиториев, имплантируемых под кожу, посредством инъекций, вливаний или гелей, которые содержат фармацевтические композиции в соответствии с изобретением. Можно также вводить фармацевтическую композицию местно и локально, если является уместным, в форме липосомных комплексов. Кроме того, лечение можно проводить посредством трансдермальной терапевтической системы (TTS), которая делает возможным управляемое во времени высвобождение фармацевтических композиций. TTS известна, например, из EP 0 944 398 A1, EP 0 916 336 A1, EP 0 889 723 A1 или EP 0 852 493 A1.

В целом, инъекционные растворы используют, если в тело необходимо вводить лишь относительно малые количества раствора или суспензии, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мл. Инфузионные растворы, в целом, используют, если необходимо вводить большее количество раствора или суспензии, например один или более литров. Поскольку, в отличие от инфузионного раствора, в случае инъекционных растворов вводят лишь несколько миллилитров, малые отличия от pH и от осмотического давления крови или тканевой жидкости в инъекции не становятся заметными или становятся заметными лишь в незначительной степени в отношении болевых ощущений. Следовательно, разбавление композиции в соответствии с изобретением перед применением, в целом, не является необходимым. Однако в случае введения относительно больших количеств, композицию в соответствии с изобретением следует быстро разбавить перед введением до такой степени, чтобы получить, по меньшей мере, приблизительно изотонический раствор. Примером изотонического раствора является раствор хлорида натрия с концентрацией 0,9%. В случае вливания, разбавление можно выполнять, например, с применением стерилизованной воды, в то время как введение можно выполнять, например, посредством так называемого искусственного кровообращения.

Изобретение дополнительно относится к способу получения фармацевтической композиции, предусматривающему этапы:

a) идентификации ингибитора или агониста протеинкиназы IRS, определенного выше,

b) обеспечения адекватных количеств ингибитора протеинкиназы IRS и

c) составления фармацевтической композиции с ингибитором протеинкиназы IRS, необязательно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение дополнительно описано следующими примерами и чертежами, которые, как подразумевается, не ограничивают объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

МАТЕРИАЛЫ

Олигонуклеотидные праймеры были получены от MWG-Biotech (Ebersberg, Germany). BL21 Codon Plus и набор сайт-направленного мутагенеза QuikChange™ были закуплены в Stratagene (La Jolla, CA, USA). Компетентные клетки One Shot TOP 10 были от Invitrogen (Karlsruhe, Germany). Набор плазмид miniprep был получен от Qiagen (Hilden, Germany). Поликлональная anti-IRS-1 иммунная сыворотка была подарена доктором Dr. J. A. Maassen (Leiden, The Netherlands). Анти-фосфотирозиновое антитело (RC20), связанное с пероксидазой хрена, и anti-p85α антитело было получено от Transduction Laboratories, Inc (Lexington, KY, USA). Моноклональное anti-IRb антитело поставлялось от Oncogene (Cambridge, MA, USA). Anti-IRS-1 pS616 антитело было от Biosource (Camarillo, CA, USA). Детекция HRP-конъюгированного антитела IgG анти-кролик и анти-мышь в качестве вторичного антитела для усиленной хемилюминесценции (ECL) была от Promega Corp. (Mannheim, Germany). Протеинкиназа C из мозга крысы (PKC-rb), рекомбинантная протеинкиназа C-ζ человека, бисиндолилмалеимид I (BIM) и ингибитор псевдосубстрата PKC-ζ были получены от Calbiochem (San Diego, CA, USA). Альфа Тромбин был куплен в Upstate Biotechnology Inc (Lake Placid, NY, USA). Ферменты для молекулярной биологии, полная смесь ингибиторов протеаз и модифицированный трипсин марки секвенирования были получены от Roche (Mannheim, Germany). Окадаиновая кислота, фосфатидилсерин и агглютинин зародыша пшеницы (Triticum vulgaris) были куплены в SIGMA (München, Germany). Пептиды IRS-1 синтезировал доктор Hoffmann (BMFZ, University of Düsseldorf, Düsseldorf, Germany). Химические вещества для SDS-PAGE, вектор pGEX-5X-3 слияния генов GST, глютатионовая Sepharose® 4B и [γ-³²P]АТФ были закуплены в Amersham Biosciences (Freiburg, Germany). Реактив синего красителя GelCode, очищающий буфер Restore™ для Вестерн-блоттинга и субстрат SuperSignal были получены от Pierce (Rockford, USA). Biacore X и сенсорный чип CM5 являются продуктами Biacore (Freiburg, Germany). Все другие химические вещества были высшей коммерчески доступной марки.

Пример 2

СПОСОБЫ

1. Конструирование и экспрессия составных белков

Регуляторная субъединица p85α PI 3-киназы быка, клонированная в вектор экспрессии pGEX-2T, была любезным подарком доктора P. Shepherd (London, UK). Составной белок глютатионовой S-трансферазы (GST), содержащий аминокислоты 449-664 из IRS-1 крысы (rIRS-1^449-664, M_w 51,2 кДа), получили на основании способа, описанного Smith и Johnson (40) с применением вектора pGEX-5X-3. Соответствующую кДНК крысы получили из РНК, выделенной из сердца крысы с помощью обратной транскрипции с применением обратной транскриптазы птичьего вируса миелобластоза и последующей амплификации путем полимеразной цепной реакции с применением Pwo ДНК полимеразы и следующих олигонуклеотидных праймеров: 5'-праймер, ATATTGTCGACCAC-ACCCCACCAGCCAGG, 3'-праймер, ATGTACTACTACAGAGGGTC-ACGCCGGCGTAAGAATA (SEQ ID NO: 1 и 2). Продукты PCR выделяли, расщепляли подходящими ферментами рестрикции и субклонировали в pGEX-5X-3. Идентичность клона IRS-1 крысы проверяли путем анализа эндонуклеазы рестрикции и секвенирования нуклеотидов. Данный вектор и конструкцию p85α-pGEX-2T использовали для трансформации Escherichia coli BL21. Трансформированные клетки выращивали до значения A_{600 нм} 0,6-0,8 в 2x среде YTA (16 г/л триптон, 10 г/л дрожжей, NaCl 5 г/л) с добавкой 0,1 мг/мл ампициллина и индуцировали в течение 2 часов 0,1 мМ изопропил-b-D-тиогалактозидом (IPTG). Составные белки очищали с помощью афинной хроматографии на колонках глютатионовой сефарозы и элюировали 10 мМ глютатионом в 50 мМ трис-HCl (pH 8,0). GST часть p85α GST - составного белка протеолитически удаляли с применением бычьего тромбина в PBS. Протеазу добавляли к составному белку, связанному с колонкой глютатионовой сефарозы, культивировали в течение 2 часов при комнатной температуре, и затем собирали элюат. Белок определяли с применением модификации пробы белка Bio-Rad. Все составные белки GST обладали ожидаемым молекулярным весом при анализе электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) с додецилсульфатом натрия (SDS).

2. Приготовление киназы инсулинового рецептора

Печень крысы быстро удалили, сразу заморозили в жидком азоте и обработали, как описано (41). Вкратце, добавили 3,5 об./вес. ледяного буфера, состоящего из 50 мМ Hepes (pH 7,4), 1% Triton X-100 и 2x полных ингибиторов протеаз и гомогенизировали печень с применением Ultraturrax и гомогенизатора Potter-Elvehjem с последующим центрифугированием при 10 000 x g в течение 10 минут при 4°C. Получающийся супернатант медленно перемешивали при комнатной температуре в течение 60 минут, затем снова центрифугировали при 100 000 x g в течение 90 минут при 4°C. Затем супернатант вносили в колонку со связанным с агарозой агглютинином зародыша пшеницы (WGA). Колонку промывали 50 мМ Hepes (pH 7,4), 0,1% Triton X-100 и связанные гликопротеиды элюировали из колонки WGA данным буфером, содержащим 0,3 М N-ацетилглюкозамина.

3. Проба фосфорилирования in vitro

Для фосфорилирования rIRS-1^449-664 инсулиновым рецептором, 5 мкг WGA-очищенной фракции гликопротеида предварительно выдерживали в течение 30 минут при 30°C с 100 нМ инсулином в буфере фосфорилирования, содержащем 20 мМ Hepes (pH 7,4), 1 мМ DTT,10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина,0,2 мМ Na₃VO₄,1,7 мМ CaCl₂, 0,6 мг/мл фосфатидилсерина и 0,5 мкг/мкл окадаиновой кислоты. Автофосфорилирование инициировали добавлением АТФ при концентрации 50 мкМ и продолжали в течение 10 минут при 30°C. Фосфорилирование субстрата инициировали добавлением равных объемов rIRS-1^449-669 (1 мкг) с предварительной обработкой (30 минут) изоформами PKC или без них в том же буфере в присутствии 50 мкМ АТФ и давали ему протекать в течение 10 минут при 30°C в конечном объеме 50 мкл. Реакцию завершали добавлением 6x буфера для образца (0,35 М трис-HCl (pH 6,8), 10,28% (вес./об.) SDS, 36% (об./об.) глицерина; 0,6 М DTT, 0,012% (вес./об.) бромфенола синего) и кипятили в течение 5 мин. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали с помощью иммунодетекции антифосфотирозиновым антителом после переноса на нитроцеллюлозу. Серин/треониновое фосфорилирование rIRS-1^449-664 различными изоформами PKC оценивали путем выдерживания 1 мкг rIRS-1^449-664 с 0,5 мкг PKC-rb или PKC-ζ в буфере фосфорилирования в течение 30 минут при 30°C в присутствии 50 мкМ АТФ плюс 2 мкКи [g-³²P]АТФ в объеме 20 мкл. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE, окрашенные, и высушенные гели подвергали авторадиографии. Степень включения фосфата определяли путем измерения рассеченных фрагментов счетчиком Черенкова.

4. Проба разъединения GST

In vitro фосфорилированный rIRS-1^449-664 выдерживали с гранулами глютатионовой сефарозы во вращательном устройстве в течение 1 часа при 4°C. Гранулы промывали три раза буфером связывания (50 мМ трис (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1% (об./об.) Nonidet P-40, 1 мМ EDTA, 1 мМ NaF,Na₃VO₄ 1 мМ). Затем добавляли 0,5 мкг рекомбинантных p85α и обработку продолжали в течение 2 часов при 4°C. После трехкратного промывания связанные белки элюировали 20 мкл 2x буфера для образца и разделяли с помощью SDS-PAGE.

5. Иммуноблоттинг

Белки разделяли с помощью SDS-PAGE с применением гелей с градиентом 8-18%, с последующим переносом на нитроцеллюлозу в полусухом приборе блоттинга. Затем мембрану блокировали в течение 60 минут в трис-забуференном солевом растворе, содержащем 0,05% Tween 20 и 1% BSA или 5% нежирное сухое молоко, и исследовали с применением подходящих антител (anti-IRS-1, anti-pTyr, anti-p85α). После обширного промывания мембраны выдерживали со вторичными антителами, сопряженными с пероксидазой хрена, снова промывали, и затем полосы белков визуализировали с помощью способа усиленной хемилюминесценции (ECL) на рабочей станции LumiImager (Boehringer, Mannheim, Germany). Все пятна подвергали количественному анализу с применением программного обеспечения LumiImager. Значение представленных разностей оценивали с применением нулевой гипотезы и t-статистики для непарных данных. Предполагалось, что значение p меньше 0,05 являлось статистически значимым.

6. Картирование фосфопептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и масс-спектрометрии электрораспылительной ионизации (ESI-MS)

С применением 50 ед. (40 мкг) PKC-ζ, фосфорилировали 5 нмоль белка rIRS-1^449-664 с помощью 50 мкМ АТФ плюс 0,25 мКи/мл [γ-³²P] АТФ в течение 60 минут при условиях, описанных выше. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и фосфорилированный rIRS-1^449-664 расщепляли с помощью 100 мкг трипсина в отделенных частях геля в течение ночи при 30°C. Пептиды элюировали 50 мМ NH₄HCO₃, 50% ацетонитрилом и разделяли на анионообменной колонне (Nucleogel SAX 1000-8/46, 50 x 4,6 мм, Macherey & Nagel, Düren, Germany) с применением системы доставки растворителя Beckman gold. Скорость потока HPLC составляла 0,5 мл/мин. После инжекции образца, пептиды элюировали, начиная со 100% буфера A (20 мМ NH₄CH₃COOH, pH 7,0) и 0% буфера B (1 М KH₂PO₄, pH 4,0). Количество буфера B увеличивали до 10% в течение 40 минут и от 10 до 50% в течение следующих 75 мин. Собирали 0,5 мл фракции и измеряли радиоактивность с помощью счетчика Черенкова. Радиоактивные фракции подвергали обратнофазной HPLC. Пептиды разделяли на C18 обратнофазной колонке (Nucleosil 300-5 C18, 250 мм x 2 мм, размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Å, Macherey & Nagel, Düren, Germany). Скорость потока HPLC доводили до 0,33 мл/мин. После внесения образца элюцию начинали со 100% раствора А (0,1% TFA) и 0% раствора B (ацетонитрил/TFA (84/0,1; об./об.)). Долю раствора B увеличивали до 100% в течение 120 мин. Радиоактивность собранных фракций повторно измеряли. Фракции, содержащие радиоактивно меченые пептиды, подвергали масс-спектрометрии ESI TOF. Масс-спектры регистрировали на электрораспылительном квадрупольном времяпролетном масс-спектрометре (QSTAR Pulsar I, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), с применением nanospray-источника (Protana, Odense, Denmark). Выбранные пептиды анализировали в режиме тандемной масс-спектрометрии и последовательность и посттрансляционные модификации находили путем ручной интерпретации.

7. Сайт-направленный мутагенез

Мутантов rIRS-1^449-664 с заменой серина 570 на аланин и серина 612 на аланин получали путем сайт-направленного мутагенеза с применением набора сайт-направленного мутагенеза QuikChange™ в соответствии с инструкциями фирмы - производителя с применением pGEX-5X-3/rIRS-1^449-664 в качестве матрицы. Использовали следующие праймеры: С570А,

5'-CCCGGCTACCGGCATGCCGCCTTCGTGCCCACC (SEQ ID NO:3) и

3'-GGGCCGATGGCCGTACGGCGGAAGCACGGGTGG (SEQ ID NO:4); S612A,

5'-GGCTACATGCCCATGGCTCCCGGAGTGGCTCC (SEQ ID NO:5) и

3'-CCGATGTACGGGTACCGAGGGCCTCACCGAGG (SEQ ID NO:6).

Наличие требуемых мутаций было подтверждено секвенированием рекомбинантных молекул с помощью Qiagen Sequencing Services (Hilden, Germany).

8. Изучение взаимодействия с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса

Принцип действия биосенсора BIAcore™ (Biacore, Freiburg, Germany) был предварительно описан (42). Во избежание мешающей димеризации GST-части составного белка, его расщепили с помощью тромбина в ходе очистки. В силу известной чрезвычайно высокой скорости связывания SH2-доменов с фосфопептидами, относительные степени сродства оценивали с помощью пробы конкуренции (43). В связи с этим, p85α с постоянной к