Способ инактивации микроорганизмов биоцидами (варианты)

Способ инактивации микроорганизмов биоцидами (варианты)

Реферат

Изобретение относится к инактивации патогенных микроорганизмов с использованием растворимых биоцидов и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, а также для подавления грибов, вызывающих деструкцию промышленных материалов и инженерных сооружений, и в других отраслях, в которых необходимо применять специальные меры для предотвращения развития патогенных микроорганизмов.

В настоящее время в различных отраслях техники с целью уничтожения патогенных микроорганизмов широко используются водорастворимые биоцидные препараты, которые, как правило, являются синтезированными химическими веществами. В медицине водорастворимые биоциды используются в качестве антисептических, бактерицидных и дезинфицирующих средств, в пищевой промышленности они применяются при консервировании, в сельском хозяйстве биоцидные препараты (бактерициды, фунгициды, инсектициды) применяются для обработки почвы и растений. Препараты с фунгицидными свойствами широко применяются для защиты промышленных материалов и сооружений от патогенных грибов, которые в процессе своей жизнедеятельности вызывают деструкцию материалов и конструкций и являются источниками токсинов, наличие которых в воздухе приводит к ухудшению экологической обстановки в помещениях и к риску серьезных заболеваний людей, находящихся в этих помещениях.

Использование синтетических биоцидов приводит к ухудшению экологической ситуации при проведении мероприятий по инактивации и при эксплуатации обработанных помещений, поскольку биоциды могут выступать в роли экзотоксикантов по отношению к организму человека. Кроме того, инактивация промышленных материалов химическими соединениями практически недопустима в условиях производств, сопряженных с повышенными требованиями химической чистоты (биотехнология, фармакология, тонкий органический синтез и т.п.).

Известен способ инактивации микроорганизмов с использованием малых нетоксичных концентраций химических препаратов. Этот способ (например, RU 2230110, 2004.06.10) включает сначала обработку среды обитания микроорганизмов веществами с фотосенсибилизирующими свойствами, а затем - облучение среды электромагнитным излучением оптического диапазона (4×10⁵-7×10⁵ ГГц). Механизм биоцидного действия в этом случае связан с тем, что в микрорганизмах существуют клетки, способные селективно накапливать и некоторое время удерживать некоторые светопоглощающие вещества, которые под действием электромагнитного излучения стимулируют развитие в клетках-мишенях высокотоксических фотохимических превращений, вызывающих гибель клеток.

Широко известна инактивация патогенных микроорганизмов без применения биоцидов путем облучения среды обитания микроорганизмов электромагнитным излучением ультрафиолетового диапазона (например, RU 2270696 С2, 2006.02.27). Однако, как показывает практика, ежедневное ультрафиолетовое облучение в лечебных учреждениях не снимает остроты проблемы внутрибольничных инфекций, обусловленных наличием патогенных грибов и бактерий, при этом отмечено, что многие виды грибов отличаются большей адаптивностью к жесткому излучению, нежели бактерии. Известно также, что в стерильных боксах удается сдерживать рост бактериальной микрофлоры, однако постоянно возникает проблема пророста грибов на питательных средах.

Основным недостатком, общим для всех известных способов, является снижение эффективности защиты из-за мутагенеза и адаптация микроорганизмов к используемым средствам, которая может проявляться в форме так называемой множественной лекарственной устойчивости (multi-drug resistance), выражающейся в удалении из клеток микроорганизмов токсичных для них веществ. Обработка популяции микроорганизмов химическими препаратами и электромагнитным излучением оптического диапазона индуцирует появление все новых мутантных штаммов с непредсказуемыми свойствами. Мутантные штаммы могут проявлять патогенность и агрессивность в отношении среды их обитания (кожа и слизистые человека, материалы технических сооружений и т.п.), а также устойчивость к химическим и физическим факторам.

Ближайшим аналогом заявляемого способа выбран способ, основанный на использовании в качестве биоцида природного нетоксичного соединения - бишофита, обладающего слабыми бактерицидными свойствами. Способ включает активацию магнитным полем растворенного в воде бишофита и обработку среды обитания патогенных микроорганизмов активированным раствором (RU 2243659 С1, 2005.10.01). Эффект применения этого способа связан с тем, что активированный магнитным полем раствор бишофита приобретает адгезиционные свойства и хорошую смачиваемость обрабатываемой им поверхности, что и определяет узкую область его использования - защиту растений от патогенных микроорганизмов.

Недостатки способа обусловлены слабыми биоцидными свойствами бишофита.

Основной технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является разработка способа инактивации патогенных микроорганизмов высокой эффективности, не влияющего на состояние экологической обстановки.

Другой основной технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является разработка высокоэффективного способа с применением биоцидов в малых дозах.

Заявляемый первый вариант способа инактивации микроорганизмов путем воздействия на среду обитания микроорганизмов раствором биоцида, который предварительно активизируют, характеризуется тем, что раствор биоцида активизируют электромагнитным излучением КВЧ диапазона путем облучения элетромагнитным излучением в течение 20-60 секунд, используют облученный раствор биоцида для обработки среды обитания микроорганизмов.

Целесообразно использовать электромагнитное излучение в диапазоне частот 52-78 ГГц с плотностью потока мощности 0,1-1,0 мкВт/см².

Целесообразно электромагнитное излучение модулировать импульсами с частотой повторения 0,1-20 Гц.

Второй вариант способа инактивации микроорганизмов путем воздействия на среду обитания микроорганизмов раствором биоцида, который предварительно активизируют, характеризуется тем, что раствор биоцида активизируют электромагнитным излучением КВЧ диапазона, при этом сначала раствор биоцида облучают элетромагнитным излучением в течение 20-60 секунд и одновременно принимают отраженное от раствора биоцида электромагнитное излучение, затем принятым излучением снова облучают раствор биоцида в течение 5-20 минут и используют раствор биоцида для обработки среды обитания микроорганизмов.

Целесообразно использовать электромагнитное излучение в диапазоне частот 52-78 ГГц с плотностью потока мощности 0,1-1,0 мкВт/см².

Целесообразно электромагнитное излучение модулировать импульсами с частотой повторения 0,1-20 Гц.

В основе изобретения лежат экспериментальные исследования.

Эксперименты проводились с целью изучения влияния мономерных и полимерных биоцидов на грибы Penicillium chrysogenum, Alternaria alternata, Trichoderma viride, Fusarium moniliforme, которые являются представителями таксономических групп, включающих в себя основные агенты микологических биоповреждений, а также на грамотрицательные бактерии Escherichia coli, на грамположительные бактерии Staphylococcus aureus.

При проведении экспериментов в соответствии с первым вариантом способа водный раствор биоцида активировали облучением электромагнитным излучением в диапазоне частот 52-78 ГГц. Активированный водный раствор биоцида использовали для определения степени инактивации грибов и бактерий.

При проведении экспериментов в соответствии со вторым вариантом способа водный раствор биоцида активировали облучением электромагнитным излучением в диапазоне частот 52-78 ГГц и одновременно принимали отраженное от раствора биоцида электромагнитное излучение, затем принятым излучением снова облучали раствор биоцида, после чего использовали раствор биоцида для определения степени инактивации грибов и бактерий.

В экспериментах использовали источник КВЧ электромагнитного излучения с плотностью потока мощности 0,1-1,0 мкВт/см² с частотой модуляции электромагнитного излучения в пределах 0,1-20 Гц. Время облучения растворенного биоцида излучением, формируемым источником, выбирали из диапазона 20-60 секунд. Прием отраженного от раствора биоцида излучения осуществляли одновременно с облучением его в течение 20-60 секунд. Облучение раствора биоцида принятым излучением в соответствии со вторым вариантом способа проводили в течение 5-20 минут.

Техническая реализация способа определяется имеющимися в настоящее время калиброванными приборами, позволяющими формировать и принимать излучение низкой интенсивности. Используемый в экспериментах прибор содержит в качестве активного элемента генератор излучения и в качестве приемника излучения диод Ганна (см., например, М.Е.Левинштейн, Ю.К.Пожела, М.С.Шур. Эффект Ганна. М., «Советское Радио», 1975 г., 288 с.). Отсутствие надежной технической базы не позволило провести эксперименты с электромагнитным излучением с другими частотными параметрами.

Как показали эксперименты, эффективность инактивации микроорганизмов в приведенных частотных и временных диапазонах меняется незначительно, поэтому в приведенных ниже таблицах, иллюстрирующих эффективность заявляемых вариантов способа, приведены результаты исследований при облучении раствора биоцида электромагнитным излучением, модулированным частотой 10 Гц, в течение 50 сек. Соответственно для второго варианта способа в течение 50 сек принимали излучение, отраженное от раствора биоцида, а время облучения раствора биоцида принятым отраженным сигналом составляло 15 минут.

При проведении экспериментов с грибами в качестве растворимых биоцидов с фунгицидными свойствами использовались «БК-1» («Бакцид») ТУ 2484-010-05744685-96 (тример на основе этаноламина), антисептик для пропитки древесины «Асан» ТУ 2482-76662755-2005 (действующее вещество - производное катамина - относится к классу четвертичных аммониевых соединений), дезинфектант «Тефлекс» на основе полигексаметиленгуанидина гидрохлорида.

Испытания на фунгицидность проводили согласно ГОСТ 9.049-91 (по методу 3). Готовят среду Чапека-Докса с агаром, разливают ее в чашки Петри в количестве 20-30 см³ и дают ей застыть. В центре чашки Петри помещают стеклянный цилиндр диаметром 10 мм, в который наливается испытуемый раствор. Поверхность питательной среды заражают водной суспензией грибов путем равномерного нанесения ее с помощью пульверизатора, не допуская слияния капель. Количество спор грибов в 1 мл суспензии составляет 1-2 млн. Контрольные чашки и чашки с исследуемыми образцами помещают в термостат. Испытания проводят при температуре 28±2°С и относительной влажности воздуха более 90%. Продолжительность испытаний с момента установления режима - 14 суток. По окончании испытаний чашки Петри извлекают из термостата, осматривают невооруженным глазом и проводят оценку фунгицидных свойств. О наличии фунгицидных свойств судят но наличию ингибиторной зоны вокруг образца: на питательной среде наблюдается зона отсутствия роста грибов.

Результаты испытаний на фунгицидность водного раствора «Асан» в соответствии с первым вариантом способа приведены в таблице 1 (n - количество повторностей).

Таблица 1
Вид гриба	Используемый биоцид	Ингибиторная зона (радиус в мм)
контроль	опыт	% к контролю
1	2	3	4	5
Alternaria alternata	«Асан» (концентрация 6,5%)	13.3±1.5, n=6	16.3±2.5, n=6	123
Fusarium moniliforme	«Асан» (концентрация 6,5%)	6.2±1.6, n=6	9.0±1.5, n=6	145
Penicillium chrysogenum	«Асан» (концентрация 6,5%)	5.4±1.8, n=6	9.3±2.7, n=6	172

Испытания показывают повышение биоцидного эффекта при использовании первого варианта способа, однако эффективность первого варианта способа ниже эффективности при использовании второго варианта способа, что иллюстрируется полученными результатами, приведенными ниже в таблице 2.

В таблице 2 отражены результаты испытаний на фунгицидность водных растворов «БК-1», «Тефлекс» и «Асан» различных концентраций в соответствии со вторым вариантом способа (n - количество повторностей).

Таблица 2
Вид гриба	Используемый биоцид	Ингибиторная зона (радиус в мм)
контроль	опыт	% к контролю
1	2	3	4	5
Alternaria alternata	«БК-1» (концентрация 0,5%)	2.3±1.5, n=6	9.0±2.8, n=6	391
Alternaria alternata	«БК-1» (концентрация 10%)	14.2±0.8, n=6	31.0±1.2, n=6	218
Alternaria alternata	«БК-1» (концентрация 30%)	23.4±4, n=6	31.0±3, n=6	132
Alternaria alternata	«БК-1» (концентрация 70%)	26.3±3.2, n=6	33.6±2.2, n=6	128
Alternaria alternata	«БК-1» (концентрация 100%)	30.0±0.5, n=6	35.0±0.5, n=6	117
Penicillium chrysogenum	«БК-1» (концентрация 0,5%)	2.0±1.4, n=6	6.3±3.2, n=6	315
Penicillium chrysogenum	«БК-1» (концентрация 10%)	12.4±2.2, n=6	14.0±1.6, n=6	113
Penicillium chrysogenum	«БК-1» (концентрация 30%)	14.0±2.2, n=6	15.6±2.5, n=6	111
Penicillium chrysogenum	«БК-1» (концентрация 70%)	14.4±3.5, n=6	19.2±2.9, n=6	133

Таблица 2 (продолжение)
Вид гриба	Используемый биоцид	Ингибиторная зона (радиус в мм)
контроль	опыт	% к контролю
1	2	3	4	5
Penicillium chrysogenum	«БК-1» (исходный препарат)	26.0±0.5, n=6	35.0±0.5, n=6	135
Fusarium moniliforme	«БК-1» (исходный препарат)	19.8±3.6, n=6	21.7±2.5, n=6	110
Alternaria alternata	«Асан» (концентрация 6,5%)	19.0±4.4, n=6	23.3±1.9, n=6	123
Fusarium moniliforme	«Асан» (концентрация 6,5%)	4.0±2.2, n=6	8.8±2.2, n=6	220
Penicillium chrysogenum	«Асан» (концентрация 6,5%)	6.8±1.8, n=6	12.8±1.3, n=6	188
Alternaria alternata	«Тефлекс» (концентрация 10,0%)	13.0±3.5, n=6	15.7±4.2, n=6	121
Fusarium moniliforme	«Тефлекс» (концентрация 10,0%)	5.2±1.8, n=6	7.5±3.0, n=6	144
Penicillium chrysogenum	«Тефлекс» (концентрация 10,0%)	8.7±3.2, n=6	12.2±2.1, n=6	140

Эксперименты показывают повышение биоцидного эффекта при использовании различных концентраций биоцидов в растворе (от 0,5% и выше). Однако наибольшая активность проявляется при малых концентрациях (0,5%), т.е. использование электромагнитного излучения с указанными параметрами вызывает повышение биологической активности веществ со свойствами, влияющими на жизнедеятельность микроорганизмов.

При проведении экспериментов с бактериями Staphylococcus aureus и Escherichia coli использовался водорастворимый дезинфектант «Лесептик».

Испытания на бактерицидность проводили в соответствии со вторым способом следующим образом. На поверхность питательной среды засевали культуры бактерий сплошным газоном, посев производили стерильным шпателем. Мутность бактериальной суспензии соответствовала 1 единице стандарта эталона мутности. Контрольные чашки Петри и чашки с исследуемыми образцами помещали в термостат. Испытания проводили при температуре 37±2°С. Продолжительность испытаний с момента установления температурного режима - 24 часа. По окончании испытаний чашки Петри извлекали из термостата, осматривали и проводили оценку бактерицидных свойств материала. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводили стандартным диско-диффузионным методом.

Результаты испытаний приведены в таблице 3 (n - количество повторностей).

Таблица 3
Вид бактерий	Используемый биоцид	Ингибиторная зона (радиус в мм)
контроль	опыт	% к контролю
Staphylococcus aureus	Лесептик (концентрация 0,1%)	13.7±1.08, n=6	17.0±0.5, n=6	124
Escherichia coli	Лесептик (концентрация 0,1%)	6.3±1.2, n=6	6.7±1.2, n=6	106

Полученные данные позволяют утверждать, что заявляемый способ повышает биоцидную активность водных растворов антимикробных препаратов.

Результаты, полученные при проведении экспериментов по изменению биоцидного действия растворимых препаратов под воздействием КВЧ излучения малой интенсивности, в настоящее время не нашли теоретического обоснования. Особенно неожиданным является повышение эффективности биоцидов при их малых концентрациях в растворе, что позволяет существенно снизить дозы применяемых препаратов и тем самым способствует улучшению экологической ситуации в зоне применения биоцидных препаратов.

Устойчивое повторение результатов экспериментов дает уверенность в применимости заявленных способов для эффективной инактивации различных патогенных и вредных микроорганизмов без ухудшения экологической ситуации в зоне использования биоцидов.

Изобретение может быть использовано для инактивации патогенных и вредных микроорганизмов в медицине и пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, а также для подавления грибов, вызывающих деструкцию промышленных материалов и инженерных сооружений.

1. Способ инактивации микроорганизмов путем воздействия раствором биоцида, который предварительно активизируют, отличающийся тем, что раствор биоцида активизируют электромагнитным излучением КВЧ-диапазона путем облучения электромагнитным излучением в течение 20-60 с, используют облученный раствор биоцида для обработки среды обитания микроорганизмов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют электромагнитное излучение в диапазоне частот 52-78 ГГц с плотностью потока мощности 0,1-1,0 мкВт/см².

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют электромагнитное излучение, модулированное импульсами с частотой повторения 0,1-20 Гц.

4. Способ инактивации микроорганизмов путем воздействия раствором биоцида, который предварительно активизируют, отличающийся тем, что биоцид активизируют электромагнитным излучением КВЧ-диапазона, при этом сначала раствор биоцида облучают электромагнитным излучением в течение 20-60 с и одновременно принимают отраженное от раствора биоцида электромагнитное излучение, затем принятым излучением снова облучают раствор биоцида в течение 5-20 мин и используют раствор биоцида для обработки среды обитания микроорганизмов.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют электромагнитное излучение в диапазоне частот 52-78 ГГц с плотностью потока мощности 0,1-1,0 мкВт/см².

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют электромагнитное излучение, модулированное импульсами с частотой повторения 0,1-20 Гц.